INTRODUCCIÓN

Para mejorar las condiciones de crecimiento de la mi­croalga Chlorella vulgaris se han desarrollado diferen­tes proyectos, tales como la evaluación del crecimien­to desde varios tipos de fotobiorreactores (tipos placa plana y airlift). Sin embargo, no se ha llevado a cabo un análisis con respecto a la agitación. Por ello, esta investigación busca proponer e incluir este factor en el cultivo de Chlorella vulgaris, al ser una alternativa prometedora en procesos de biorremediación de CO2 que garantiza la mejor distribución de la microalga en el medio cultivo.

Teniendo en cuenta que las microalgas en fotobio­rreactores de placa plana poseen altas eficiencias fotosintéticas, pero al mismo tiempo presentan pro­blemas en el control de difusión de CO2 relacionados principalmente con la transferencia de masa (Soo & Chould-Gyun, 2003), la evaluación de la variable agi­tación resulta necesaria. El hecho de que la agitación se relacione con la transferencia afecta la disponibili­dad de CO2 para la microalga Chlorella vulgaris y, por lo tanto, la producción de biomasa en este tipo de fo­tobiorreactores.

Para la evaluación del parámetro agitación en este tipo de fotobiorreactores se hizo necesario evaluar el diseño de los difusores (tubo perforado) que involu­cran aspectos como cantidad de burbujas y diámetro de burbuja (Ladislav et al., 2010) desde la agitación neumática utilizada. Los aspectos antes menciona­dos fueron objeto de estudio en la presente investiga­ción, la cual se enfoca en el parámetro agitación de­bido a su efecto en la transferencia de masa, variable que afecta la disponibilidad de nutrientes e influye en un nivel de producción más elevado al proporcionar un suministro adecuado de CO2 a través de la interfa­ce cultivo-burbuja y la eliminación de O2 por genera­ción de turbulencia en el medio (St-Onge, 2013). Aun­que el parámetro agitación no ha sido considerado en otras evaluaciones, este es una variable condicionan­te en la producción de biomasa microalgal.

METODOLOGÍA

La cepa microalgal empleada en esta investigación es Chlorella vulgaris, la cual fue suministrada por el gru­po de investigación biotecfua de la Fundación Univer­sidad de América y se encontraba en medio líquido en tubos de ensayo, siendo un back up de la cepa pura previamente adquirida por otros grupos. Se utilizó como medio de cultivo, agua y el fertilizante agrícola foliar Foliagro en una proporción de 2:1000. El me­dio de cultivo fue usado desde la fase de incubación hasta el escalamiento al fotobiorreactor, el cual fue esterilizado a una temperatura de 120 °C durante 40 minutos previo a su uso.

La microalga se inoculó y se incubó implementando una incubadora que cumplía con las siguientes condi­ciones: temperatura óptima de 25 °C, fuente lumíni­ca de halógeno de 8W de color rojo y un fotoperiodo 12/1.

El escalamiento a partir del inóculo inició con un vo­lumen de 10 mL de microalga y 30 mL de medio de cultivo, al cual se le agregó 50 mL de medio de culti­vo hasta alcanzar un volumen de 500 mL. Posterior­mente, se agregó 100 mL de medio de cultivo hasta alcanzar 1 L y por último, 150 mL hasta alcanzar 3 L, tras lo cual se procedió con su escalamiento al foto­biorreactor de panel plano.

El desarrollo de esta investigación se enfocó en dos etapas: una fase preexperimental en la cual se selec­cionaron los diámetros de aspersor en los tubos di­fusores con respecto a las curvas de crecimiento, se­guida de una fase experimental en la que se evaluó el crecimiento al adicionar una mezcla de co2 y aire como fuente de agitación tras emplear los diámetros seleccionados.

Fase preexperimental

En esta fase se llevó a cabo la construcción de dos fo­tobiorreactores de panel plano en polimetil-metacri­lato (PMMA), los cuales contaban con un ducto des­gasificador y un termostato en su interior. La figura 1 muestra uno de los fotobiorreactores empleados.

Figura 1
Fotobiorreactor panel plano
Fuente: elaboración propia.

El dimensionamiento de los difusores implicó el cono­cimiento tanto del diámetro de los aspersores como el espaciamiento entre estos. Lo anterior se calculó mediante la ecuación 1, en la que se consideró la mis­ma longitud (0,392 m) y cantidad de aspersores.

[Ec. 1]

Los tubos difusores fueron elaborados en policloruro de vinilo (pvc) y se adicionaron a las láminas laterales del fotobiorreactor empleando silicona para vidrios. Estos tubos se cambiaban de forma manual conforme al diámetro con el cual se iba a experimentar. La figura 2 (izquierda) muestra las dimensiones del equipo y las características del tubo difusor (derecha).

Figura 2
Dimensiones del fotobiorreactor panel plano y los tubos difusores en metros (m)Fuente: elaboración propia.
Fuente: elaboración propia.

Por otra parte, la ecuación que permitió determinar si el equipo resultaba adecuado para el proceso fotosin­tético fue la relación superficie-volumen (ecuación 2) cuyas unidades son m-1 (Rubio-Fernández & Hernán­dez, 2016):

[Ec. 2]

El valor de la relación superficie-volumen cumplió con el rango entre 20 y 200 m-1 para la adecuación de luz, por lo que el equipo presentaba buen acceso a la luz, permitiendo que el inóculo realizara el proceso foto­sintético sin dificultades.

El montaje del sistema de la etapa preexperimental contaba con una bomba de aire marca Resun AC9904 de 4 salidas que se conectaba a un filtro de trompo mediante mangueras de 6 mm de espesor; este filtro permitió garantizar la esterilidad del aire que entraba al equipo. Luego, se conectó un manómetro Ritherm® 2 ½” que permitió conocer la presión del sistema, la cual se regulaba mediante un sistema de llaves ubica­das a la salida del manómetro. Las mangueras que sa­lían de estas llaves fueron conectadas a los extremos laterales del fotobiorreactor.

Se realizó el conteo celular de microorganismos en un microscopio marca BioBlue mediante una cámara Neubauer durante 15 días (para un mayor período de estudio) cada 24 horas para cada diámetro, obtenien­do 3 réplicas de cada diámetro. El número de células por mL se determinó mediante la ecuación 3, donde el volumen de la cámara es de 0,1 mm3 y los cuadran­tes totales son 25 (Hernández, 2014).

[Ec. 3]

Análisis estadístico

Las curvas de crecimiento de cada difusor fueron eva­luadas bajo un análisis de varianza (anova) de un fac­tor con el fin de conocer si existían diferencias signi­ficativas en las tasas de crecimiento celular como re­sultado de los diámetros del aspersor. Las hipótesis planteadas fueron las siguientes:

Hipótesis nula (Ho): no existe una diferencia signifi­cativa en las tasas de crecimiento por el cambio en el diámetro en los aspersores.

Hipótesis alterna (Ha): existe una diferencia significa­tiva en las tasas de crecimiento por el cambio en el diámetro en los aspersores.

La hipótesis nula fue aceptada utilizando como crite­rio de comparación el valor registrado de F con res­pecto al valor de F crítico a un nivel de significancia de 0,05. Por lo anterior, y como segundo tratamiento estadístico, se procedió a desarrollar la comparación entre parejas para simplificar los niveles (diámetros) y encontrar aquellos que afectaban la variable respues­ta (tasas de crecimiento) mediante la comparación del valor de la probabilidad de dos colas P (T <= t) y la probabilidad de la tabla anova.

Fase experimental

En esta fase se emplearon los diámetros de aspersor de 1 y 2 mm en los tubos difusores que fueron se­leccionados en la etapa preexperimental mediante la prueba t student.

Antes de iniciar la fase experimental se seleccionó una concentración de CO2 de 9 % co2 y 91 % aire.

El montaje del sistema de la parte experimental (figu­ra 3) involucró el mismo montaje de la parte preexpe­rimental, adicionando un cilindro de 6 m3 con mezcla (9 % co2 v/v) y una tarjeta K-33 ICB como sensor para verificar el porcentaje de co2 que entraba al fotobio­rreactor de panel plano.

Figura 3
Montaje del sistema experimental y dimensiones de las conexiones (m)
Fuente: elaboración propia.

Haciendo uso del sistema antes descrito, se llevó a cabo la agitación por períodos de 6 y 18 horas con mezcla y aire, respectivamente, manteniendo el cau­dal fijo mediante un regulador de flujo que manejaba un rango de 0 a 4 L/min.

Teniendo en cuenta que las microalgas muestran una gran dependencia respecto al pH, el cual varía con­forme a la cantidad de CO2 disuelto, este fue monito­reado mediante un potenciómetro marca Milwaukee (figura 4), que registró un valor máximo de 7,5. Para esta fase, el conteo celular se llevó a cabo en una cá­mara Neubauer durante 10 días para los diámetros de 1 y 2 mm, llevando a cabo 3 réplicas de cada uno. El conteo se realizó durante el tiempo de agitación con el cilindro de CO2. El número de células por mL se de­terminó nuevamente con la ecuación 2, incorporando esta vez el factor de dilución debido a que se realiza­ron diluciones seriadas con un factor de 1:10.

Figura 4
Potenciómetro marca Milwaukee
Fuente: elaboración propia.

Haciendo uso de parámetros poblaciones como la velocidad específica de crecimiento, también cono­cida como tasa de crecimiento (μ) (Arredondo et al., 2007), y en vista de que las microalgas se reproducen mediante división binaria, la ecuación 4 fue utilizada para el análisis de resultados.

[Ec. 4]

RESULTADOS Y ANÁLISIS

Se dimensionaron los tres difusores con los respecti­vos diámetros de aspersor (1,2 y 4 mm). Para este fin, se calculó la distancia entre un aspersor y otro, la cual depende primordialmente de la longitud del tubo y de la cantidad de aspersores totales con los que cuen­ta el difusor. Por lo anterior, se aplicó la ecuación 1 para cada tubo difusor. La figura 5 presenta el resulta­do final de cada difusor.

Figura 5
Dimensionamiento del espaciamiento entre los aspersores de los tubos difusores (m)
Fuente: elaboración propia.

Fase preexperimental

Presión de entrada de aire al sistema

Luego de la elaboración de los difusores, con sus res­pectivos diámetros, se procedió a calcular la presión de entrada de aire al difusor, la cual influye en la for­mación de la burbuja. Esta se calculó haciendo uso de la ecuación de continuidad y la ecuación de Bernoulli.

Los valores necesarios tanto para la ecuación de con­tinuidad como para la ecuación de Bernoulli se repor­tan en la tabla 1 y 2, respectivamente, con lo cual se obtuvo que la velocidad 2 y la presión 2 tienen un va­lor de 0,0665 m/s y 2.511,60 Pa, respectivamente.

Tabla 1.
Valores necesarios para la ecuación de continuidad

Fuente: elaboración propia.

Tabla 2
Valores ecuación de Bernoulli

Fuente: elaboración propia.

Curvas de crecimiento con aire

Teniendo en cuenta el promedio de cada una de las réplicas por día obtenidas mediante la ecuación 2, a las cuales se aplicó el logaritmo natural para cada con­centración, se obtuvieron los resultados señalados en la figura 6.

Figura 6
Curvas de crecimiento de Chlorella vulgaris con los diferentes diámetros de aspersor
Fuente: elaboración propia.

Como se aprecia en la figura 6, la curva de 4 mm po­see una fase exponencial que se prolonga desde el día 5 hasta el día 7. En contraste, la fase exponencial de la curva de 2 mm se ve reflejada entre los días 6 y 9. Por último, la curva de 1 mm presenta una fase exponencial más prolongada que inicia en el día 6 y se extiende hasta el día 10.

A partir de la investigación desarrollada por Mo­hsenpour y Willoughby (2015), que muestra la tasa de crecimiento para un cultivo con aireación de 99,97 % de aire y 0,03 % de CO2, se encuentra que los resul­tados reportados por estos autores corresponden al doble de la mejor tasa de crecimiento obtenida en la presente investigación, la cual se registró con el diá­metro de 1 mm, como se aprecia en la tabla 3. Esto se debió a la cantidad de flujo de aire que afecta el crecimiento, puesto que para obtener una alta tasa de crecimiento a volúmenes de cultivo similares se debe emplear un flujo de 4,44 vvm, como reporta el trabajo de los autores antes mencionados, quienes obtuvieron buenos resultados utilizando dicho flujo y bajo la incidencia de la luz roja. En este sentido, y por cuestiones económicas, esta investigación em­pleó un flujo de 0,17 vvm, que resulta menor al flujo anteriormente mencionado, lo cual, en efecto, pro­vocó que la fluidización no fuese suficiente para que cada una de las microalgas recibiera la misma canti­dad de luz proveniente de las lámparas de halógeno de luz roja. Por lo anterior, se produjo una desacele­ración en el crecimiento del cultivo.

Tabla 3
Tasas de crecimiento

Fuente: elaboración propia.

Por otro lado, los valores promedio de las tasas de crecimiento permitieron apreciar que bajo los diá­metros de aspersor de 1 y 2 mm se presentó una mayor velocidad de crecimiento con respecto al diá­metro de 4mm. Lo anterior fue puesto a prueba pos­teriormente con el análisis de varianza anova y la prueba t.

El análisis estadístico se llevó a cabo con una tabla anova de un factor donde se compararon las tasas de crecimiento con respecto a los diámetros de as­persor en el difusor, utilizando un valor de significan­cia de 0,05. La tabla 4 presenta los resultados de los análisis de varianza indicando que no existe una dife­rencia significativa en las tasas de crecimiento al ob­tener un valor de F menor al F crítico (3,2199).

Tabla 4
Resultados análisis de varianza anova

Fuente: elaboración propia.

En vista de los resultados obtenidos, se realizó una comparación entre parejas para simplificar los diá­metros y encontrar aquellos que afectaban las tasas de crecimiento. Mediante el método de Dunnet, se obtuvo que los diámetros de 1 y 2 mm presentaban cambios significativos debido a la comparación de probabilidad de 2 colas con respecto a la probabi­lidad de la tabla anova, la cual es mayor, como se aprecia en la tabla 5. Por ende, se determinó que es­tos diámetros (1 y 2 mm) eran adecuados para llevar acabo la fase experimental.

Tabla 5
Análisis de varianzas desiguales entre los grupos de 1mm y 2 mm

Fuente: elaboración propia.

Fase experimental

Utilizando la ecuación de continuidad y la ecuación de Bernoulli se calculó la presión con la que la mezcla de co2 ingresaría al difusor. Debido a que la densidad de la mezcla en la parte experimental varía con respecto a la densidad de la fase preexperimental (aire) fue ne­cesario calcular la densidad de la mezcla con un valor de 1,25 Kg/m3.

Con la densidad calculada anteriormente y los va­lores que se presentan en la tabla 6 se halló la pre­sión a la entrada del difusor. Todas las variables de esta ecuación se mantuvieron constantes con res­pecto a la fase preexperimental, exceptuando la den­sidad. El resultado obtenido señala que la presión 2 debe ser de 2.534,19 Pa. Teniendo en cuenta este re­sultado, se observó que el valor de P2 de la fase pre-experimental reportó una diferencia porcentual de 0,00892 con respecto al valor de P2 de la fase expe­rimental. Por lo anterior, este valor no presento una diferencia significativa.

Tabla 6
Valores ecuación de Bernoulli

Fuente: elaboración propia.

Curvas de crecimiento con CO2

Utilizando los diámetros de aspersor seleccionados en la fase preexperimental (1 y 2 mm) se procedió a desarrollar la curva de crecimiento de la microalga, la cual se representó con el promedio de cada una de las réplicas por día. A dichas replicas, a su vez, se les aplicó el logaritmo natural para cada concentración.

Por un lado, con el diámetro de 2 mm se obtuvo una tasa de crecimiento de 0,35 dias-1 (10 días de cultivo), la cual resulta superior a la reportada por Suárez-Cha­parro y Chicagui (2014), quienes utilizaron el mismo porcentaje de mezcla e igual diámetro y obtuvieron un valor promedio de tasa de crecimiento de 0,18 días-1 (5 días de cultivo). Lo anterior se debe a que la presente investigación consideró los caudales a sumi­nistrar al difusor en contraste con la investigación rea­lizada por estos autores, lo que influenció la manera en que se llevó a cabo la mezcla. Por otra parte, con un diámetro de aspersor de 1 mm se obtuvo una tasa de crecimiento de 0,37 dias-1, que es superior a la re­gistrada con el diámetro de 2 mm.

El incremento celular registrado se debe a que las bur­bujas formadas con el diámetro de aspersor de 1 mm subían a baja velocidad, haciendo que estas perma­necieran más tiempo en el cultivo. De esta forma, el co2 que se encontraba en la burbuja tenía más tiempo para disolverse. La figura 7 muestra las curvas de cre­cimiento con 1 y 2 mm de diámetro de aspersor en el difusor usando la mezcla de CO2.

Figura 7
Curvas de crecimiento con CO2 a diferentes diámetros de aspersor
Fuente: elaboración propia.

Según el trabajo de los investigadores Doucha et al. (2005), el rango de presión mínimo de CO2 que debe ingresar al cultivo es de 0,1-0,2 KPa, el cual tiene como objetivo evitar que se limite el crecimiento de la mi­croalga por escasez de CO2 y minimizar las emisiones de este compuesto a la atmósfera. Por ello, la presión parcial de CO2 utilizada en esta investigación fue de 0,225 KPa, la cual se relaciona con el caudal empleado y explicado en la parte preexperimental.

Los resultados presentados en la tabla 7 permiten apreciar que a menor diámetro de aspersor aumen­ta la tasa de crecimiento. Esto se debe a que las bur­bujas con diámetros inferiores se comportan como esferas rígidas con una superficie inmóvil (Doucha & Lívanskjý, 1998), lo que disminuye la probabilidad de coalescencia entre burbujas y evita que incremente tanto su tamaño como la velocidad con la que ascien­de (Kadic & Heindel, 2014), por lo cual se mantienen intactas desde su salida en el difusor hasta la super­ficie del líquido, contribuyendo a homogeneizar las diferentes zonas dentro del cultivo. Al respecto, cabe resaltar que una burbuja que asciende con menor ve­locidad tendrá un mayor tiempo de residencia en el fo­tobiorreactor de panel plano (Kadic & Heindel, 2014).

Tabla 7
Tasas de crecimiento con CO2

Fuente: elaboración propia.

Por otro lado, Mohsenpour y Willoughby registran ta­sas de crecimiento menores en comparación con las obtenidas en esta investigación, como se aprecia en la tabla 7. Esta situación se debe al bajo caudal utiliza­do en nuestro experimento, el cual evitó que la con­centración de CO2 empleada (9 % de CO2) ocasionara una reducción considerable en el pH, que, como resultado, disminuye la actividad fotosintética e inhibe el crecimiento.

Estos valores confirmaron el hecho de que bajo las condiciones del difusor de 1 mm en el aspersor se obtienen burbujas con mayor área interfacial lo cual conduce a una mayor transferencia de CO2 en las fases gas-líquido (Kadic & Heindel, 2014).

Planteamiento teórico de las ecuaciones de transferencia de masa en el fotobiorreactor panel plano

Dentro de la revisión bibliográfica realizada se encon­tró el modelo de la película que permite explicar la transferencia de masa dentro del fotobiorreactor de panel plano, el cual explica la trayectoria del sustra­to gaseoso desde la burbuja hasta un organelo en el microorganismo mediante una serie de resistencias.

Al emplear el anterior modelo y utilizar como supues­tos teóricos que (i) la fase líquida está a igual tempera­tura que la fase gaseosa (donde las burbujas tenían un tamaño uniforme y constante); (ii) la presión de CO2 en cada burbuja alcanzaba la presión de saturación; y (iii) que el sistema se encontraba perfectamente mez­clado, la transferencia de masa en la interfase gas-lí­quido como paso limitante a la transferencia de masa general se expresa como se muestra en la ecuación 5.

[Ec. 5]

La ecuación 5 presenta dos parámetros experimenta­les (coeficiente de transferencia de masa y área inter­facial) que son difíciles de medir por sí solos, por lo que estos se combinan en uno dando lo que se cono­ce como el coeficiente volumétrico de transferencia de masa [ ( Dutta, 2008).

Se debe aclarar que el área interfacial (que hace par­te del producto ) se relaciona con el atrapamiento del gas () y el diámetro de la burbuja (), como se aprecia en la ecuación 6. Este parámetro permite explicar los resultados obtenidos en esta investigación utilizando como variable los diámetros de aspersor en el difu­sor (Kadic & Heindel, 2014), puesto que al disminuir el diámetro de aspersor en el difusor, y por tanto el tamaño de la burbuja, aumenta el área interfacial que se relaciona directamente con el flujo de CO2 desde la fase gaseosa a la fase líquida.

[Ec. 6]

CONCLUSIONES

Los fotobiorreactores de panel plano construidos en láminas de PMMA de 0,008 m presentaron buena re­sistencia térmica y mecánica. Así mismo, tanto el área de las placas como el volumen del equipo aseguraron una relación superficie/volumen que cumple con ran­gos establecidos por otros investigadores para garan­tizar el proceso fotosintético. A su vez, la selección de PVC como material para la elaboración de los difuso­res garantizó una fácil manipulación y un bajo costo al momento de su implementación en el fotobiorreactor de panel plano.

Los diámetros utilizados en la parte preexperimental corresponden a 1, 2 y 4 mm. Mediante el análisis ano­va y la prueba t se comprobó que aunque no existe una diferencia significativa en las tasas de crecimien­to celular entre estos (0,217 días-1, 0,198 días-1 y 0,174 días-1, respectivamente) a causa del caudal empleado de 0,17 vvm, la pareja conformada por los diámetros 1 y 2 mm sí presenta cambios significativos. Por con­siguiente, se realizó la parte experimental con estos dos diámetros.

Empleando una mezcla de 9 % co2 v/v y utilizan­do los diámetros de 1 y 2 mm durante la fase ex­perimental, se obtuvieron tasas de crecimiento 0,37 días-1 y 0,35 días-1, respectivamente. Estos resultados demuestran que a menor diámetro de aspersor se obtiene un aumento en la tasa de crecimiento. Así mismo, permiten comprobar que a pesar de utilizar un bajo caudal (0,17 vvm) y una alta presión parcial de co2 (0,225 KPa), con respecto a investigaciones anteriores, se logra evitar una reducción del pH y, con ello, disminuir la actividad fotosintética e inhibir el crecimiento.

El modelo de la película junto con los supuestos expresados para el sistema permiten confirmar que el tamaño de la burbuja generado por el aspersor afecta directamente el crecimiento del cultivo. En contraste,se comprueba que una burbuja pequeña con mayor área interfacial, la cual asciende con menor velocidad por el medio de cultivo y por lo tanto tiene un mayor tiempo de residencia en el fotobiorreactor,conduce a una mayor transferencia de masa entre las fases gas-líquido.

Referencias

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