Recepción: 05 Mayo 2018
Aprobación: 02 Junio 2020
Resumen:
De
Dentro del marco del Proyecto colaborativo entre la Universidad de Kansas y CIFLORPAN de la Universidad de Panamá se llevó a cabo bioprospección en la flora panameña, aún no explorada, para el descubrimiento de nuevas moléculas bioactivas contra tuberculosis, cáncer, enfermedad de Alzheimer y parasitarias.
Se establecieron tres parcelas de 0.1 ha en tres parques nacionales: Parque Nacional Chagras (PNCH), Parque Nacional General de División Omar Torrijos Herrera (PNGDOTH) y el Parque Nacional Sarigua (PNS). Se identificaron un total de 2537 registros, distribuidos en 1536 (PNC), 708 ((PNGDOTH) y 293 (PNS). Se identificaron un total de 176 especies, 230 géneros pertenecientes a 95 familias.
Se seleccionaron 197 especies para la evaluación biológica de plantas por su potencial farmacéutico con base en la búsqueda en la Base de Datos NAPRALERT. Para tal fin, se prepararon 302 extractos destanificados y 400 extractos etanólicos. Dos plantas Licania kallunkiae y Otoba novogranatensis demostraron actividad antituberculosa contra cepas de Mycobacterium tuberculosis sensibles (37Rv) y multirresistentes (MDR), con IC50 <
6.12 µg/mL. Estas mismas plantas también resultaron más activas contra Plasmodium
falciparum, Leishmania mexicana y Trypanosoma cruzi mostrando un porcentaje de inhibición de crecimiento (G% > 70.00 %).
En los ensayos de citotoxicidad contra tres líneas celulares cancerosas humanas (NCI- MCF-7, NCI-H-460 y NCI-SF- 268), las plantas Erythroxylum sp., Enterolobium schomburgkii, Otoba novogranatensis, Hymenea courbaril, Rollinia sp., Casearia carymbosa, Miconia argentea, Erytrina fusca, Rauwolfia littoralis, Vouarana guianensis, Virola sp., Garcinia madruno, Inga sapindoides, Casearia sp., y Castilla elastica fueron activas.
La evaluación de la actividad inhibidora contra la enzima acetilcolinesterasa permitió identificar 25 plantas como inhibidores selectivos de la enzima acetilcolinesterasa: Garcinia madruno, Ziziphus mauritiana, Erythrina fusca, Blakea herrerae, Guapira costaricana, Hortia colombiana, Tetrochidium sp., Pithecellobium hymeneaifolium. Pteridophyta, Psychotria capitata, Matayba sp., Cordia bicolor, Casearia corymbosa, Hymenea courbaril, Attalea butyracea, Bellucia pentamera, Indigofera suffruticosa, Machaerium sp, Bursera tomentosa, Garcinia madruno, Alysicarpus vaginalis, Dioclea megacarpa y Talisia nervosa. Mientras que en el ensayo de inhibición de butirilcolinesterasa, 10 plantas resultaron ser más activas: Pachira acuatica, Licaria sp., Warszewiczia coccinea, Rauwolfia littoralis, Nectandra sp, Neptunia sp, Piper sancti- felicis, Chamaecrista sp, Dussia atropurpurea y Elaeagio nitidifolia.
Se seleccionaron cuatro plantas para estudios aislamiento biodirigidos y su caracterización estructural: Morinda rojoc, Homalomena wendlandii, Licania kallunkie y Warszewiczia coccinea. Se aislaron en total 17 compuestos, 4 de ellos nuevos reportes a la literatura y 13 conocidos, pero aislados por primera vez de plantas panameña.
Palabras clave: Bioprospección, Cribado, Actividad Biológica, Cáncer, Alzheimer, Enfermedades Parasitarias, Tuberculosis, Flora Panameña.
Abstract: This collaborative project between the University of Kansas and CIFLORPAN of the University of Panama was carried out with an objective to undertake bioprospection studies of Panamanian Flora to explore its potential in discovering novel molecules against tuberculosis, cancer, Alzheimer’s disease and parasitic infections. Three parcels of 0.1 ha in three national parks: Parque Nacional Chagres (PNCH), Parque Nacional General de Division Omar Torrijos Herrera (PNGDOTH), and Parque Nacional Sarigua (PNS) were established. Two thousand five hundred thirty-seven registers of plants distribuited in 1536 PNC), 708(PNGDOTH) and 293 (PNS) were made. A total of 176 species of plants belonging to 230 genera and 95 families were identified. Two plants Licania kallunkiae and Otoba novogratensis were active against Mycobacterium tuberculosis 37Rv and MDR strains with an IC50 of <6.12ug/mL. These same extracts were also active against Plasmodium falciparum, Leishmania mexicana and Trypanosoma cruzi. In cytotoxicity screens against MCF-7, H-460, and SF-268 active plants were: Erythroxylum sp., Enterolobium schomburgkii, Otoba novogratensis, Hymenea courbaril, Rollinia sp., Casearia carymbosa, Miconia argentea, Erythrina fusca, Rauwolfia littoralis, Vourana guianensis, Virola sp., Garcinia, madruno, Inga sapindoides, Casearia sp., and Castilla elastica. Twenty five plants were selective inhibitors of acetylcholinesterase: Garcinia madruno, Ziziphus mauritania, Erythrina fusca, Pteridophyta ( Fern), Psychotria capitata, matayba sp., Blakea herreae, Guapira costaricana, Hortia colombiana, Tetrochidium sp., Pithecellobium hymenarifolium, Cordia bicolor, Tetrochidium sp., Casearia corymbosa, Hymenea courbaril, Attalea butyracea, Bellucia pentamera, Indigofera suffruticosa, Machaerium sp., Bursera tomentosa, Alysicarpus vaginalis, Dioclea megacarpa y Talisia nervosa. In butirylcholinesterase screen ten plants were active: Pachira acuatica, Licaria sp., Warszewiczia cocicnea, Rauwolfia lottoralis, Nectandra sp., Neptunia sp., Piper sancti-felicis, Chamaecrista sp., Dussia atropurpurea and Elaeagia nitidifolia. Four plants were selected for bioguided isolation of compounds: Morinda rojoc, Homalomena wendianti, Licania kallunkiae, and Warszewiczia coccinea. A total of seventeen compounds were isolated of which four were new to the literature.
Keywords: Bioprospection, Screening, Biological Activity, Cancer, Alzheimer, Neglected tropical diseases, tuberculosis, Panamanian Flora.
INTRODUCCIÓN
La flora de Panamá es extremadamente diversa y rica. Panamá se considera un “hotspot” de biodiversidad (Barthollt et al., 1996), ocupando la posición cuarta entre los países del Continente Americano. Esta gran diversidad es debido a los dramáticamente diferentes tipos de hábitats existentes en un área territorial tan pequeña (D’Arcy, 1987). Además, las diferentes zonas climáticas presentes en este país obligan a las plantas a competir con otras especies, tratando de ocupar el mismo nicho ecológico. Estas interacciones producen la elaboración de metabolitos secundarios para defenderse de insectos, hongos y animales herbívoros.
Hasta la fecha cerca de 10,000 especies de plantas han sido identificadas en Panamá (Correa et al., 2004), de las cuales menos del 5% han sido estudiadas por su potencial farmacéutico. El mercado mundial de medicamento ascendió a US$ 700,000.00 millones en el 2014 (IMS Institue, 2014), del cual se estima que el 25% de ellos son de origen natural. El reino vegetal es la fuente más importante de agentes anticáncer ya que el 62%de todos los medicamentos anticáncer aprobados de uso clínico actual son de productos naturales (Cragg and Newman, 2014). Además, el único medicamento aprobado para tratar la enfermedad del Alzheimer Galantamina es de origen vegetal y la bioprospección de la flora es importante para encontrar nuevas fuentes de estas moléculas.
Nuestro grupo de investigación tiene reportado 390 metabolitos de la flora panameña (Caballero-George et al 2011) Durante los últimos 40 años, aproximadamente 536 productos naturales (NP) se han aislado de 98 plantas vasculares y 186 de éstas son NP nuevos (Olmedo et al 2017).
METODOLOGÍA
1. Establecimiento de Parcelas
Se establecieron tres parcelas de 0.1 ha divididas en 5 subparcelas de 10 x 20 m en áreas boscosas de tres Parques Nacionales: Chagres sección Cerro Azul y Cerro Jefe, Panamá (PNCH), Sarigua, Herrera (PNS) y General de División Omar Torrijos Herrera en el Copé, Coclé (PNGDOTH) y se preparó un inventario de su biodiversidad en cuanto a la flora. Para ello, se midieron aquellos individuos (lianas, arbustos, árboles, y helechos arbóreos) con diámetros mayores a 1,0 cm a la altura del pecho (DAP). Una herramienta útil para la identificación de las especies fue: los Herbarios de la Universidad de Panamá (http://herbario.up.ac.pa/Herbario/inicio.php), y del Smithsonian Tropical Research Institute's Herbarium (SCZ) (http://biogeodb.stri.si.edu/herbarium/). Flora Mesoamericana (http://www.tropicos.org/Project/FM), Flora de Nicaragua (http://mobot.mobot.org/W3T/Search/Nicaragua/projsflnic.html), Muestras de Herbario Neotropicales (http://fm1.fieldmuseum.org), Botanicus (http://www.botanicus.org/NameSearch.aspx).
Las plantas fueron recolectadas por Carlos Guerra y Alex Espinosa e identificadas primero por ellos y luego confirmada por la exDirectora del Herbario de la Universidad de Panama (PMA) donde fueron depositadas las muestras voucher.
2. Selección de plantas
Se realizaron un inventario, identificación y búsqueda bibliográfica de las plantas recolectadas en los tres Parques Nacionales con base en los datos NAPRALERT©, seleccionándose 197 especies para someter a cribado biológico contra dianas identificadas dentro de este proyecto.
3. Preparación de extractos
Los extractos destanificados se prepararon según la metodología de Wall et al. (1996 y los etanólicos según metodología de Gupta et a.l (2004.)
4. Evaluación in vitro de la actividad biológica
Los siguientes ensayos fueron realizados en el High – Throughput Screening Laboratory de la Universidad de Kansas:
4.1. La entrada de dos substratos: estrona-3-sulfato y estradiol-17 β-glucurónido mediada por OATP1B1y OATP1B3 fue medida según la metodología de Gui et al. 2008; Hagenbuch et al. 2008.
4.2 Evaluación de la actividad contra carcinoma de células escuamosas (HNSCC) MDA 1986 de cuello y cabeza y células JMar, Yunk-2 y JHU011 y frente a línea celular A549 (carcinoma de pulmón y MRC–5 (fibroblasto normal). según la metodología del grupo de Barbara Timmermann (comunicación personal)
4.3. Evaluación de la actividad antioxidante utilizando la línea celular AREc32 y el kit de cuantificación de activación del ARE basado en el ensayo de luminicencia mediante la inducción de luciferasa se hizo con el Promega Steady-Glo Luciferase assay system. Los resultados de este trabajo son objeto de otra publicación.
Los siguientes ensayos fueron realizados en la Universidad Cayetano de Heredia y en Panamá.
4.4. Evaluación de la actividad antituberculosa contra cepas de Mycobacterium tuberculosis sensibles y resistentes según metodología de Caviedes et al. (2002) y Rojas et al. (2005).
4.5. Evaluación de la actividad antiparasitaria contra Plasmodium falciparum según Corbett et al (2004), Buckner et al (1996)); Leishmania mexicana según Williams et al (2003) y Trypanosoma cruzi según metodología descrita por Torres-Mendoza et al. (2003.)
4.6. Se han evaluado los extractos destanizados y los extractos etanólicos al 95% frente a las tres líneas celulares cancerosas humanas (NCI-MCF-7, NCI-H-460 y NCI-SF-268), según metodología de Monks et al. (1997).
4.7. Se evaluaron los extractos destanificados y etanólicos al 95% en el ensayo autobiográficos de inhibición de acetilcolinesterasa (AChE; EC 3.1.1.7) desarrollados por Ree et al. (2001) y de inhibición de butirilcolinesterasa. (BChE; EC 3.1.1.8). según la metodología de Ree et al. (2001) y Marston et al. (2002).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Material Vegetal
En los tres parques nacionales se seleccionaron tres parcelas de 0.1 ha, dividas en 5 subparcelas de 10 m x 20m en cada parque, realizándose 93 giras, que permitieron en
total 2537 registros, identificándose taxonómicamente 95 familias (F) 230 géneros (G) y 176 hasta especies. Los parques identificados con mayor número de diversidad fueron Parque Nacional Chagres (PNCH (70 F, 141 G, 116 sp.)); el Parque Nacional General Omar Torrijos Herrera (PNGDOTH (62 F, 119 G y 40 sp.)) y el Parque Nacional Soberanía (PNS, (26 F, 35 G, y 32 sp.)), un bosque más homogéneo por lo que su diversidad es más baja.
En la Gráfica No 1 se muestra la distribución por familias de plantas colectadas en los tres parques objetos de este estudio.
En las Gráficas No. 2, 3 y 4, se muestra las distribuciones por plantas identificadas hasta género y especie; y por identificar en cada Parque Nacional.
Plantas colectadas en PNS
Las familias con mayor número de especies están representadas por Melastomataceae (más de 26 especies (sp), p.ej: Miconia sp.), Rubiaceae 25 sp. (Psychotria y Palicuourea sp.), Clusiaceae (20 sp.), Arecaceae (16 sp.) (Geonoma sp.), Fabaceae (28 sp.); Euphorbiaceae (12 sp.), Apocynaceae y Myrsinaceae (10 sp.), Flacourtiaceae y Sapindaceae (9 sp.) Chrysobalanaceae, Moraceae (8 sp.) Myristicaceae (7 sp.), Annonaceae (6 sp.), Lecythidaceae, Sapotaceae,
Verbenaceae (5 sp.).
En el Cuadro No. 1 y la Gráfica No. 5, se puede visualizar la distribución comparativa por plantas, géneros y especies.
Parque Nacional Chagras (PNCH), Parque Nacional General de División Omar Torrijos Herrera (PNGDOTH) Parque Nacional Sarigua (PNS). Importar tabla
2. Selección de Plantas
Se ha evaluado la información bibliográfica en la Base de Datos Napralert® de 224 especies de plantas clasificadas cada una por su importancia medicinal, resultado que 54 de ellas tienen estudios previos que avalan la actividad enmarcada dentro del estudio. Del remanente de especies no existen información. Esto ha generado la selección de 197 especies de plantas que fueron sometidas a tamizado biológico contra varias dianas seleccionadas y posteriormente para realizar los estudios fitoquímicos biodirigidos.
3. Preparación de extractos:
Se prepararon 302 extractos diclorometano:metanol destanificados y 400 extractos etanólicos que fueron evaluados en los diferentes bioensayos.
4. Evaluación in vitro de la actividad biológica
4.1. Actividad anti-Mycobacterium tuberculosis
Se han evaluado doscientos veintiún extractos en el bioensayo de actividad antituberculosa contra cepas de Mycobacterium tuberculosis sensibles (37Rv) y multirresistentes (MDR), resultando en dos especies activas y promisorias: las hojas de Licania kallunkiae y el tallo de Otoba novogranatensis. demostraron una IC50 < 6.12
µg/mL para ambas plantas.
4.2. Actividad anti-parasitaria
Se evaluó la actividad antiparasitaria de treinta y cinco extractos destanificados y ciento cincuenta y cuatro extractos etanólicos contra Plasmodium falciparum, Leishmania mexicana y Trypanosoma cruzi en INDICASAT-AIP, resultando dieciséis extractos activos como antimalárico, diez extractos contra anti-Trypnosoma cruzi y siete extractos con actividad antileishmania siendo las plantas más activas en los tres ensayos y promisorias para análisis posteriores: las hojas de Licania kallunkiae, el tallo de Otoba novogranatensis y los tallos de Casearia sp., con un porcentaje de inhibición de crecimiento G% > 70.00 %
4.3. Actividad citotóxica antineoplásica
Se han evaluado los 302 extractos destanizados frente a las tres líneas celulares cancerosas humanas (NCI-MCF-7, NCI-H-460 y NCI-SF-268) resultandos once extractos activos: Erythroxylum sp., Enterolobium schomburgkii, Otoba novogranatensis, Hymenea
courbaril, Rollinia sp., Casearia carymbosa, Miconia argentea, Erytrina fusca, Rauwolfia littoralis, Vouarana guianensis y Virola sp., con GI50 < 7 μg/ml. Además, se han evaluado 316 extractos etanólicos al 95% en las mismas líneas celulares, resultando cuatro extractos más activos con una con GI50 < 8 ug/mL: Garcinia madruno, Inga sapindoides, Casearia sp., y Castilla elastica.
4.4. Actividad inhibitoria de Acetilcolinestersas
En los ensayos autobiográficos de inhibición de la actividad de las enzimas acetil- y butirilcolinesterasa los extractos mostraron actividad a una concentración de 100 µg y como control positivo se utilizó la Galantamina.
4.4.1. Se evaluaron 302 extractos destanificados en el ensayo de inhibición de acetilcolinesterasa, resultando 191 activos. De éstos 10 extractos resultaron ser selectivos en inhibir a la enzima acetilcolinesterasa. siendo los más promisorios: Garcinia madruno,; Ziziphus mauritiana, Erythrina fusca, Blakea herrerae, Guapira costaricana, Hortia colombiana, Tetrochidium sp., Pithecellobium hymeneaifolium, Pteridophyta y Psychotria capitata.
4.4.2. Se han ensayado 302 extractos destanizados en el ensayo de inhibición de butirilcolinesterasa. De estos 167 extractos resultaron activos y 3 demostraron ser selectivos al inhibir a la enzima butirilcolinesterasa, siendo los más promisorios: Pachira acuática, Licaria sp. y Warszewiczia coccinea.
4.4.3. Se han evaluado 350 extractos etanólicos en el ensayo de inhibición de acetilcolinesterasa, resultando 167 activos. De estos 15 extractos resultaron ser selectivos en inhibir a la enzima acetilcolinesterasa, siendo los más promisorios: Matayba sp., Cordia bicolor, Tetrochidium sp., Casearia corymbosa, Hymenea courbaril, Attalea butyracea, Bellucia pentamera, Indigofera suffruticosa, Machaerium sp, Bursera tomentosa, Garcinia madruno, Alysicarpus vaginalis, Dioclea megacarpa y Talisia nervosa.
4.4.4. Se han ensayado 350 extractos etanólicos en el ensayo de inhibición de butirilcolinesterasa. De estos 211 extractos resultaron activos y 7 demostraron ser selectivos en inhibir la enzima butirilcolinesterasa, siendo los más promisorios: Rauvolfia littoralis, Nectandra sp., Neptunia sp., Piper sancti-felicis, Chamaecrista sp., Dussia atropurpurea y Elaeagio nitidifolia.
El Cuadro No. 2. Muestra los Extractos de plantas activos en los diferentes bioensayos del proyecto. Activos.
5. Aislamiento y caracterización de los compuestos bioactivos
El fraccionamiento bioguiado de las hojas de Homalomena. wendlandii ha permitido el aislamiento de y caracterización de 4 nuevos compuestos reportados por primera en la literatura : 2-octanoil-1,3- dihidroxibenceno-4-(2-buten-1,3-dihidroxibenzeno) (1), 2- octanoil-1,3-dihidroxibenzeno (2), 2-hexanoil-1,3- dihidroxibenzeno (3), y 3,6-bis- benzo[1,3]dioxol-5-il-4-hidroxi-tetrahidro-furo[3,4-c]furan-1-ona (4) denominado (4- hidroxiaptosimon). Además, se han aislados otros compuestos conocidos :(1S,2S)-1,2,3- trihidroxi-1-(3,4-metilenedioxifenil) propano, (+)-aptosimon, sesamina de la misma planta. El compuesto 1 y 1a mostraron una GI50 3,3, 5.8 y 4.0 μg/mL y 5,1, 8.1 y 8.0 μg/mL respectivamente, siendo estos los responsables de la actividad citotóxica. (Sánchez et al 2012)
De la madera de la raíz de Morinda rojoc se aislaron los conocidos compuestos: damnacantal (1), nordamnacantal (2), damnacanthol (3), 3-hidroxi-2-formil-antraquinona
(4), 2-hidroxi-1-metoxi-antraquinona (5) y 2-hidroxi-3-hidroximetilantraquinona (6), siendo está la responsable de la actividad biológica con valores de
6.25 μg/mL y MDR= 6.25 μg/mL en el ensayo de actividad anti-tuberculosis.
De las hojas y tallo de Licania kallunkiae se han aislado el 4-metoxibenzaldehído, taxifolina y dihidromyricetina, que presentaron una
> 100 μg/mL en las pruebas antituberculosas.
De las hojas de Warszewiczia coccínea por fraccionamiento biodirigido se han aislado dos tripterpenos derivados del ácido ursólico: ácido 3β, 6β, 19α-trihidroxi-urs-12-en-28- oico y ácido sumaresinólico con actividad inhibitoria de acetilcolinestersasa. (Calderón et al 2009).
CONCLUSIONES
1. Se identificaron 1536 registros de plantas en el Parque Nacional Chagres (PNCH), 708 en el Parque Nacional General de División Omar Torrijos Herrera (PNGDOTH) y 293 en el Parque Nacional Sarigua (PNS), identificándose un total de 176 especies, 230 géneros pertenecientes a 95 familias.
2. Se seleccionaron 197 especies por su potencial farmacéutico con base en la búsqueda en la Base de Datos NAPRALERT.
3. Se prepararon 302 extractos destanificados y 400 extractos etanólicosal 95%.
Las hojas Licania kallunkiae y el tallo de Otoba novogranatensis demostraron actividad antituberculosa con IC50 < 6.12 µg/mL.
4. Quince extractos demostraron actividad citotoxicidad contra tres líneas celulares cancerosas humanas (NCI-MCF-7, NCI-H-460 y NCI-SF- 268).
5. Veinte y cinco extractos resultaron ser inhibidores selectivos de la enzima acetilcolinesterasa, mientras diez extractos 10 mostraron inhibición selectiva de la butirilcolinesterasa.
6. Se aislaron en total 17 compuestos, 4 de ellos nuevos reportes a la literatura y 13 conocidos, pero aislados por primera vez de plantas panameña.
Queda demostrado que la Flora de Panamá es muy rica y su potencia médico y económico aún queda por explotarse. La importancia de internacionalización de ciencia y colaboración internacional puede rendir beneficios a la joven ciencia panameña.
Se recomienda la formación de un Conglomerado de Bioprospección con fines farmacéuticos, nutracéuticos, agrícolas y cosméticos. El programa Nacional de Bioprospección requiere la participación de grupos multidisciplinarios, con diferentes actores en Academia e Industria. Se recomienda diseñar proyectos específicos y de larga duración.
En los Planes Estratégico Nacional de Ciencia y Tecnología 2010-2015 y 2016-2019 la SENACYT asigna una alta prioridad a este tema.
Es aconsejable involucrar empresas o instituciones académicas como de la Universidad de Kansas que posee la tecnología de cribado de alto rendimiento (HTS) y dianas de interés en el descubrimiento y desarrollo de moléculas líderes que pueden convertirse en drogas o productos de alto valor agregado y de interés para la industria farmacéutica, cosméticas y otras.
Agradecimientos
A la Secretaria Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT) por el financiamiento de los Proyecto Col 06-024 y FID07-008. A la ANAM (ahora Ministerio de Ambiente) por los permisos de colectas de Material vegetal y permisos de exportación a Kansas. Al Instituto Smithsonian de Investigaciones Tropicales por el acceso a RMN. Al Dr. José Luis López Pérez por los espectros de RMN de alta resolución realizados en la Universidad de Salamanca. y a la Organización de los Estados Americanos (OEA).
Nuestro agradecimiento a Profesora Emérito Mireya Correo exdirectora del Herbario de la Universidad de Panamá y Profesora Emérita de Botánica, por la identificación
taxonómica de plantas. y a Dra. Carmenza Spadafora de INDICASAT-AIP por la realización de los ensayos antiparasitarios. A la Dra. Rosario Rojas por la realización de los ensayos de actividad antituberculosa en el Laboratorio de Investigación y Desarrollo de Ciencia y Tecnología de la Universidad Peruana Cayetano Heredia de Lima, Perú.
DO y MPG agradecen a la Secretaria Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT) por el subsidio del Fondo del Sistema Nacional de Investigación (SNI).
REFERENCIAS
ANAM, (2002). Segundo Informe Nacional de Biodiversidad de Panamá. Autoridad Nacional del Ambiente.
Barthollt, W. L., Lauer, W. and Placke, A. (1996). Global Distribution of Species in Vascular Plants. Inc. Von Carl Troll, B. (Edit.) Erdkunde. Arch fur Wissenschaftliche, Boss Verlarg Kleve, pp 317-327.
Caballero-George C. and Gupta M. P. (2011) A quarter century of pharmacognostic research on Panamanian flora: a review. Planta Med. 77:1–14. doi: 1055/s-0030- 1271187
Calderón, A.I., Simithy, J., Quaggio, J., Espinosa, A., López-Pérez, J. L. and Gupta, M. P. (2009). Triterpenes from Warszewiczia coccinea (Rubiaceae) as inhibitors of acetylcholinesterase. Natural Products Communications 4 (10): 1323-1326.
Caviedes, L., Delgado, J. and Gilman, R. H. (2002). Tetrazolium Microplate Assay as a Rapid and Inexpensive Colorimetric Method for Determination of Antibiotic Susceptibility of Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol., 40, 1873-1874. doi: 10.1128/JCM.40.5.1873-1874.2002
Corbett Y., Herrera, L., González, J., Cubilla, L., Capson, T. I., Coley, P. D., Kursar, T. A., Romero, L. I. and Ortega-Barria, E. (2004). A novel DNA-based microfluorimetric method to evaluate antimalarial drug activity. Am. J. Trop. Med. Hyg., 70(2): 119–124.
Correa, M. D., Galdames, C., y de Staff, M. S. (2004). Catálogo de las Plantas Vasculares de Panamá. Publicación de ANAM. STRI y UP. Editorial Novoart. Panamá.
Cragg G. M. and Newman D. J. (2014). Plants as a source of new drugs from 1981-2014. J Nat Prod. 25: 79(3):626-61. doi.org/10.102/acs.jnatprod.5b01055.2016.02.07
D’Arcy, (1987). Flora de Panamá. Checklist and Index. Missouri Botanical Garden.
Gui, C., Miao, Y., Thompson, L., Wahlgren, B., Mock, M., Stieger, B. and Hagenbuch, B. (2008). Effect of pregnane X receptor ligands on transport mediated by human OATP1B1 and OATP1B3. Eur J. Pharmacol. 584(1): 57‐65. doi: 10.1016/j.ejphar.2008.01.042.
Gupta, M.P. (2004). Investigaciones Farmacognósticas sobre la Flora Panameña. Ann. Real Acad. Farm. 70, 839-883.
Hagenbuch, B. and Gui, C. (2008). Xenobiotic transporters of the human organic anion transporting polypeptides (OATP) family. Xenobiotica 38 (7-8): 778‐801. doi: 10.1080/00498250801986951 .
IMS Instute for Healthcare Informatics,100 IMS Drive, Parispanny, NJ 07054,http;//static.correofarmaceutico.com/docs/2014/informe_IMS.pdf. accesado 29 de agosto de 2018
Marston, A., Kissling, J., Hostettmann, K. (2002). A rapid TLC bioautographic method for the detection of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitors in plants. Phytochem. Anal. 13(1): 51-54. doi: 10.1002/pca.623
Monks, A., Scudiero, A., Johnson, G.S., Pauli, K.D. and Sausville, E.A. (1997). The NCI anti-cancer drug screen: a smart screen to identify effectors of novel targets. Anticancer Drug Des., 12(7): 533-541. PMID: 9365500
Olmedo, D.A., González-Medina, M., Gupta M.P. and Medina-Franco J. L 2017. Cheminformatic Characterization of Natural Products from Panama. Molecular Diversity,21(4): 779-789. doi: 10.1007/s11030-017-9781-4.
Rojas, R., Caviedes, L., Lock, O. and Gilman, R. H. In Recent Progress in Medicinal Plants; Govil, J. N., Ed.; Studium Press LLC: Houston, 2005; Vol. 13, pp 429-441.
Ree, I. K., van de Meent, M., Ingkaninan, K., Verpoorte, R. (2001). Screening for acetylcholinesterase inhibitors from Amaryllidaceae using silica gel thin-layer chromatography in combination with bioactivity staining. J. of Chromatogr. A 915(1-2): 217-223.
Sánchez, L.A., Olmedo, D., López-Pérez, J. L., Williams, T. D., y Gupta, M. P. 2012. Two New Alkylresorcinols from Homalomena wendlandii and Their Cytotoxic Activity. Natural Product Communications 7 (8): 1043-1046.
Torres-Mendoza, D., Ureña González, L. D., Ortega-Barrıa, E., Capson, T. L., Cubilla- Rios, L. J. (2003). Five new cassane diterpenes from Myrospermum frutescens with activity against Trypanosoma cruzi. Nat. Prod., 66, 928-932. doi: 10.1021/np030010o
UNEP, WCMC, CCAC, UICN. Presentado a la Convención de Biodiversidad. 109. pp
Wall, M.E., Wani, M. C., Brown, D. M., Fullas, F., Oswald, J.B.,Josephson, F.F., Thornton, N. M., Pezzuto, J.M., Beecher, W. W.,Farnsworth, N. R., Cordell, G. A., Kinghorn, A. D. (1996). Effect of tannins on screening of plant extracts for enzyme inhibitory activity and techniques for their removal. Phytomedicine 3(3); 281-285. doi: 10.1016/S0944-7113(96)80067-5
Williams C., Espinosa O. A., Montenegro H, Cubilla L, Capson T. L., Ortega-Barría E., Romero L. I. (2003). Hydrosoluble formazan XTT: its application to natural products drug discovery for Leishmania. Journal of Microbiological Methods 55: 813– 816. PMID: 14607426
