Introducción

Uno de los ejes fundamentales de la bioeconomía acuícola en los laboratorios de reproducción de peces se enfoca en la producción de alimento vivo (Almendarez, 2015) para disminuir costos operativos ante la alta demanda de alevines en las granjas de producción de peces marinos o de agua dulce, contribuyendo a la mejora de la rentabilidad de la actividad acuícola (FAO, 2014). La contribución de las microalgas a la bioeconomía acuícola se relaciona con la potencialidad que poseen estos microorganismos para mejorar la sostenibilidad costo-beneficio en la producción de alevines de peces debido a su alto contenido nutricional (Fernández et al., 2018). Las microalgas aportan polisacáridos, lípidos, aminoácidos, proteínas y vitaminas que varían en cantidad según la especie, por lo que son implementadas como mezcla para incrementar la calidad nutricional de los microorganismos usados como alimento vivo para larvas de peces (Lubzens et al., 1995).

Nannochloropsis oculata es una microalga que pertenece a la clase Eustigmatophyceae, se caracteriza por ser unicelular, con formas subesféricas o cilíndricas y miden entre 2 y 4 mm, contiene clorofila “a” y otros pigmentos como astaxantina, zeaxantina y canthaxantina y los cloroplastos presentan coloración de

amarillo a verde (Guiry, 2013). Asimismo, este género agrupa especies que contienen la mayor cantidad de ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), especialmente ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido araquidónico (ARA), docosahexaenoico (DHA) de gran importancia en la nutrición, formación del sistema nervioso y desarrollo de larvas de organismos marinos (Sánchez-Torres et al., 2008). El alto contenido de ácidos grasos poliinsaturados y su tolerancia a los cambios ambientales hace que esta especie de microalga sea ampliamente utilizada para alimentar rotíferos (Fulks y Main 1991; Renaud et al., 1991; Lubzens et. al. 1995; Lubían et. al. 2000) o para consumo humano (Sukenik, 1999; Barclay y Apt, 2013). Por consiguiente, estudiar los parámetros fisicoquímicos y contenido de nutrientes que mejoren el comportamiento reproductivo y calidad nutricional de las microalgas, contribuye al fortalecimiento de la bioeconomía acuícola (Fernández et al., 2018). Algunos autores muestran que Nannochloropsis oculata cultivada en ambientes abiertos, con una temperatura entre 12-15 ⁰C y concentración salina de 28-30 ‰ llega a alcanzar concentraciones promedio de hasta 115 x 10⁶ cel/ml, mientras que a temperatura mayor a 20 ⁰C alcanza valores de concentración entre 46 y 60 millones de cel/ml (Persíco et al., 2011). En ambientes abiertos con temperatura de 31 ⁰C y 25 ‰ de salinidad se han obtenido concentraciones de 75 X 10⁶ cel/ml, sugiriendo que la densidad celular de Nannochloropsis oculata cultivadas en ambientes abiertos presenta un ritmo de crecimiento inversamente proporcional a la temperatura (Álvarez-Lajonchére et al., 1996).

Por otro lado, en condiciones de laboratorio, es importante controlar la longitud de onda emitida por la luz artificial debido a que Nannochloropsis oculata contiene clorofila “a” y esta tiene rangos muy cortos de absorción en los dos picos de máxima eficiencia fotosintética (Sánchez-Torres et al., 2008). En salinidades de 33 ‰ y usando lámparas fluorescentes de 40 wats, fotoperiodo 12:12 (luz - oscuridad), se han obtenido

concentraciones de 6.52 x 10⁷ cel/ml en un periodo de 7 días (Paes et al., 2017). Ante tal situación, en diversos estudios se ha demostrado que Nannochloropsis oculata puede variar su comportamiento reproductivo o su calidad nutricional solamente por la variación de unos de los parámetros fisicoquímicos, tales como: contenido nutricional ofrecido en el medio de cultivo, longitud de onda o la concentración salina del medio de cultivo. Es más, las principales estrategias evolutivas sobre la capacidad reproductiva en momentos de escases de nutrientes que han adoptado las células vegetales se fundamentan en la capacidad de almacenar grandes cantidades del enzima ribulosa-1,5-bifosfato (RuBP) carboxilasa/oxigenasa (rubisco) (Andrew y Lorimer, 1987) y que los bioelementos invertidos en su síntesis pueden ser recuperados mediante catálisis en momentos de senescencia natural o inducida por estrés, o en una situación de carencia de nutrientes (Kozaki y Takeba, 1996 ; Ferreira et al., 2000). Por lo tanto, el objetivo de este trabajo fue evaluar la capacidad reproductiva de Nannochloropsis oculata usando dos baterías experimentales y aplicando dosis únicas de 0.32 ‰ y 1 ‰ de F/2 Guillard, respectivamente; en salinidades de 33 ‰, 25 ‰, 20 ‰, 15 ‰, 10 ‰ y 5 ‰, periodos de 10 y 23 días y temperatura de 25 ºC.

Materiales y métodos

Microorganismo de estudio

Se utilizó una cepa de Nannochloropsis oculata del cepario del Laboratorio de Investigaciones Marinas y Acuícolas (LIMA), Facultad de Ciencia y Tecnología de la Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua, León (UNAN-León), ubicado en las Peñitas, León. En el desarrollo del trabajo de investigación se realizaron dos experimentos, cada uno estuvo estructurado por dos baterías experimentales con medios de cultivo de 250 ml y 33 ‰, 25 ‰, 20 ‰, 15 ‰, 10 ‰ y 5 ‰ de salinidad. Las baterías experimentales contenían

concentraciones de 0.32 ‰ y 1 ‰ de F/2 Guillard, respectivamente. Ambos experimentos se realizaron con temperatura de 25 ⁰C y luminosidad constante de aproximadamente 250 μmol E/m²/s.

Composición del fertilizante F/2 Guillard

Tiene una composición final por litro: 75 mg KNO₃, 5.65 mg NaH₂PO₄.2H₂O, 4.360 mg EDTA.Na₂, 3.150 mg FeCl₃.6H₂O, 0,010 mg CuSO₄.5H₂O, 0,022 mg ZnSO₄.7H₂O, 0,010 mg CoCl₂.6H₂O, 0.180 mg MnCl₂.4H₂O, 0,006 mg Na₂MoO₄.2H₂O, 2 µg cianocobalamina cristalina (B12), 0.100 mg tiamina clorhídrica (B1), 0,001 mg biotina cristalina.

Diseño experimental

Experimento 1, Tratamiento salino dependiente de la concentración

Se formaron 2 baterías experimentales con dos concentraciones de F/2 Guillard (batería 1: 1 ‰ y batería 2: 0.32 ‰), con seis concentraciones salinas (33 ‰, 25‰, 20‰, 15‰, 10‰, y 5 ‰) cada batería y volúmenes de 250 ml, para evaluar la capacidad reproductiva de Nannochloropsis oculata. Previo al ensayo experimental, el agua de mar se pasó por un filtro UV y otro de papel de paso lento, para finalmente ser esterilizada. A partir del agua marina se realizaron las diluciones usando agua destilada. El tiempo de duración del experimento fue de 10 días. Temperatura e irradiancia fue como se describe anteriormente. El valor de salinidad se midió diario y se corregía con agua destilada.

Experimento 2. Tratamiento tiempo dependiente de crecimiento

Se formaron 2 baterías experimentales compuestas por 3 concentraciones salinas (33 ‰, 25‰, 20‰,), cada una, para evaluar el ritmo de crecimiento de Nannochloropsis oculata en concentraciones de F/2 Guillard

(batería 1: 1 ‰ y batería 2: 0.32 ‰). Tiempo de duración del experimento fue de 23 días. El procedimiento experimental fue similar al descrito en el experimento 1.

Conteo celular

Las densidades celulares se determinaron cada 24 horas mediante conteo en hemocitómetro o cámara de Neubauer de 0.1 mm de profundidad, expresándolas como número de células por mililitro (cel/ml). Las lecturas se realizaron por triplicado, se sumó el número de células contadas en los cuatro cuadrantes externos de la cámara y se dividió entre 2500. Este procedimiento se usó para contar el número de cel/ml en los tratamientos salinos definidos en las dos baterías.

Análisis estadísticos

Las comparaciones entre las concentraciones salinas en cada batería experimental se realizaron mediante ANOVA de una vía y entre baterías experimentales se usó ANOVA de dos vías (SigmaStat; SPSS Inc., Chicago, IL). Previo al análisis de varianza, los datos fueron analizados mediante una prueba de normalidad (Shapiro-Wilks) y de homogeneidad de varianzas (prueba C de Cochran). Las comparaciones post hoc se realizaron mediante una prueba de Student-Newman-Keuls. Los datos se muestran como media ± E.E.M. de cada grupo y las diferencias se consideraron estadísticamente significativas a P <0,05.

Resultados y discusión

Primer experimento:

De manera general, nuestros resultados muestran que donde se aplicó 0.32 ‰ de F/2 Guillard los medios con concentraciones salinas de 33 ‰ y 25 ‰ presentaron la mayor cantidad de cel/ml de Nannochloropsis oculata, a los 8 días de estudio (figura 1), denotando la afinidad de Nannochloropsis oculata

Figura 1
Ritmo de reproducción de Nannochloropsis oculta, cultivada con 0.32 ‰ F/2 Guillard y concentraciones salinas(33 ‰, 25 ‰, 20 ‰, 15 ‰, 10 ‰, 5 ‰),en un período de 10 días.

Este resultado coincide con lo reportado en estudios recientes, donde usando fertilizante agrícola y vitaminas del complejo B obtuvieron resultados similares a los nuestros, la fase de latencia se mantiene entre

3-4 días y la fase exponencial se prolonga hasta los ocho días (Pereira et al 2017). Otros estudios muestran que Nannochloropsis oculata presenta comportamiento reproductivo similar al encontrado en nuestro estudio cuando se encuentra cultivada en medio con salinidad de 28-30 ‰ (Persico et al., 2011). Bajo este contexto, nuestros resultados invitan a sugerir que Nannochloropsis oculata puede cultivarse con 0.32 ‰ de F/2 Guillard,en un volumen de 250 ml y obtener razonable rendimiento reproductivo, en concentraciones de 33 ‰ y 25 ‰ de salinidad y temperatura de 25 ⁰C. Por otro lado, los efectos generalizados sobre el comportamiento reproductivo de Nannochloropsis oculata en la batería experimental donde se agregó 1 ‰ de F/2 Guillard (figura 2), confirman la importancia de la aplicación de este fertilizante para la reproducción de esta microalga (Martínez et al., 2017) cuando es cultivada en concentraciones salinas menores a 25 ‰ (Sánchez-Torres et al., 2008).

Figura 2.
Ritmo de reproducción de Nannochloropsis oculta, cultivada con 1 ‰ F/2 Guillard y concentraciones salinas(33 ‰, 25 ‰, 20 ‰, 15 ‰, 10 ‰, 5 ‰)en un período de 10 días.

Por lo tanto, nuestros datos muestran que Nannochloropsis oculata puede ser cultivada en un amplio rango de salinidades, coincidiendo con lo reportado por otros investigadores (Álvarez- Lajonchére et. al., 1996; Ra et. al., 2016). Además, hemos demostrado que el ritmo reproductivo de Nannochloropsis oculata es similar cuando se encuentra cultivada en medio con 33 ‰ y 25 ‰ y usa 0.32 ‰ o 1 ‰ de F/2 Guillard (figura 3), denotando la afinidad a la concentración salina oceánica (Pereira et al., 2017) y a la capacidad de reproducción con escaza presencia de nitrógeno (Paez et al., 2016), quizás debido a mecanismos contra reguladores como la catálisis de la enzima rubisco (ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa) para abastecer a la célula de nitrógeno, azufre y carbono en momentos de carencia de nutrientes (Andrews y Lorimer, 1987; Ferreira et al., 2000). Por consiguiente, obtener igual densidad poblacional en los medios de cultivo con 0.32 ‰ y 1 ‰ de F/2 Guillard en las concentraciones de 33 ‰ y 25 ‰ muestran la capacidad de reproducción de Nannochloropsis oculata bajo limitaciones de nitrógeno. Sin embargo, si se incrementa la concentración de fertilizante de 0.32 ‰ a 1 ‰, la reproducción de Nannochloropsis oculata no se ve afectada por la salinidad en un rango de 15 ‰ a 33 ‰. Es más, los medios de cultivo con 5 ‰, 10 ‰, 15 ‰ y 20 ‰ que contienen 1 ‰ de F/2 Guillard presentan mayor concentración celular que los medios de cultivo con idénticas concentraciones salinas y 0.32 ‰ de F/2 Guillard (figura 3).

Figura 3.
Cantidad de células por ml de Nannochloropsis oculta, cultivada con 0.32 ‰ y 1 ‰ de F/2 Guillard enconcentraciones salinas (33 ‰, 25 ‰, 20 ‰, 15 ‰, 10 ‰, 5 ‰), 8 días de cultivo. Letras diferentes indican diferencias significativas, de manera individual, para cada batería experimental. *: Indica diferencias significativas entre los tratamientos con 0.32 ‰ y1 ‰ de F/2 Guillard en una misma concentración salina.

Situación que pudiese estar siendo mediada por los cofactores vitamínicos presente en F/2 Guillard (Pereira et al., 2017). Además, se observa igual periodo de tiempo para la reproducción de la microalga en la fase de adaptación (0-4 días) y exponencial (5-9 días), lo cual coincide con lo reportado por otros investigadores (Martínez et. al., 2017; Pereira et. al., 2017; Ra et. al., 2016). Cabe mencionar, que en nuestro experimento se agregó una sola dosis inicial de F/2 Guillard, a diferencia de lo realizado por Martínez et al., (2017) que agregó el fertilizante cada 4 días. Por lo tanto, nuestros resultados muestran que una sola dosis de 0.32 ‰ de F/2 Guillard es suficiente para tener una concentración de microalgas de 13 x 10⁶ cel/ml, en un medio de cultivo con volumen de 250 ml en un periodo de 8 días, temperatura de 25 ⁰C y concentración salina de 25 ‰ o 33 ‰, teniendo concentración inicial de 12 x 10⁴ cel/ml de Nannochloropsis oculata.

Segundo experimento:

Tras determinar que N. oculata se reproduce bien en concentraciones salinas de 33 ‰, 25 ‰ y concentraciones de 0.32 ‰ y 1 ‰ de F/2 Guillard se evaluó su capacidad reproductiva en un periodo de 23 días, bajo las mismas condiciones experimentales descritas en el primer experimento en salinidades de 33 ‰, 25 ‰ y 20 ‰. Nuestros resultados muestran similar ritmo reproductivo entre los tratamientos salinos de cada batería experimental y los tratamientos salinos entre concentraciones de F2 Guillard de ambas baterías (Figura 4.)

Figura 4
Ritmo de reproducción de Nannochloropsis oculta cultivada en diferentes contracciones salinas (33% , 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %) Periodo de 23 dias A: 0.32 %,F/2 Guillar, B>1 F/2 Guillard.

Algunos investigadores han cultivado N oculata por 23 días, con niveles de irradiancia de 650 y 400 μmol E/m²/s, temperatura de 25 ⁰C y aplicación F/2 Guillard cada 4 días y los resultados muestran que la densidad celular de los cultivos alcanzan valores de hasta 175 ± 1.83 y 148 ± 1.97 x 10⁶ cel/ml, respectivamente. Mientras que en niveles de irradiancia de 80 y 200 μmol E/m²/s la densidad celular alcanza valores de 21 ± 1.12 y 43 ± 1.84 x 10⁶ cel/ml, respectivamente (Martínez et al., 2017). Nuestro ensayo experimental se hizo bajo las mismas condiciones del estudio realizado por Martínez et al., (2017) con nivel de irradiancia de

aproximadamente 250 μmol E/m²/s con la excepción que nosotros realizamos una sola aplicación de F/2 Guillard a cada batería experimental (0.32 ‰ y 1 ‰), al inicio del experimento. No obstante, resulta interesante observar que, aunque el F/2 Guillard solo se aplicó al inicio del experimento se logró obtener densidades de cel/ml similares en las tres concentraciones salinas, en cada batería y entre baterías (Figura 5).

Figura 5
Cantidad de celulas por ml de Nannocholoropsis oculta, cultivada con 0.32 % y 1 % de F/2 Guillard en concentraciones salinas (33 %, y 20 %), 23 días de cultivo.

Por lo tanto, observar rendimientos similares de la concentración de cel/ml y del comportamiento reproductivo, entre ambas baterías experimentales, a lo largo de 23 días de cultivo sugiere que Nannochloropsis oculata puede ser cultivada con 0.32 ‰ de F/2 y que esta concentración de fertilizante es suficiente para obtener rendimientos de hasta 50 x 10⁶ cel/ml, independientemente del agotamiento del nitrógeno. Es más, que esta microalga puede continuar reproduciéndose posiblemente a la capacidad de protección celular frente al estrés que presenta la vía fotorrespiratoria (Xiao et. Al., 2013; Barclay y Apt, 2013) debido a la acumulación de grandes cantidades del enzima rubisco y que los bioelementos invertidos en su síntesis pueden ser recuperados por medio de las rutas catabólicas de rubisco que se activan cuando se produce una decadencia funcional

durante la senescencia natural o inducida por estrés, o en una situación de carencia de nutrientes (Ferreira et. al., 2000; Wei et. al., 2017). Por consiguiente, el aplicar una sola dosis del fertilizante F/2 Guillard al inicio del experimento y observar igual cantidad de cel/ml a los 23 días, entre las diferentes concentraciones salinas de cada batería (33 ‰, 25 ‰ y 20 ‰) y entre las concentraciones de F/2 Guillard de las dos baterías experimentales (0.32 ‰ y 1 ‰), sugiere que, independientemente, de la escases de nitrógeno Nannochloropsis oculata podría continuar reproduciéndose debido a la característica del enzima rubisco de servir como una importante reserva de nitrógeno, azufre y carbono; elementos esenciales que la célula puede redirigir hacia otros destinos en situaciones críticas, de manera similar a lo reportado por otros investigadores (Paez et al., 2016; Wei et. al., 2017).

Por lo antes descrito, es importante tomar en cuenta lo mencionado por Anderson y Seijo (2010) y Alzugaray, R., Puga, R., Valle, S., Morales, O., Grovas, A., López, L. y Fujita, R. (2019) donde argumentan la necesidad de abordajes multidisciplinario en el enfoque de la Bioeconomía y de ahí la importancia de generar otros estudios en la Bioeconomía Acuícola que permitan conocer cuáles son los beneficios en rentabilidad para la producción de N. oculata, ¿o cuál es el manejo actual a nivel piloto comercial en los laboratorios de producción de juveniles de peces marinos? ¿Cuánto se necesita producir de esta microalga? y ¿Cuánto me ahorro con la implementación de estos manejos?

Conclusión

En conclusión y contribuyendo a la gestión del conocimiento de la Bioeconomía Acuícola, los resultados presentados en este estudio confirman que Nannochloropsis oculata presenta mejor ritmo de crecimiento poblacional en concentraciones salinas de 25 ‰ y 33 ‰ y que en estas concentraciones salinas la densidad poblacional, a los 8 días de cultivo, presenta similar número de cel/ml si se cultiva con 0.32 ‰ o 1 ‰ de F/2 Guillard. Asimismo, se confirma la importancia de este fertilizante cuando la microalga es cultivada en concentraciones salinas menores a 25 ‰. El trabajo demuestra que Nannochloropsis oculata puede reproducirse y alcanzar densidad poblacional de más de 50 x 10⁶ cel/ml, en un periodo de 23 días, con una sola dosis inicial de fertilizante; ya sea con 0.32 ‰ o 1 ‰ de F/2 Guillard y concentraciones salinas de 20 ‰, 25 ‰ y 33 ‰, denotando la capacidad de N. oculata de reproducirse en medios con escaso contenido de nutriente.

Por consiguiente, cuando N. oculata se encuentra cultivada en ese rango de concentración salina y 0.32 ‰ y 1 ‰ de F/2 Guillard presenta igual densidad poblacional (ver tabla 1)

Tabla 1.
Comportamiento reproductivo de N. oculata en diferentes concentraciones de salinidad y dos concentraciones de F/2 Guillard (0.32 ‰ y 1 ‰), en 10 y 23 días de cultivo.

Letras diferentes indican diferencias significativas entre tratamientos (salinidades) de cada una de las baterías experimentales (0.32 ‰ y 1 ‰ de F/2 Guillard). *: Indica mayor concentración de cel/ml, solo entre tratamiento de la misma batería. =: Indica similar concentración de cel/ml entre los tratamientos con concentraciones de 0.32 ‰ y 1 ‰ de F/2 Guillard, en una misma salinidad. ≠+: Indica que la concentración de cel/ml en el medio con 1 ‰ > 0.32 ‰ de F/2 Guillard en la misma salinidad.

1er experimento (10 días de cultivo)
Concentración salina (‰)	Dosis F/2 Guillard (‰)
	0.32	1	0.32 vrs 1
33	a*	a*	=
25	a*	a*	=
20	b	a*	≠+
15	b	a*	≠+
10	b	b	≠+
5	b	b	≠+
2do experimento (23 días de cultivo)
33	a	a	=
25	a	a	=
20	a	a	=

Finalmente, el presente estudio contribuye a la Bioeconomía Acuícola debido a que la capacidad de reproducción de Nannochloropsis oculata con el consumo de poco nutrientes favorece la disminución de los costos de producción, es decir el cultivar la especie bajo estas condiciones conllevaría a una Bioeconomía más rentable, Spolaore, P., Joannis‐Cassan, C., Duran, E., y Isambert, A. (2006).

Agradecimientos

El equipo de investigación del Proyecto Pargo de la Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua, León (UNAN-León) agradecemos el apoyo brindado, para el desarrollo de esta investigación, a las instituciones del gobierno de la Republica de Nicaragua: Instituto Nicaragüense de la Pesca y Acuicultura (INPESCA); Ministerio del Ambiente y los Recursos Naturales (MARENA) por ser parte activa de nuestro proyecto; a las empresas Torrecilla SEAJOY y Semillas Acuáticas, S,A por apoyarnos en la capacitación de personal y

donación de equipos; a la Unión Europea (UE) y Agencia Española de Cooperación Internacional para el Desarrollo (AECID) debido a que con los proyectos "fortalecimiento al desarrollo económico de cooperativas y mipymes que participan en 7 cadenas de valor incluyentes, aplicando enfoques de sostenibilidad y adaptación al cambio climático y de igualdad de género de la producción agropecuaria y pesquera en las zonas vulnerables ante la sequía de las segovias y occidente del país" y “Fortalecimiento de capacidades para la cria y engorde en jaulas flotantes de pargo (Lutjanus sp) en 8 comunidades costeras de Nicaragua”, respectivamente, se logró reconstruir una parte del Laboratorio de Investigaciones Marinas y Acuícola (LIMA) de la UNAN-León y adquirir algunos equipos; al Consejo Nicaragüense de Ciencia y Tecnología (CONICYT) por su aporte a la adquisición de equipos y reactivos; a la Cooperación Suiza para el Desarrollo (COSUDE) y Comisión Centroamericana de Ambiente y Desarrollo – SICA (CCAD-SICA) por su apoyo para la obtención de reactivos de investigación; a la Misión Técnica Taiwán en Nicaragua– ICDF- por colaborar con el grupo de investigación del proyecto pargo en los trabajos de investigación y apoyar en el mantenimiento y funcionamiento del LIMA. A Carmen Rojo y Pilar Ruiz (Universidad de Valencia, España) y Emilia Calvo y Jorge Boza (Universidad Nacional, UNA-Puntarenas- Costa Rica) por su valioso aporte a la capacitación del equipo de investigación del Proyecto Pargo.

Referencias citadas

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Notas de autor

arielaguilar@ev.unanleon.edu.ni