Artículo de Investigación
Recepción: 20 Noviembre 2020
Aprobación: 09 Diciembre 2020
Resumen: Introducción. Las múltiples y desconocidas características del coronavirus 2019-nCoV causante del síndrome respiratorio agudo y de millones de muertes en todo el mundo impulsó al desarrollo rápido de técnicas y kits de diagnóstico de laboratorio basados en la amplificación de secuencias virales o en la determinación de anticuerpos en sangre, sin embargo, tras su aplicación se generaron desacuerdos entre el resultado con la verdadera positividad o negatividad de la enfermedad. Objetivo. A través de la siguiente revisión se busca caracterizar y valorar el uso de las técnicas moleculares y serológicas, en función de factores como la sensibilidad y especificidad, tipo de espécimen y blanco de detección. Metodología. Se emplearon las bases de datos Scopus y Web of Since obteniéndose 136 artículos de los cuales 25 cumplieron los criterios de inclusión como el desarrollo, validación clínica y estandarización de la técnica, así como nuevas metodologías propuestas. Resultados. 17 elementos corresponden al diagnóstico de SARS-CoV-2 por técnicas moleculares y 8 por técnicas serológicas. El mayor número de publicaciones halladas provienen de China (5) y Estados Unidos (4), países de Europa (8) y Asia (6) mientras que, en América Latina se encontraron publicaciones procedentes de Brasil (1) y Ecuador (1). Conclusión. En relación a lo expuesto los ensayos moleculares destacan en su alta sensibilidad y especificidad y son usadas en cualquier etapa de la enfermedad. Las pruebas serológicas por su parte se recomiendan como complemento a las pruebas moleculares así como para monitoreo de la enfermedad en lugar de único marcador diagnóstico.
Palabras clave: SARS-CoV2, Diagnóstico molecular, diagnostico serológico, sensibilidad, especificidad.
Abstract: Introduction . The multiple and unknown characteristics of coronavirus 2019-nCoV causing acute respiratory syndrome and millions of deaths worldwide prompted the rapid development of laboratory diagnostic techniques and kits based on the amplification of viral sequences or the determination of antibodies in blood, however, after their application disagreements were generated between the result with the true positivity or negativity of the disease. Objective. The following review seeks to characterize and evaluate the use of molecular and serological techniques, according to factors such as sensitivity and specificity, type of specimen and detection target. Methodology. The Scopus and Web of Since databases were used, obtaining 136 articles of which 25 met the inclusion criteria such as development, clinical validation and standardization of the technique, as well as new proposed methodologies. Results. 17 items correspond to the diagnosis of SARS-CoV-2 by molecular techniques and 8 by serological techniques. The greatest number of publications found came from China (5) and the United States (4), European countries (8) and Asia (6) while, in Latin America, publications were found from Brazil (1) and Ecuador (1). Conclusions. In relation to the above, molecular assays stand out for their high sensitivity and specificity and are used at any stage of the disease. Serological tests are recommended as a complement to molecular tests as well as for disease monitoring instead of being the only diagnostic marker..
Keywords: SARS-CoV2, Molecular diagnosis, serological diagnosis, sensitivity, specificity.
Resumo: Introdução. As características múltiplas e desconhecidas do coronavírus 2019-nCoV, causando síndrome respiratória aguda e milhões de mortes em todo o mundo, levaram ao rápido desenvolvimento de técnicas e kits de diagnóstico laboratorial baseados na amplificação de sequências virais ou na determinação de anticorpos no sangue, porém, após sua aplicação foram geradas discordâncias entre o resultado com a verdadeira positividade ou negatividade da doença. Objetivo. A revisão a seguir visa caracterizar e avaliar o uso de técnicas moleculares e serológicas, dependendo de fatores como sensibilidade e especificidade, tipo de espécime e alvo de detecção. Metodologia. Scopus e Web of Since foram utilizados, obtendo 136 artigos dos quais 25 preenchiam os critérios de inclusão, como desenvolvimento, validação clínica e padronização da técnica, assim como novas metodologias propostas. Resultados. 17 itens correspondem ao diagnóstico do SARS-CoV-2 por técnicas moleculares e 8 por técnicas serológicas. O maior número de publicações encontradas veio da China (5) e dos Estados Unidos (4), países europeus (8) e da Ásia (6) enquanto, na América Latina, foram encontradas publicações do Brasil (1) e do Equador (1). Conclusões. Em relação ao acima exposto, os ensaios moleculares se destacam por sua alta sensibilidade e especificidade e são utilizados em qualquer estágio da doença. Os testes serológicos são recomendados como um complemento aos testes moleculares, bem como para o monitoramento de doenças, em vez de serem o único marcador de diagnóstico.
Palavras-chave: SARS-CoV2, diagnóstico molecular, diagnóstico sorológico, sensibilidade, especificidade.
INTRODUCCIÓN
Através del siglo XXI se han descrito diferentes brotes de Coronavirus.
El primero en noviembre de 2002 en Guangdong- China, llamado Síndrome Respiratorio Agudo, causado por el Coronavirus (SARS-CoV), con un rango de mortalidad del 10%. En Jeddah, Arabia Saudita y Medio Oriente emerge un nuevo tipo de Coronavirus atribuyendo precisamente el nombre de Síndrome Respiratorio Agudo del Medio Oriente causado por (MERS-CoV) en enero de 2012 el cual mostró una tasa de mortalidad de 37% (1). Finalmente el actual coronavirus 2019-nCoV con características clínicas del mismo orden que los anteriores denominado Síndrome Respiratorio Agudo causado por el coronavirus tipo 2 (SARS- CoV-2) cuya primera detección fue en Wuhan, China en diciembre de 2019, causante de neumonía y oficialmente conocida como la COVID-19 según la Organización Mundial de la Salud (OMS) (2).
El nuevo coronavirus 2019-nCoV es el séptimo miembro de la familia de coronavirus que infectan a los humanos, su secuencia se obtuvo a partir de muestras de los primeros grupos de pacientes con neumonía de origen desconocido del Hospital Jinyintan de Wuhan. En este contexto se emplearon células epiteliales de vías respiratorias humanas; logrando clasificarlo en el subgénero sarbecovirus y subfamilia Orthocoronavirinae (3).
La PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) es una técnica que hace posible la amplificación del Ácido Desoxirribonucleico (ADN) además de la detección simultánea del producto de amplificación y la cuantificación del material genético en una muestra. La técnica fue creada por Kary Mullis, es un proceso cíclico que amplifica exponencialmente pequeñas cantidades de ADN, tras la separación a altas temperaturas, dos cadenas de ADN podrían copiarse utilizando una enzima de unión, a partir de oligonucleótidos cortos o cebadores (4–6). Dado que la PCR sólo amplifica cadenas de ADN, y los coronavirus son virus de Ácido Ribonucleico (ARN) de una sola cadena en sentido positivo recubiertos por una estructura de glicoproteínas y lípidos, se realiza una variante de la PCR estándar: la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR). Para lo cual es necesario realizar la conversión del ARN monocatenario viral a ADN. En la RT-PCR, la muestra se añade a sondas que se unen únicamente a secuencias específicas del ADN retrotranscrito del virus y emiten fluorescencia y presenta en pantalla los resultados en tiempo real (7).
Los inmunoensayos incluyen algunas variantes, los de flujo lateral rápido, inmunoensayo de quimioluminiscencia automatizado y ELISA (Enzimoinmunoanálisis) que utilizan proteínas virales en dominios recombinantes de proteínas virales a las que se unen los anticuerpos humanos, en el caso que estén presentes en la sangre (8). Así para la determinación del virus en cuestión, se emplean proteínas de la nucleocàpside (NP) de murciélago, pues éste comparte más del 90% de identidad de los aminoácidos con todos los SARS-CoV 2, así como anticuerpos monoclonales conjugado anti-IgG y para IgM se emplea IgM antihumana (9).
Las características del virus causante de SARS-CoV-2 desconocidas en sus inicios, hizo que el método diagnóstico se fundamentara en características clínicas, estudios radiológicos e incluso identificación de bacterias causantes de neumonía lo que retardó el tiempo entre la identificación del patógeno, su tratamiento e implementación de medidas de control.
Tras la implementación de plataformas diagnósticas aparecieron incongruencias entre el resultado de las pruebas con la verdadera positividad o negatividad por lo que se requiere valorar el uso de los métodos de diagnóstico de laboratorio tanto moleculares como serológicas, caracterizar estas pruebas analizando la literatura científica actual que aborde la precisión diagnóstica y con ello determinar ventajas, usos y limitaciones y así aportar un sustento y apoyo informativo a la comunidad científica ecuatoriana.
METODO
Se eligieron artículos originales contentivos de datos para construir la pregunta PICO (Paciente: Pacientes con sintomatología de SARS- CoV2; Intervención: Diagnostico a través del método molecular (RT-PCR); Comparación: Diagnóstico por pruebas serológicas mediante la cuantificación de IgG e IgM; Objeto variable: Valoración la especificidad y sensibilidad de las pruebas) publicados entre 31 de diciembre de 2019 al 05 de marzo de 2021 tanto en el idioma español e inglés.
La búsqueda de la información se realizó a través de las bases científicas Scopus y Web of Science, eligiendo artículos originales indexados, empleando palabras clave y conectores booleanos para cada base de datos. (Ver Tabla 1).
Los criterios de elegibilidad comprendieron investigaciones en las que realizaron el diagnóstico del virus a pacientes hospitalizados con sintomatología de SARS-CoV2 a través de hisopado nasofaríngeo y otros T-PCR en tiempo real dirigido a genes específicos del virus; ensayos de diagnóstico por métodos serológicos tales como Enzimoinmunoanàlisis (ELISA) o quimiolumninscencia dirigido a las inmunoglobulinas G y M u otras; todos los ensayos deben evaluar tanto sensibilidad y especificidad, entre otros parámetros de importancia. Entre los criterios de exclusión están ensayos a pacientes ambulatorios en laboratorios de nivel básico, valoración a partir de valores obtenidos a través de base de datos estudios y que no evaluaban la sensibilidad o especificidad. La selección de estudios se realizó por un solo revisor considerando una fase inicial de lectura de títulos y resúmenes, seguida de una fase de lectura a texto completo de las referencias potencialmente relevantes identificadas para su análisis y posterior correlación.
RESULTADO
Empleando combinaciones de términos y operadores booleanos en la búsqueda general de la base de datos Scopus, se obtuvo 59 artículos, tras una búsqueda adicional se sumaron 31 artículos más, dando un total de 90 artículos; para facilitar la búsqueda en la plataforma Web of Science se realizó una búsqueda avanzada de la cual se obtuvo un total de 46 artículos. Siguiendo la metodología prisma a partir de 136 artículos se obtuvo 25 estudios aptos para la revisión completa. (Ver Figura 1).
El mayor número de publicaciones halladas provienen de China (5) y Estados Unidos (4), países de Europa (8) y Asia (6) en diferentes países como Italia, Reino Unido, Holanda, España, Korea, aportan también importantes estudios mientras que, en América Latina se encontraron publicaciones procedentes de Brasil (1) y Ecuador (1).
Todos los estudios indican desarrollo y validación clínica de diferentes técnicas diagnósticas, estandarización de métodos, propuestas de nuevas metodologías diagnósticas entre ellas LAMP (Amplificación Isotérmica mediada por bucle de transcripción inversa), RT-PCR, variantes de la PCR como PCR anidada y RFLP (Técnica de Polimorfismos de longitud de fragmento de restricción) usando enzimas de restricción, así como validación de Kits comerciales o combinaciones de dos o más técnicas, presentando 25 estudios los valores de sensibilidad y especificidad, tipo de muestra empleada y genes blanco de detección; se describieron 17 elementos correspondientes al diagnóstico de SARS- CoV-2 por técnicas moleculares y 8 por técnicas serológicas. (Ver Tabla 2).
Diagnóstico molecular de SARS-CoV-2 La RT-PCR (Reacción en cadena de la polimerasa con retro transcripción). Es el método considerado como estándar de oro “Gold standard” para la detección del SARS- CoV-2, permite detectar el virus tras la aparición de la enfermedad y entre pacientes con síntomas desde leves hasta graves (10). Es eficiente, aunque costosa y poco asequible, de ahí la variabilidad y adecuación de la prueba diagnóstica en busca de disminución de costos, mejora del rendimiento y obtención de resultados en menor tiempo.
Emplear RT-PCR convencional con uso de reactivos como el Syber Green puede abaratar costos así lo concluye Dorlass et al., (11) reflejando adecuados valores de sensibilidad y especificidad aunque ofreciendo resultados en mayor tiempo. Una alternativa confiable es la NESTED RT-PCR (PCR anidada), ensayada por Yip et al., (12) pues muestra un aumento en la sensibilidad y especificidad al compararla con la RT-PCR no anidada y además se puede emplear diferentes especímenes como saliva en lugar del hisopado nasofaríngeo. Por otra parte, Son et al., (13) hizo uso de la RFLP-PCR, usando enzimas de restricción lo que permite diferenciar entre SARS-CoV y SARS- CoV-2, de gran importancia por la alta similitud del genoma entre los miembros de la familia Coronaviridae.
La PCR multiplex es una técnica que mejora la especificidad de detección, puede ser empleada en el ambiente intrahospitalario pues como indica el autor para detectar confecciones lo cual puede ser útil en épocas de incidencia de afecciones respiratorias (14). La técnica LAMP es una técnica de amplificación de ácidos nucleicos que emplea una combinación de dos o más conjuntos de cebadores. El ensayo de Dharavath et ál., (15) emplea un cebador dirigido al gen N y otros dos cebadores, uno dirigido a una región no superpuesta del gen N y otro dirigido al gen ORF-1ab. Los autores que aplicaron y validaron el ensayo la defienden como una técnica rápida que da resultados de 30 a 60 minutos (16) sensible y sencilla, recomendada para manejar en pacientes asintomáticos (17) así como en un abundante número de muestras, dirigido al diagnóstico en el punto de atención (POCT) (18,19), así como en el seguimiento a pacientes sospechosos, contactos cercanos y grupos de alto riesgo (20).
Finalmente, cinco ensayos validaron el rendimiento de kits que usan metodología RT-PCR (21-23). La sensibilidad y especificidad de los métodos diagnósticos moleculares se indican en la Figura 2 y Figura 3.
Diagnóstico serológico
Los estudios para la determinación y cuantificación de anticuerpos a través de técnicas serológicas se encontraron en menor proporción, en 8 de los 25 artículos revisados; los autores emplearon esta metodología dada la necesidad de procesos que revelen resultados en menor tiempo y empleando muestras menos invasivas y menos dolorosas, sin embargo al no existir el “Gold estándar” se debió comparar con ensayos internos, así lo hizo Pickering et al., (24). Por su parte, Sapkal et al., considerando la microneutralización del virus como un método de referencia para los ensayos serológicos desarrolló un ELISA (Enzimoinmunoanàlisis de adsorción) para la detección de IgG en suero o plasma empleando el antígeno del virus, revelando un importante rendimiento de sensibilidad y especificidad, además de ser recomendado para una valoración rápida en individuos expuestos como trabajadores de la salud o de la industria (25). Fue además el único de los ensayos en indicar valores pronósticos positivos y valores pronósticos negativos.
Entre las técnicas más empleadas y validadas por los autores se encuentra el ELISA, que tras su estandarización (26) se recomendó su uso tanto en la forma manual como semiautomática; 6 estudios validaron clínicamente la técnica sola o comparada con otras metodologías entre ellas electroquimioluminiscencia (ECLIA) quimioluminiscencia indirecta (CLIA) donde resultaron siempre con un mejor rendimiento (27). Los valores de sensibilidad y especificidad se indican en la Tabla 3.
Liao et al., desarrolló un ensayo de inmunocromatografìa con base en oro coloidal que resalta por su rapidez en obtención de resultados, aunque no diferencia entre inmunoglobulinas, pero podrá emplearse en el monitoreo constante a personas con exposición perenne al virus como es el caso del personal médico (28). Ensayos cuantitativos basados en matriz de suspensión cuantitativa (qSAT) fue también una alternativa empleada por Dobaño et al., mostrando incluso mejor rendimiento y en menor tiempo que los ensayos ELISA (29).
Espécimen para diagnóstico molecular y serológico
Todos los estudios de diagnóstico molecular emplearon hisopado nasofaríngeo como muestra de análisis, 6 hicieron dos combinaciones de hisopado nasofaríngeo con esputo, hisopado nasal y lavado bronco alveolar respectivamente, mientras que 3 estudios apuntaron a mayores combinaciones como hisopado nasofaríngeo con frotis de garganta, saliva y enjuagues orales. Ver figura 3.
La práctica invasiva de toma de muestra a través del hisopado nasofaríngeo se podrá reemplazar por el uso de saliva con el kit empleado por Babady et al. Pues el índice de detección del virus fue igual al comparar estos dos tipos de muestras; no así usando enjuagues orales, ya que el mismo estudio revelo un bajo rendimiento del mismo (30). El kit SimplexaTM COVID-19 Direct, permite usar lavado bronco alveolar recomendado a pacientes con afección del tracto respiratorio inferior (22).
Genes y proteínas virales blanco de detección
El diagnóstico molecular se basa en la detección de zonas altamente conservadas del genoma viral, que tras su secuenciación permitió diseñar sondas y cebadores específicos que apuntan a la complementariedad del virus y su detección. Ver Figura 4. El ensayo de Chen et al. Demuestra que la especificidad mejora al usar tres blancos de detección en comparación de uno solo (31). Por otra parte, entre los ensayos serológicos, de los ocho estudios uno no especifica el blanco de detección, mientras que otro usa antígeno viral, 1 estudio empleó solo un blanco de detección, la glicoproteína N, los demás emplearon combinaciones de los componentes proteicos del virus, Ver Figura 5.
Pruebas de reacción cruzada
En el proceso de desarrollar un diagnóstico a través de técnicas moleculares o serológicas se requiere estricta atención para evitar contaminantes de otros virus de las vías respiratorias, así como de virus de la misma familia Coronaviridae, pues serían los principales causantes de una falsa reactividad, solo dos de los 25 ensayos no realizó pruebas de reacción cruzada frente a otros virus lo que disminuiría la validez de los valores de rendimiento que notificaron, así se indica en la validación de la sensibilidad del kit “AccuPower SARS- CoV-2 real time RT-PCR (Bionner, South Korea) que no usa genes de controles negativos (32); también lo hace la prueba serológica desarrollada por Yunbao et al., (33) que no especifica en ningún punto de su estudio valores de especificidad o uso de controles negativos.
DISCUSIÓN
La identificación temprana de casos COVID-19 ayudó en primera instancia a establecer medidas de control, aislamiento, y tratamiento oportuno, la detección de anticuerpos de pacientes afectados por el virus y su cuantificación permite emplear el suero como medida de tratamiento de emergencia mientras se llevaba el proceso de desarrollo de vacuna y tratamiento farmacológico, además, la aparición abrupta y desconocida del virus y la variabilidad de síntomas no permitió hacer un diagnóstico clínico, siendo el diagnóstico de laboratorio la herramienta pilar para el manejo de la pandemia. En este punto de la enfermedad su valor no pierde significado, continuará siendo una herramienta importante pues tras el proceso de vacunación puede monitorearse la inmunidad alcanzada.
La identificación del virus empleando cebadores dirigidos a varias regiones del virus es la clave en las pruebas moleculares, Chen et al., (31) en donde se usó una combinación de hasta tres genes dianas que a pesar de no indicar el porqué de estas combinaciones podría relacionarse con el perfeccionamiento del diseño de cebadores pudiendo emplearse cualquiera de ellos por la confiabilidad que mostraron sus resultados de sensibilidad y especificidad; de la misma forma el bajo rendimiento de las pruebas puede deberse a fallas en el diseño del primer empleado.
Los protocolos moleculares han sido desarrollados en laboratorios independientes y aunque se encuentran bajo la aprobación de entidades reguladoras por la emergencia, estos no han demostrado un rendimiento adecuado, el estudio llevado por Procop et al., (23) en el que compara cinco kits, todos avalados por la FDA (Food and Drug Administration), el Kit ID Now COVID-19 (Abbott) mostro el más bajo rendimiento en términos de sensibilidad y especificidad por lo que tendrá un menor desempeño en muestras con carga viral baja. Aunque Yan et al., (22) realizó la validación del mismo kit mostrando un buen rendimiento la población de estudio fue solo de 30 individuos. Bordi et al., sugiere que debería haber una mayor ordenación antes de liberar al mercado kits con bajo sensibilidad por debajo del 70% como es el caso del kit AccuPower SARS-CoV-2 real time RT-PCR kit (Bioneer, South Korea) (32).
Además de la convencional RT-PCR la técnica más nombrada y con mayor cantidad de ensayos es la amplificación de ácidos nucleicos por LAMP, recomendada para su uso en un futuro en lugares de alta afluencia de público como farmacias, aeropuertos, centros de atención alejados, es decir en el punto de atención; sin embargo, debido a las mutaciones que pueden generarse en los genes diana de detección, la precisión del ensayo podría verse afectado.
El diagnostico a través de técnicas moleculares puede ser realizado en cualquier etapa de la enfermedad (23), no así en las pruebas serológicas de las cuales se probaron en grupos de pacientes y su rendimiento fue según los días de la aparición de los síntomas, así como de acuerdo a los días de afección (34).
Las validaciones de técnicas serológicas por su parte mostraron resultados bastante heterogéneos, de ahí la importancia de emplearlas sólo de acuerdo a la etapa de la enfermedad. Así para la determinación de cada inmunoglobulina (M, G, A) es necesario conocer el estadio de la enfermedad del individuo, así lo demostraron los estudios revisados pues todos emplearon grupos de pacientes clasificados por día de afección.
CONCLUSIÓN
En el análisis expuesto, se encontró una mayor cantidad de ensayos con un importante contenido sobre la validación y especificación de ensayos moleculares, mostrando adecuados valores de sensibilidad y especificidad. Las pruebas moleculares pueden ser usadas en varios especímenes biológicos como el hisopado nasofaríngeo, pero además en esputo, hisopado nasal y oro faríngeo, frotis de saliva, lavado bronco alveolar y enjugues bucales lo que reducirían las molestias en el paciente al momento de la toma de muestra. Los valores elevados especificidad son producto del uso de genes diana dirigidos a zonas altamente específicas del virus.
Las pruebas moleculares pueden ser aplicada en cualquier etapa de la enfermedad, y aun que requiere equipamiento y/o reactivos especiales, pueden usarse tanto en el ambiente intrahospitalario como en el punto de atención.
Por su parte, existe una minoría en ensayos de validación de técnicas serológicas las cuales revelaron valores de sensibilidad menores al 90%. La falta de una prueba Gold estándar, impide que sean utilizadas como único método de diagnóstico. Los valores de especificidad mostraron un rendimiento apropiado. Así también, el tipo de muestra necesaria para su aplicación es fácil de obtenerla y segura para el laboratorista encargado.
Por su parte, las entidades diagnósticas deberán reconocer el uso combinado tanto de pruebas moleculares y complementarlas con las serológicas de acuerdo a la información proporcionada por el paciente en relación al tiempo de infección o contacto cercano con un caso positivo.
Finalmente al momento de escoger una u otra técnica será necesario verificar además de su regulación, la validación clínica pues esto garantizará el uso de la misma.
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