INTRODUCCIÓN

El tomate (Solanum lycopersicum L.) es una de las hortalizas más cultivadas en el mundo. Para el año 2019, en Colombia se registraron 4.677 hectáreas (ha) productivas de tomate en invernadero, en las que se produjeron 446.366 toneladas (t), con un rendimiento promedio de 95,44 t.ha^-1, mientras en campo abierto se reportaron 13.146 ha sembradas, produciendo 336.034 t, con un rendimiento promedio de 2,56 t.ha^-1 (Agronet, 2020). El cultivo ha conservado una tendencia nacional creciente, con un aumento en casi 300.000 toneladas cosechadas en los últimos 10 años (FAO, 2020)

El cultivo del tomate es afectado por diferentes tipos de estreses bióticos y abióticos, los cuales afectan la morfología, fisiología, bioquímica y regulación genética de las plantas (Kavroulakis et al., 2018; Kumar y Verma, 2018); entre los bióticos se encuentran los microorganismos fitopatógenos, que impactan directamente en el rendimiento del cultivo (Kumar y Verma, 2018; Wiesel et al., 2014). Muchos de estos microorganismos se hospedan en el suelo, destacándose el hongo Fusarium oxysporum (Dean et al., 2012) que causa pérdidas superiores al 60% (Villa-Martínez et al., 2015).

Fusarium oxysporum causa síntomas de marchitez vascular en más de 150 especies vegetales y cuenta con un amplio rango de formae speciales (f. sp.) según el hospedero que infecta. En tomate, se reporta a F. oxysporumf. sp. lycopersici (Fol), el cual permanece latente en el suelo mediante clamidosporas, hasta por 20 años y germinan en cercanía de la raíz del hospedero cuando las condiciones son propicias (Srinivas et al., 2019; Dean et al., 2012; Michielse y Rep, 2009; Di Pietro et al., 2003). Las hifas del hongo crecen y forman una intrincada red alrededor de los pelos radicales, ubicando los puntos de penetración en la unión de las células epidermales, atraviesa el córtex y avanza hasta el xilema, el cual usa para invadir la planta con la proliferación de sus hifas y microconidias. Estas estructuras fúngicas dentro de los vasos del xilema, sumadas a secreciones de polisacáridos y enzimas pectinolíticas (Figura 1) disminuyen o bloquean el flujo de agua y nutrientes en la planta (Srinivas et al., 2019).

Figura 1. Corte transversal del cuello de raíz de uchuva (Physalis peruviana) inoculada con F. oxysporum 20 días después de infección. Aumento de 100X. M, Micelio; V, Vasos del xilema sanos; Vi, va- sos del xilema infectados; G, Gomas; mc, microconidias. Técnica de tinción: contraste con safranina y fastgreen. (Tomado de: Villarreal, 2013)

La obstrucción de los haces vasculares ocasionados por Fol produce síntomas visuales similares a los observados en plantas bajo estrés hídrico severo (Chekali et al., 2011; Srinivas et al., 2019), presentan una coloración pardo-oscura en el tejido vascular, amarillamiento, marchitez foliar y finalmente la muerte. En condiciones de campo, la marchitez vascular es más evidente en las etapas de floración y llenado de frutos; y se ve favorecida por condiciones de altas temperaturas (28°C±2), pH bajo del suelo, uso de fertilizantes amoniacales y la aplicación frecuente de riego que mantenga el suelo por encima de capacidad de campo (Boix-Ruíz et al., 2015; Abbashar, 2003; Clayton, 1923).

En la relación planta patógeno, las plantas han desarrollado defensas constitutivas, tales como la acumulación de toxinas microbianas, además de mecanismos de defensa inducibles tras el reconocimiento del patógeno (Ramírez- Gómez y Rodríguez, 2012). Un aspecto clave de este sistema de respuesta inducida, es su activación tras la detección de moléculas genéricas conservadas en un amplio rango de microorganismos y patógenos (denominadas MAMPs o PAMPs de sus siglas en inglés Microbial or Pathogen associated Molecular Patterns, o elicitores) (Ádám et al., 2018; Vidhyasekaran, 2016; Jones y Dangl, 2006). Algunos ejemplos conocidos de elicitores o MAMPs incluyen las flagelinas, los lipopolisacaridos o el factor de elongación Tu de bacterias, la quitina de hongos, el péptido Pep13 de oomicetos y los hectaglucósidos, entre otros (Jones y Takemoto, 2004). Estas moléculas MAMPs son reconocidas por receptores de membrana (PRRs, por sus siglas en inglés Patern Recognition Receptors) presentes en todas las células vegetales, que han sido preservados evolutivamente y permiten la detección temprana de los patógenos.

La percepción de estas moléculas elicitoras desencadena una serie de cascadas de señalización que llevan a la activación de la respuesta de defensa que incluye, entre otros, la generación rápida de especies reactivas de oxígeno, la producción de fitohormonas señalizadoras (ácido salicílico, ácido jasmónico y etileno), el refuerzo de la pared celular (lignificación, deposición de calosa), la síntesis de compuestos antimicrobianos (fitoalexias y otros metabolitos secundarios) y la inducción de genes de defensa (muchos de ellos codifican proteínas con actividad antimicrobiana) (Maqsood et al., 2020; van Loon et al., 2006). Otro concepto clave, es que esta respuesta de defensa es general y no específica frente al agente invasor, confiriendo la capacidad de inmunizar a la planta frente a un amplio espectro de patógenos.

En las plantas existe otra respuesta de defensa inducible, activada por el reconocimiento específico de moléculas efectoras del patógeno, a través de proteínas de resistencia de la planta, denominada inmunidad mediada por efectores (ETI, Efector-Triggered Immunity) o resistencia específica (Andersen et al., 2018; Boller y Felix, 2009). Esta respuesta se manifiesta usualmente asociada a la respuesta hipersensible (HR, Hypersensitive Response) (Walters, 2015; Wiesel et al., 2014; Henry et al., 2012; Jones y Dangl, 2006), caracterizada por la formación de lesiones necróticas en el punto de infección (Walters, 2015). Aunque es activada por un mecanismo de reconocimiento más específico, la respuesta de defensa específica es similar a la basal, con las principales diferencias en la amplitud y el tiempo de inducción de los procesos defensivos. Además de la respuesta de defensa local, los tejidos atacados son capaces de generar señales móviles de alerta que activan una respuesta de defensa sistémica en tejidos distantes al foco de infección (Shah, 2009). Esta respuesta sistémica es duradera y de amplio espectro.

Existen dos tipos de respuesta sistémica, la denominada SAR (del inglés, Systemic Acquired Resistance) desencadenada por el ataque de patógenos y dependiente de la acumulación de ácido salicílico, y la ISR (del inglés, Induced Systemic Resistance) desencadenada por la colonización de las raíces por microorganismos benéficos del suelo y dependiente de la acumulación de las hormonas ácido jasmónico y etileno (Andersen et al., 2018; Pitzschke et al., 2009; Shah, 2009). Estas respuestas sistémicas pueden ser inducidas por diversos compuestos sintéticos tales como el INA (2,6-dichloroisinicotinic acid) o el BTH (S-methyl venzo-1,2,3- thiadiazole-7-carbothiate). En general, se considera que durante la respuesta de defensa sistémica, las plantas están sensibilizadas para la activación rápida y fuerte de las acciones de defensa (efecto priming), más que presentar una inducción constitutiva de los mecanismos de defensa que supondrían un costo energético importante para la planta (Beckers y Conrath, 2007).

En tomate, se han identificado al menos 65 genes R que reconocen patógenos virulentos (Chaudhary y Atamian, 2017). Esta información ha permitido el desarrollo de híbridos de tomate tolerantes a Fol. La respuesta bioquímica y molecular de la interacción tomate-Fol, y del efecto de las estrategias de manejo que se han implementado, ha sido ampliamente estudiada, sin embargo, es poco lo que se ha profundizado en los efectos sobre los rasgos fisiológicos del tomate durante esta interacción. En las siguientes secciones se discutirán y revisarán algunos de los parámetros fisiológicos, bioquímicos y moleculares que son alterados durante la interacción hospedero-patógeno, y las respuestas activadas por la planta.

MECANISMOS FISIOLÓGICOS DE LA RESPUESTA DE LA PLANTA A Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici.

Déficit hídrico: uno de los síntomas más claros y visibles que se producen durante la infección por Fol es la pérdida de turgencia en las hojas, además de la defoliación y clorosis típicos de un déficit hídrico severo. El patógeno ingresa desde las raíces, hasta alcanzar los haces vasculares (Yadeta y Thomma, 2013). Las microconidias e hifas del hongo dentro del xilema, sumadas a secreciones de polisacáridos y enzimas pectinolíticas disminuyen el potencial hídrico en las hojas y los tallos (Srinivas et al., 2019; Duniway, 1971) como resultado de la obstrucción en los haces vasculares, sumado a la inyección de moléculas efectoras que bloquean la defensa de la planta y toxinas que generan daño celular. En plantas de tomate infectadas con Fol se han observado reducciones de hasta 2,6 veces en el potencial hídrico y de 18% en el CRA (Contenido Relativo de Agua) a los 31 días después de inoculación (ddi) (Nogués et al, 2002); además, pueden reducir el flujo de agua en la planta hasta en un 95%, causando cierre estomático y reducción en la tasa de transpiración (Walters, 2015). Duniway en 1971, encontró un aumento cercano al 50% en la resistencia al movimiento de agua en plantas infectadas con Fol (10-16 ddi), pero turgentes a simple vista; mientras que en plantas infectadas y con síntomas de marchitez, el incremento fue del 100%. Además, las lesiones generadas por el patógeno en su ingreso hasta el xilema también contribuyen en la obstrucción de los haces vasculares (Brodersen y McElrone, 2013).

Conductancia estomática: La conductancia estomática entendida como la medida de la velocidad de paso de CO₂ o vapor de agua a través de los estomas de una hoja, se relaciona con la apertura estomática en respuesta a la disponibilidad de agua desde las raíces (Azcón-Bieto y Talón, 2008). Los grados de apertura o cierre estomático están mediados por la concentración de ABA, y la producción de MAPKs (proteínas quinasas activadas por mitógenos), ROS (del inglés, reactive oxygen species) y de óxido nítrico (NO), que se pueden generar en respuesta ante eventos de estrés biótico y abiótico (Qi et al., 2018). La restricción en el movimiento de agua a través del xilema causada por Fol, genera en la planta un desbalance hídrico que induce en ella el cierre estomático para evitar la pérdida de agua (Nankishore y Farrell, 2016). El cierre estomático ocasionado por la infección, parece ser uno de los factores que más afecta la asimilación de CO₂, además de correlacionar con disminuciones en el potencial hídrico de la hoja de tomate (Nogués et al., 2002). De acuerdo con Lorenzini et al., (1997), la conductancia estomática es uno de los primeros parámetros afectados en la interacción tomate-Fol después de siete días de infección se empieza a reducir dicho parámetro, alcanzando valores hasta de un 50% de disminución (Akhter et al., 2015).

Contenido de clorofilas: la clorofila es responsable de la absorción de la luz dirigida a la fotosíntesis, por lo cual, la disminución en el contenido o cambios en la proporción de clorofilas a y b, supone una alteración fisiológica en las plantas de tomate (Marín-Ortiz, Gutierrez-Toro, Botero-Fernández, y Hoyos- Carvajal, 2020). Varios autores han encontrado que Fol reduce el contenido de clorofilas totales (a y b) en plantas de tomate entre los 4 y los 30 ddi (Maqsood et al., 2020; Zehra et al., 2017; Pshibytko et al., 2006; Lorenzini et al., 1997).

Se considera que uno de los principales factores en la disminución de clorofilas se debe a que el estrés hídrico por el bloqueo vascular, causa cierre estomático y consecuentemente puede ocurrir fotorrespiración, acumulación de ROS, y daño irreversible a los cloroplastos (Singh et al., 2017). Se ha comprobado que el ácido fusárico, una de las principales toxinas producidas por Fol (Singh et al., 2017; Maina et al., 2008), funciona como factor de patogenicidad y causa trastornos como hiperpolarización de membranas (celulares y tilacoidales), pérdida de electrolitos, disminución en la síntesis de clorofilas y peroxidación lipídica (López-Díaz et al., 2017; Singh y Upadhyay, 2014;Jiao et al., 2013; Samadi y Behboodi, 2006). Por otro lado, se ha reportado previamente que bajos niveles de magnesio en la hoja debido a la disminución en la toma de nutrientes por el bloqueo del sistema vascular, ralentizan el proceso de síntesis de clorofila, dándose así una descompensación entre la degradación y síntesis de nuevas clorofilas (Dehgahi et al., 2015).

Fotosíntesis: Varios estudios han demostrado que la infección por Fol en plantas de tomate produce reducciones en fotosíntesis neta y en variables relacionadas con la eficiencia fotosintética, tales como transpiración y actividad estomática, como consecuencia del déficit hídrico y la escasez de nutrientes (Maqsood et al., 2020; Pinheiro y Chaves, 2011; Chaves et al., 2009; Nogués et al., 2002). Plantas de tomate infectadas con Fol después de 14 días de infección, presentaron un decrecimiento significativo de la fotosíntesis neta, condición que causó un impacto negativo en el funcionamiento de los pigmentos fotosintéticos y la actividad del fotosistema II (PSII), dando como resultado lesiones cloróticas en las hojas (Lorenzini et al., 1997; Maqsood et al., 2020)

El desarrollo de clorosis en las hojas de plantas afectadas por Fol, se debe en parte al avance del patógeno por los haces vasculares y a la circulación del ácido fusárico hacia las hojas. Tales síntomas pueden observarse en tejidos distantes (hojas superiores) al punto de avance de la infección (Dong et al., 2014; Maina et al., 2008). En este sentido, Singh et al., (2017), concluyeron que la alteración en el aparato fotosintético en hojas de tomate, es consecuencia del estrés oxidativo causado por el daño que el ácido fusárico provoca en las membranas celulares y tilacoidales; en sus experimentos obtuvieron reducciones hasta del 60% en la fotosíntesis neta de las hojas después de 4 horas de tratamiento con ácido fusárico, además observaron una degradación de pigmentos fotosintéticos, acumulación de H O y peroxidación lipídica.

Durante la infección por Fol se presentan afectaciones directas sobre los procesos fotosintéticos de carboxilación y fijación del CO₂, así como en la actividad de enzimas relacionadas con el ciclo de Calvin. Tales afectaciones son, en parte, consecuencia del descenso en los valores de conductancia estomática y las disminuciones en la concentración de clorofilas que afectan procesos lumínicos de la fotosíntesis (Walters, 2015). Pshibytko et al., (2006) hallaron una disminución en la actividad de la ribulosa- 1,5-bifosfato carboxilasa/oxigenasa (RuBisCO) durante la infección por Fol. Además, Nogués et al., (2002) encontraron que la enfermedad puede reducir hasta en un 25% la conductancia estomática, disminuir la fotosíntesis neta, la velocidad de carboxilación de la RuBisCO y la capacidad de regeneración de la ribulosa-1,5-bifosfato (RuBP). Algunos patógenos incluyendo Fol son capaces de alterar la expresión de genes relacionados con la fotosíntesis reduciendo los componentes esenciales en el complejo captador de luz y de fijación de carbono (Huot et al., 2014).

Fluorescencia de la clorofila: Las clorofilas, y en menor medida los carotenoides, son pigmentos vegetales responsables de la absorción de fotones de luz usados en los procesos de conversión de energía lumínica. Estos pigmentos se encuentran inmersos dentro de las proteínas fotosintéticas formando complejos pigmento-proteína, conformados por el fotosistema II (PSII), el fotosistema I (PSI), asociados a sus respectivas antenas LHCI y LHCII (del inglés, Light Harvesting complexes) y el complejo citocromo b6f (Azcón-Bieto y Talón, 2008). Cuando la clorofila absorbe el fotón de luz, este puede ser dirigido a tres procesos, la producción de ATP a través de la cadena de transporte de electrones o disipación fotoquímica (pQ), la reemisión de luz a una longitud de onda mayor que es el fenómeno conocido como fluorescencia y la desviación de los fotones como emisión de calor o disipación no fotoquímica (NPQ).

La fluorescencia de la clorofila se usa para determinar el estado de distribución de la energía lumínica y la eficiencia cuántica del PSII. Por la sensibilidad de este fotosistema, la fluorescencia de la clorofila ha sido utilizada como un indicador de estrés en plantas, incluyendo tomate (Wang et al., 2018; Baker, 2008; Maxwell y Johnson, 2000). Los principales indicadores de la fluorescencia son: la Fv/Fm (máxima eficiencia cuántica fotoquímica del PSII) que indica la cantidad de fotones absorbidos por el PSII para la reducción de la plastoquinona A cuando todos los centros de reacción están abiertos; la disipación fotoquímica (qP) que indica la capacidad de transmitir los electrones desde el PSII hacia el PSI para producir ATP y la eficiencia fotoquímica del PSII (Y(II)) que revela la capacidad de usar la energía captada en la fase fotoquímica de la fotosíntesis (Melgarejo et al., 2010).

La reducción en los parámetros de fluorescencia es gradual según el progreso de la marchitez por Fusarium. Lorenzini et al., (1997) y Maqsood et al., (2020), evaluaron diferentes parámetros fotosintéticos en plantas infectadas con Fol y encontraron reducciones en los valores de Fv/Fm de 5% y 8,4%, a los 14 ddi, lo cual atribuyeron a una disminución en la fluorescencia variable y una alteración en el PSII. De igual manera Maqsood et al., (2020), observaron reducciones en Y(II), qP y ETR (transporte de electrones tilacoidal) de 15%, 11,7% y 8,8%, respectivamente. En otro estudio realizado por Pshibytko et al., (2006) los valores de Fv/Fm disminuyeron un 11%, los valores de Y(II) un 30% , y qP un 13%; mientras los valores de NPQ aumentaron el doble en plantas infectadas con Fol. Los autores atribuyeron esta disminución a diferentes fenómenos ocurridos durante el proceso de infección, tales como, la dificultad en la toma de agua, el déficit de nutrientes y la acción de las micotoxinas licomarasmina, ácido fusárico y vasinfuscarina. En otros trabajos realizados donde se infectaron plantas de tomate con Fol, Nogués et al., (2002) encontraron, después de 25 días de infección, una reducción en los valores de Y(II) del 50%, y disminuciones para Fv´/Fm´ y qP en un 27 y 28%, respectivamente. Dada la afectación tardía de estos parámetros, los autores consideran que son la consecuencia de una disminución en la asimilación de CO₂ en las hojas. La disminución en Y(II) es atribuida a una baja en el transporte de electrones durante la fase lumínica de la fotosíntesis, la cual puede deberse a una reducción en la demanda de NADPH+ y ATP en la fase oscura de la fotosíntesis (Dehgahi et al., 2015; Nogués et al., 2002).

Dada la sensibilidad de la fluorescencia de la clorofila ante eventos de estrés y la relación que existe entre este proceso y las etapas de absorción y conversión de la energía lumínica como la fotólisis del agua, el transporte de electrones y la síntesis de ATP, esta variable permite evaluar el estado de la fotosíntesis de la planta (Goltsev et al., 2016; Melgarejo et al., 2010). Además, según Wagner et al., (2006), la fluorescencia de la clorofila también puede ser usada como un indicador del marchitamiento por Fusarium en tomate, haciendo uso de la correlación inversamente proporcional entre el índice de severidad de la enfermedad y los valores de Y(II).

Varios estudios han demostrado el impacto sobre la actividad fotosintética de la planta de tomate generado por las infecciones de F. oxysporum, con reducciones hasta del 85% en las tasas de asimilación neta. En estos estudios también fue posible observar alteraciones en el estado hídrico de la planta, con disminuciones del 18% en el CRA, reducciones en la conductancia estomática que van desde el 65% hasta el 86%, afectaciones en la transpiración con decrecimiento hasta del 78% y descenso en el uso eficiente del agua (Maqsood et al., 2020; Pshibytko et al., 2006; Nogués et al., 2002; Lorenzini., 1997). Todo lo anterior, tiene como consecuencia un impacto negativo sobre la acumulación de biomasa en la planta.

El crecimiento de las plantas se ve afectado por un desbalance que se presenta en las vías de señalización hormonal a causa del estrés biótico. Durante la respuesta de defensa se activan, entre otras, las vías de señalización del ácido salicílico y ácido jasmónico que pueden interferir con otras vías hormonales de crecimiento como las mediadas por auxinas, giberelinas y brasinosteroides, necesarias en diferentes procesos de crecimiento y desarrollo (Huot et al., 2014). Por otro lado, la baja síntesis de azúcares debida a las reducciones en las tasas de asimilación neta y la demanda de las fuentes de carbono; y de la asimilación de hexosas por parte de los patógenos principalmente en la fase biótrofa, impactan negativamente el crecimiento de las plantas (Dehgahi et al., 2015; Berger et al., 2004). De hecho, el efecto de Fol sobre parámetros de crecimiento de la planta de tomate, se ha constatado en varios estudios, demostrando que hay una reducción significativa en la altura de la planta, área foliar y la masa fresca y seca (Constantin et al., 2019; Nogués et al., 2002).

MECANISMOS BIOQUÍMICOS DE LA RESPUESTA DE LA PLANTA A PATÓGENOS

Respuesta oxidativa: los procesos de producción de ROS como el peróxido de hidrógeno (H₂O₂), el anión superóxido (O-₂), y el radical hidroxilo (-OH), son constantes y dinámicos como resultado de procesos metabólicos que requieren transporte de electrones. Estas moléculas se producen en cantidades relativamente bajas y las plantas cuentan con un sistema antioxidante muy eficaz conformado por pigmentos, moléculas y enzimas antioxidantes que reducen rápidamente las ROS para evitar que causen daños en el sistema (Tripathy y Oelmüller, 2012). La producción de ROS se activa también en la respuesta local frente a microorganismos biótrofos, contribuyendo en la aparición de la respuesta hipersensible. En condiciones de estrés, se activan diversos mecanismos de defensa para mantener el equilibrio oxidativo, principalmente del sistema antioxidante (Figura 2). Además, las ROS son mensajeros secundarios que participan en la activación de diferentes cascadas de señalización y la expresión de genes de defensa, relacionados con respuesta sistémica de la planta frente al patógeno (Tripathy y Oelmüller, 2012; Fraire-Velázquez et al., 2011). Existen dos tipos de mecanismos para disipar el daño oxidativo causado por ROS, el sistema no enzimático (aminoácidos, ácido ascórbico, polifenoles, antocianinas, carotenoides, glutatión, chalconas, tocoferoles, entre otros), y el sistema enzimático (peroxidasa, ascorbato peroxidasa, catalasa, glutatión reductasa, superóxido dismutasa, entre otras) (Latowski et al., 2010; Melgarejo et al., 2010)

Figura 2. Respuesta oxidativa de las plantas frente a estrés biótico. El sistema antioxidante de la planta posibilita la regulación de los niveles de ROS (Adaptado de: Latowski et al., 2010).

El hongo Fol posee micotoxinas que inducen una alta producción de ROS a nivel celular (Singh et al., 2017). La activación rápida del sistema antioxidante por parte de la planta de tomate aumenta la capacidad de la planta para resistir la enfermedad; varios estudios han encontrado que plantas infectadas por Fol incrementaron significativamente la acumulación de H₂O₂, acompañada de una baja actividad del sistema antioxidante; mientras que, plantas con altos niveles de actividad enzimática antioxidante presentaban mayor resistencia a la enfermedad (Singh et al., 2020; Jayamohan et al., 2018; Basco et al., 2017). Así mismo, Maqsood et al., (2020), observaron aumentos en la concentración de malondialdehido (MDA), H₂O₂ y prolina; y una baja actividad antioxidante en plantas de tomate susceptibles a Fol.

Las enzimas antioxidantes peroxidasa (POX), polyphenol oxidasa (PPO), phenylalanine ammonialyasa (PAL) y superóxido dismutasa (SOD), están involucradas en una extensa red de defensa de las plantas ante agentes patogénicos. POX es una glicoproteína que se oxida en presencia de H₂O₂ y que además está involucrada en diferentes reacciones redox en la membrana plasmática, metabolismo del etileno y modificaciones de la pared celular y biosíntesis de lignina. PPO es una enzima que cataliza los radicales O₂, e incrementa la actividad antimicrobiana (Narasimhamurthy et al., 2019).

Plantas de tomate infectadas con Fol dependen de la capacidad de activar efectivamente su sistema antioxidante, a través de las enzimas APX (ascorbato peroxidasa), SOD, PPO y CAT (catalasa); para contrarrestar las cascadas oxidativas activadas por la respuesta al patógeno y disminuir los daños causados por ROS (Jayamohan et al., 2018). Estas enzimas antioxidantes están relacionadas con diferentes mecanismos de inducción de resistencia en plantas de tomate contra Fol (Singh et al., 2020; Mandal et al., 2009)

Cuando se presentan eventos de estrés abiótico como sequía, inundación, salinidad, temperaturas extremas, radiación UV y metales pesados, pero principalmente ante un estrés hídrico, las plantas buscan ajustar su potencial osmótico para mantener la turgencia y volumen celular, y de esta manera garantizar un continuo funcionamiento del aparato fotosintético.

Este ajuste en el potencial osmótico se realiza mediante la síntesis y acumulación de solutos en la vacuola, tales como la prolina, un metabolito que funciona como agente osmótico u osmoprotectante junto con la glicin-betaína, ectoína y los azúcares (fructosa, sacarosa, mioinositol, trehalosa y fructanos) (Yang et al., 2011; Ashraf y Foolad, 2007). La prolina es además una de las moléculas que protege y estabiliza el ADN, las membranas y las proteínas de los daños causados por ROS en respuestas oxidativas; (Choudhary y Varma, 2016; Ben Rejeb et al., 2014). De esta manera, el aumento en el contenido de prolina en las plantas se considera como un indicador de la capacidad de tolerar eventos de estrés abiótico (Freitas De Campos et al., 2011; Yang et al., 2011; Arbona et al., 2010), dadas las funciones que posee la prolina como osmolito compatible y agente antioxidante (Freitas De Campos et al., 2011).

En la interacción Fol-tomate, la prolina puede funcionar como indicador de estrés. Alsamir et al., (2017) y Soliman y El-Mohamedy, (2017) encontraron en ambos trabajos una relación directa entre la severidad de la enfermedad y el contenido de prolina, en cuyo caso, su acumulación puede no ser suficiente para proteger los sistemas dañados por la respuesta oxidativa inducida por el patógeno. Por otro lado, Zehra et al., (2017) observaron que plantas infectadas y con menor mortalidad por Fol, acumularon mayores cantidades de prolina. Los diferentes estudios sugieren que la prolina de forma individual no disminuye el estrés oxidativo de plantas enfermas, sino que actúa conjuntamente con el resto del sistema antioxidante.

METABOLITOS SECUNDARIOS EN LA RESPUESTA A PATÓGENOS VASCULARES

Las plantas también sintetizan gran cantidad de metabolitos secundarios implicados en la respuesta de defensa. Existen tres tipos principales de metabolitos secundarios: los compuestos fenólicos, los terpenos y los compuestos que contienen Nitrógeno/Azufre, los cuales están involucrados además en diferentes procesos de crecimiento y desarrollo. Los metabolitos secundarios aumentan su producción y se activan tras la detección de MAMPs por parte de la planta, además algunos estudios sugieren que la mayoría de los metabolitos secundarios poseen características antifúngicas (Zaynab et al., 2018).

Los fenoles y flavonoides constituyen un gran grupo de fitoquímicos y juegan un papel importante en la defensa frente a la radiación UV y enfermedades. Los fenoles cambian la permeabilidad celular de los microorganismos y causan cambios estructurales y funcionales de las proteínas de membrana, lo que resulta en alteraciones del gradiente de pH, el sistema de producción y conservación de ATP, las enzimas de membrana y la utilización del sustrato para la producción de ATP. Por ejemplo, la α-tomatina una saponina presente en plantas de tomate, activa proteínas-G y fosfotirosina- kinasas, las cuales se unen a la membrana celular llevando al aumento en la producción de ROS y la elevación de Ca+2 en defensa ante infecciones de F. oxysporum (Ito et al., 2007). Altos contenidos de fenoles, así como una alta actividad de la enzima PPO se han relacionado con inducción de resistencia en plantas de tomate, y una consecuente disminución de la severidad en plantas infectadas por Fol (Manokaran y Jambhulkar, 2016).

EL PAPEL DE LAS FITOHORMONAS EN LA REGULACIÓN DE LAS INTERACCIONES PLANTA PATÓGENO

Los procesos de respuesta de defensa de las plantas frente a diferentes condiciones de estrés comprenden mecanismos moleculares y bioquímicos complejos que desencadenan respuestas fisiológicas en la planta (Atkinson y Urwin, 2012). El sistema de defensa en las plantas es regulado por una intrincada red de señalización en el que las fitohormonas, principalmente el ácido salicílico (AS), ácido jasmónico (AJ) y el etileno (ET), le confieren a la planta la capacidad de regular la activación de los sistemas de defensa ante diferentes agentes estresantes (Pieterse et al., 2009). Tras la detección de la condición de estrés, las fitohormonas modulan la respuesta inmune como un sistema que se retroalimenta positiva o negativamente y mantiene su homeostasis en la planta (Couto y Zipfel, 2016). Las fitohormonas son pequeñas moléculas orgánicas requeridas en bajas concentraciones, para regular funciones como crecimiento, desarrollo, reproducción y respuesta de defensa (Huot et al., 2014).

Ácido salicílico (AS): El papel de esta hormona en la interacción planta-patógeno, se ha descrito principalmente en procesos de defensa local y sistémica frente a patógenos biótrofos y hemibiótrofos participando en la resistencia sistémica adquirida de la planta (SAR, del inglés Systemic Acquired Resistance). Además, esta hormona participa en el crecimiento, desarrollo y senescencia vegetal (Huot et al., 2014). La defensa mediada por AS puede activar o ser activada por MAPKs y finaliza en la activación de factores de transcripción para promover la expresión de genes relacionados con patogenicidad (genes PR) (Andersen et al., 2018).

Aplicaciones de AS a nivel foliar, son capaces de inducir resistencia sistémica frente a patógenos fúngicos y bacterianos (Narasimhamurthy et al., 2019; Mandal et al., 2009). Mandal et al., (2009) realizaron aplicaciones exógenas de AS en plantas de tomate y encontraron que las plantas tratadas con la fitohormona, y luego inoculadas con Fol, presentaron una importante reducción en la marchitez vascular y el amarillamiento foliar. Los autores concluyeron que esta reducción de la enfermedad indica una resistencia sistémica adquirida dependiente del AS.

Ácido jasmónico (AJ): es una hormona derivada de ácidos grasos, involucrada en procesos de defensa contra patógenos necrótrofos y daños mecánicos o por insectos. La vía de señalización del AJ antagoniza con la vía del AS reprimiendo su activación, lo que es usado por algunos patógenos biótrofos capaces de controlar para su beneficio las vías del AJ/ET, evitando de esta manera la expresión de la vía del AS para disminuir la capacidad de respuesta de la planta (Carvalhais et al., 2013; Martínez-Medina et al., 2013; Pieterse et al., 2012). El AJ y su versión metilada (Metil jasmonato- MeJA) más volátil y móvil, funcionan como molécula señal a nivel sistémico en la planta (Vidhyasekaran, 2016).

Aunque se asume que las vías del AS y el AJ son completamente antagónicas por activarse frente a biótrofos y necrótrofos, respectivamente, varios autores han encontrado que, en plantas de tomate, bajo la inducción por microorganismos benéficos (Trichoderma sp., hongos micorrizícos, bacterias, etc), el AJ y su derivado el MeJA, regulan los mecanismos de la respuesta de defensa de la planta frente a Fol, en una respuesta tipo ISR (del inglés, Induced Systemic Resistance) (Jogaiah et al., 2018; Zehra et al., 2017; Król et al., 2015; Nair et al., 2015).

Etileno (ET): es una hormona gaseosa que juega un papel importante en la respuesta inmune a través de una señalización sistémica y además induce la expresión de genes de defensa (Pieterse et al., 2012). Normalmente, el ET actúa de forma sinérgica con el AJ, aunque también se ha descrito su interacción con AS tanto de forma sinérgica como antagónica, dependiendo del patosistema (Dmitriev, 2003). Varios estudios han constatado la participación del ET en reacciones de susceptibilidad de plantas de tomate frente a Fol (Di et al., 2017; Francia et al., 2007; Lund et al., 1998), aunque otros estudios han demostrado lo contrario durante la inducción de ISR por microorganismos endófitos (Kavroulakis et al., 2007).

No hay una conclusión unánime en cuanto a las sinergias e interferencias hormonales en la interacción tomate - Fol. La compleja maquinaria hormonal activada por la planta en contra del patógeno, las condiciones ambientales o experimentales, la biología del patógeno y el genotipo del hospedero, pueden representar enormes variaciones en la intercomunicación hormonal de la planta que no permite generalizar conceptos. Por esto, es necesario profundizar en estudios bajo condiciones biogeográficas específicas y analizar cada caso separadamente. La descripción de algunos mecanismos transcripcionales, por los cuales se dan las intercomunicaciones hormonales en respuesta a F.oxysporum, y particularmente a Fol, se describen en la siguiente sección.

MECANISMOS GENÉTICOS DE DEFENSA DE LA PLANTA

En su interacción con microorganismos, las plantas continuamente se encuentran sometidas a presiones por parte de patógenos, sin embargo, poseen un mecanismo de respuesta complejo que les permite protegerse frente a los efectos nocivos de la invasión (van der Does et al., 2018). La co-evolución entre plantas y patógenos ha sido conocida como una carrera armamentista, donde las plantas desarrollan mecanismos de defensa mientras que los patógenos implementan estrategias para imponerse frente a la resistencia de las plantas (Stahl et al., 2000).

En algunos cultivos de hortalizas, se ha reportado resistencia de tipo monogénica frente a formas especiales de F. oxysporum(Michielse y Rep, 2009). Es así como bajo el concepto del modelo gen por gen, la resistencia de la planta depende de una interacción específica entre las proteínas codificadas por los genes de resistencia del huésped (R) y las que codifican los genes de avirulencia (AVR) del patógeno (Periyannan et al., 2017; Rep et al., 2004). De acuerdo con el modelo mencionado, los genes R determinan la especificidad del sistema de defensa en la planta (van der Does et al., 2018), codificando proteínas NLR (de NB and LRR containing protein) que son capaces de reconocer las proteínas efectoras del patógeno durante el proceso de infección en el huésped (Periyannan et al., 2017; Jones et al., 2016).

En la interacción entre tomate y Fol, se han identificado varios genes de Resistencia o genes I (Immunity), sin embargo, pese a que las plantas exhiben cierto grado de resistencia, no siempre el patógeno es controlado por completo (van der Does et al., 2018), como ocurre en este patosistema donde el hongo es capaz de colonizar y propagarse desde las raíces hasta el tallo antes de detener su invasión (Mes et al., 2000). Posterior al reconocimiento de Fol mediado por los genes I, se induce una respuesta de defensa en las células parenquimatosas adyacentes a los vasos xilemáticos, donde en lugar de una respuesta hipersensible se desencadenan respuestas como depósitos de calosa, acumulación de compuestos fenólicos y formación de tilosas y gomas en los vasos infectados (Takken y Rep, 2010).

En el caso particular de la marchitez por Fusarium en tomate, el patógeno Fol se clasifica en tres razas fisiológicas definidas, de acuerdo con su capacidad de infectar diferentes cultivares que poseen genes de resistencia I (García-Enciso et al., 2018; Takken y Rep, 2010). De esta manera, las interacciones compatibles o incompatibles son controladas por los genes de avirulencia en Fol y los genes de inmunidad (genes I) en tomate (Inami et al., 2012). Las variedades de tomate con resistencia a una o varias razas fisiológicas de Fol se han desarrollado a partir de la introgresión de genes de especies silvestres como Solanum pennellii y S. pimpinellifollium (van der Does et al., 2018; Chaudhary y Atamian, 2017). Estos cultivares mejorados pueden presentar resistencia a las razas 1, 2 o ambas, además en algunos casos se pueden ser resistentes a las tres razas del hongo (inlcuyendo la raza 3) (McGovern, 2015). Los tres efectores de Fol son reconocidos por los tres genes I de la planta (Rep et al., 2004).

Figura 3. Interacción de los genes AVR de Fol y los genes I en tomate (Adaptado de: García-Enciso et al., 2018).

Como se observa en la figura 3, los genes I, I-2 e I-3 confieren protección contra Fol raza 1 (que posee los genes AVR1, AVR2 y AVR3), Fol raza 2 (pérdida de AVR1, posee AVR2 y AVR3) y Fol raza 3 (pérdida de AVR1, contiene gen AVR2 con mutaciones puntuales y AVR3), respectivamente (Catanzariti et al., 2017; Inami et al., 2012; Takken y Rep, 2010). Adicionalmente, se ha reportado que la proteína codificada por el gen AVR1, tiene la capacidad de suprimir la resistencia mediada por los genes I-2 e I-3 (Houterman et al., 2008).

Además de los genes de resistencia mencionados, se han identificado los genes I-1 (que reconoce AVR1) e I-7, este último confiere resistencia a las razas 1, 2 y 3 de Fol y la resistencia no es suprimida por AVR1 (Gonzalez-Cendales et al., 2016), sin embargo, los mecanismos moleculares de esta resistencia no han sido descritos aún. Se ha reportado también, que las plantas con respuestas mediadas por los receptores extracelulares I e I-3 son más eficaces para restringir la propagación fúngica que las mediadas por el receptor intracelular I-2 (van der Does et al., 2018).

Por su parte, toda modulación de respuesta a nivel bioquímico y fisiológico en plantas tiene una base genética. En general, una de las vías de señalización mejor descritas es la red hormonal. Gran parte de la investigación es sobre el papel de las hormonas en la defensa frente a patógenos ha sido estudiada en plantas de Arabidopsis thaliana L. La descripción del mecanismo hormonal en esta planta y la confirmación en otros patosistemas de muchos de los supuestos encontrados allí, ha permitido generar un modelo de intercomunicación hormonal de la respuesta de defensa ante patógenos.

El modelo permite entender que cuando se activa la vía hormonal del AS, el gen NPR1 (NON EXPRESSOR OF PR GENES1) funciona como coactivador transcripcional de genes PR que desencadenan una respuesta de defensa frente a patógenos biótrofos, gracias a la transcripción de genes asociados a proteínas antimicrobianas (Pieterse et al., 2012). Uno de los genes PR más ampliamente estudiado es el PR1 (PATHOGEN RESPONSE1) que se expresa como respuesta a la síntesis y señalización por AS (Nobori et al, 2018; Saharan y Pal, 2016). Esta misma vía de señalización induce la expresión de otro gen denominado PAL (PHENYLALANINE AMMONIA LYASE), que codifica una enzima clave en una de las vías de síntesis de AS, a través del metabolismo de los fenilpropanoides y el incremento de contenidos fenólicos, para una respuesta de resistencia a enfermedades (Kiirika et al., 2013; Pusztahelyi, 2018; Sharif et al., 2018).

Las plantas de A. thaliana son susceptibles F. oxysporum f.sp. conglutinans (Focn), un microorganismo biótrofo. Las líneas transgénicas que expresan la enzima bacteriana silicato hidroxilasa (NahG), o plantas mutantes en el gen sid2 (del inglés, SA induction-deficient 2), no pueden acumular AS en su sistema. Ambas líneas, sobre-expresión de NahG y mutante sid2, presentan un incremento en la susceptibilidad al patógeno, lo que demuestra que el AS está involucrado en la respuesta de defensa a Focn (Di et al., 2017).

Como se mencionó anteriormente, las vías de señalización del AS y del AJ son fuertemente antagónicas, lo cual ha sido demostrados a través de la expresión del gen NPR1, activado en la ruta del AS y que regula negativamente la vía de señalización del AJ (Thaler et al., 2012). Sin embargo, recientes estudios encontraron una vía en la cual ciertas concentraciones de AS activan las proteínas receptoras NPR3 y NPR4 que a su vez interactúan con JAZ (parte del complejo represor de la síntesis de AJ), para inducir la síntesis de esta molécula (Pieterse et al., 2009). Este puede ser uno de los puntos de interacción en las respuestas simultáneas ante microorganismos biótrofos y necrótrofos (Liu et al., 2016;Pieterse et al., 2009).

Plantas de A. thaliana con insensibilidad al ET gracias a la mutación en el gen ETHYLENE INSENSITIVE2-1 (EIN2-1) y en el gen ETHYLENE RECEPTOR1 (ETR1-1) mostraron una reducción en la sintomatología de Focn (Di et al., 2017). Adicionalmente, la mutación en genes que tienen actividad en la ruta de biosíntesis del AJ tales como JASMONATE RESISTANT1 (JAR1-1) y ALLENE OXIDE SYNTHASE (AOS), así como en un gen involucrado en la percepción del AJ, CORONATINE INSENSITIVE1 (COI1), y en factores que regulan la transcripción en la ruta de señalización del AJ como MYC2, PFT1 y LBD20, dieron como resultado plantas más resistentes a Focn, comprobando que tanto el ET como el JA juegan un papel fundamental en la susceptibilidad de las plantas de A. thaliana ante Focn (Figura 4) (Di et al., 2017; Jia et al., 2013; Doares et al., 1995).

Figura 4. Modelo de la red hormonal en la activación de respuestas de defensa en Arabidopsis thaliana L., frente a Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans (Focn). Las barras truncadas representan regulación negativa. Las flechas representan regulación positiva. Adaptado de (Di et al., 2017).

Para entender el papel de estas hormonas en la interacción de F. oxysporum con plantas de tomate, se realizaron las mismas modificaciones genéticas descritas en el modelo de Arabidopsis, en plantas de tomate de variedades susceptibles a Fol. Usando plantas transgénicas de tomate que sobre expresan la enzima bacteriana NahG, se confirmó que el SA interviene positivamente en la defensa ante Fol. Los síntomas de marchitez vascular observados en plantas deficientes en acumulación de AS fueron más severos que en plantas control de la variedad susceptible. Estas observaciones fueron confirmadas a través de la detección de la inducción del gen marcador PR1a, el cual no fue expresado en las plantas transgénicas de NahG (Di et al., 2017).

Por otra parte, los trabajos realizados en A. thaliana para entender la vía de señalización del AJ en la defensa contra Focn, permitieron observar el papel que juega esta hormona en la expresión de síntomas de marchitez. Sin embargo, las mutaciones realizadas sobre los genes def1 y jai1 en plantas de tomate y expuestas a Fol, no muestran diferencias significativas en la severidad de los síntomas de la enfermedad, permitiendo suponer que esta hormona no tiene un efecto importante sobre la interacción (Di et al., 2017). El contraste de resultados en varios trabajos que han buscado entender el rol del AJ en la interacción de Fusarium con sus hospederos es evidente. Así como en la interacción tomate-Fol, Di et al, (2017), encontraron que esta hormona no tiene un rol importante en el desarrollo de la enfermedad, mientras otros investigadores han encontrado que algunas formas especiales de F. oxysporum sí muestran sensibilidad a esta vía de señalización, aumentando los síntomas de marchitez en las plantas hospedero. Tal es el caso de F. oxysporum f. sp. conglutinans (Foc), F. oxysporum f. sp. matthioli (Fom) y F. oxysporum f. sp. raphani (For), que sintetizan JA y lo usan como efector en su respectivo hospedero, aumentando la enfermedad y la infección en las raíces. Es importante mencionar que en este mismo trabajo se encontró que la infección por Fol no induce la producción de AJ (Cole et al., 2014). Por el contrario, en batata (Ipoemea batata), la infección con F. oxysporum f. sp. batatas(Fob) activa el factor de transcripción IbBBX24, que modula la transcripción de los genes JAZ-MYC, requeridos para la activación de la señalización por AJ, aumentando la resistencia ante el patógeno (Zhang et al., 2020).

Otros trabajos en plantas de tomate dan cuenta de la diversidad en la respuesta de defensa inducida por la vía del AJ frente a Fol. Por ejemplo, Jogaiah et al., (2018) demostraron que se indujo la expresión del gen PDF1 mediada por el biocontrolador Trichoderma virens, simultáneamente, a la activación de genes relacionados con el AS (PR1). Esta respuesta redujo la severidad de la enfermedad, confirmando que existe una participación importante por parte del AJ en la respuesta inmune de plantas de tomate frente a Fol, pero que se requiere mantener una interconexión con la vía del AS. Constantin et al., (2019) también observaron que plantas deficientes en la vía de señalización del AJ, fueron más susceptibles a Fol. Por otro lado, Król et al., (2015) aplicaron MeJA de forma exógena en plántulas de tomate y observaron un incremento en la síntesis de componentes fenólicos, así como en la concentración de AS, asociados a la disminución de la enfermedad por Fol.

Los hallazgos contrastantes en los diferentes trabajos sugieren que la intercomunicación hormonal para la respuesta a Fol es dependiente de condiciones específicas tanto del patógeno como del hospedero; y esto puede estar relacionado tanto con la agresividad de las diferentes cepas patogénicas, como con la base genética del hospedero que puede determinar su grado de susceptibilidad.

En A. thaliana, los factores de transcripción ERF (factores de respuesta a etileno) de la ruta de señalización del ET se activan tras la infección por F. oxysporum. En tomate, la expresión del gen PTI4, miembro de la familia de los ERFs, es inducida tras la infección con Fol. La inducción de PTI4 y ERF4, fue confirmada en plantas de tomate susceptibles a Fol, mientras que en plantas mutantes ACD, la expresión de estos genes fue muy baja. Las plantas ACD contienen la enzima ACCd que cataliza la degradación del ACC (precursor del ET). Bajo este panorama, la investigación alrededor del papel del ET en la defensa a Fol, fue complementada observando los síntomas de marchitez en plantas mutadas en el gen Nr, que otorga insensibilidad al ET, en las cuales no fue posible visualizar síntomas asociados a Fol. Estos resultados permitieron confirmar que la señalización inducida por ET es activada durante la infección por Fol y además necesaria para la expresión de síntomas (Di et al., 2017). Adicionalmente, al realizar la observación de la expresión de los genes PTI4 y ERF4 en las plantas transgénicas NahG (deficientes en acumulación de AS), se encontró que era menor que en las plantas control de tomate susceptibles a Fol, con lo que se demostró que la ruta del AS es necesaria para que se activen los genes PTI4 y ERF4 pertenecientes a la ruta de señalización del ET (Di et al., 2017).

El modelo propuesto por Di et al., (2017), de la red hormonal en la activación de respuestas de defensa en plantas de tomate frente a Fol, se muestra en la figura 5.

Figura 5. Modelo de la red hormonal en la activación de respuestas de defensa en tomate (Solanum lycopersicum) a Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol). Las barras truncadas representan regulación negativa. Las flechas representan regulación

CONCLUSIONES

La interacción tomate-Fol y la respuesta en fisiología y mecanismos genéticos de la planta se puede resumir en el modelo descrito en la figura 6. La primera parte del proceso es la invasión por Fol penetrando la epidermis y luego el córtex radical, hasta llegar al xilema (1). Sus estructuras crecen y se propagan ascendiendo por el xilema donde empieza a liberar micotoxinas como el ácido fusárico. La planta se defiende generando gomas y tilosas, lo cual, junto con las estructuras del hongo, bloquean los haces vasculares y restringen el flujo de agua, disminuyendo el potencial hídrico xilemático (2). Las limitaciones hídricas y la respuesta oxidativa generada por la presencia del patógeno y el ácido fusárico, inducen el cierre estomático, con la consecuente limitación en la toma de CO₂; esto disminuye la síntesis de ATP y NADPH, y causa la acumulación de un exceso de energía por falta de aceptores de electrones en el aparato fotosintético. En consecuencia, los centros de reacción se cierran y el exceso de energía es disipada en forma de calor y fluorescencia. El ácido fusárico que puede movilizarse hasta las hojas y los cloroplastos, la acumulación de energía, la producción de ROS por procesos metabólicos y de respuesta de defensa ocasiona cascadas oxidativas que, de no ser reguladas por el sistema antioxidante, generan daño en las membranas y en el aparato fotosintético (3). La modulación hormonal regula la resistencia o la susceptibilidad de la planta. En presencia de Fol, la planta de tomate aumenta su respuesta mediada por AS para inducir resistencia, mientras que el ET aumenta y se relaciona con la susceptibilidad. El rol del AJ no está suficientemente claro, pero es posible que interactúe con AS en parte de la respuesta de defensa. La severidad y extensión de todas las alteraciones mencionadas, puede llevar a muerte celular en los tejidos y la posterior muerte de la planta cuando la interacción tomate – Fol es compatible.

Figura 6. Modelo de las alteraciones fisiológicas en la interacción Tomate- Fol. 1) Invasión de la planta; 2) ascenso por los haces vasculares; 3) alteraciones estomáticas y a nivel de cloroplasto; 4) modulación hormonal. (Fuente propia)

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Información adicional

Conflicto de Intereses: Los autores declaran que es un trabajo original y no existió conflicto de intereses de ningún tipo en la elaboración y publicación del manuscrito.