Artículos científicos
Recepción: 17 Marzo 2020
Aprobación: 07 Abril 2020
Publicación: 08 Abril 2020
Resumen: A finales del año pasado se reportaron casos de pacientes con neumonía atípica en Wuhan, Provincia de Hubei, China. La mayoría de pacientes iniciales trabajaban, vivían o eran consumidores de productos del mercado mayorista de mariscos lo que sugirió un posible contagio de un patógeno de origen animal al ser humano. Posteriormente, se determinó que el responsable fue un coronavirus, que se llamó SARS-CoV-2, cuya rápida propagación produjo la pandemia de la enfermedad coronavirus disease 19 (COVID-19). La enfermedad es actualmente motivo de preocupación e intensa investigación a nivel mundial. Se han postulado teorías sobre el origen del coronavirus siendo la más aceptada que el virus proviene del pangolín malayo. Con la finalidad de reforzar esta teoría, en la presente investigación, a partir de secuencias nucleotídicas de dominio público, se seleccionaron fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican para la espícula glicoprotéica superficial de coronavirus en algunos organismos hospederos infectados por diferentes cepas de coronavirus incluyendo el SARS-CoV-2. De la filogenia y análisis de secuencias de amino ácidos de la espícula glicoprotéica del coronavirus se encontró posibles eventos de transmisión entre especies del virus responsable de la enfermedad incluyendo el ser humano.
Palabras clave: Coronavirus, transmisión entre especies, secuencias.
Abstract: At the end of last year, were reported cases of patients with atypical pneumonia in Wuhan, Hubei Province, China. Most of the initial patients worked, lived or were consumers of products from the wholesale seafood market, which suggested a possible transmission of a pathogen of animal origin to humans. Later, it was determined that the culprit was a coronavirus, named SARS-CoV-2, whose rapid spread caused the pandemic of coronavirus disease 19 (COVID-19). The disease is currently a cause for concern and intense research worldwide. Theories on the origin of the coronavirus have been postulated, being the most widely accepted that the virus comes from the Malay pangolin. With the intention of reinforce this theory, in this research, from nucleotide sequences in the public domain, were selected Fragments of nucleotide sequences encoding the coronavirus surface spike glycoprotein from some host organisms infected by different coronavirus strains including SARS-CoV-2. From phylogeny and acid amino acid sequence analysis were found possible cross-species transmission of the virus responsible of the disease including humans.
Keywords: Coronavirus, cross-species transmission, sequences.
RESUMEN
A finales del año pasado se reportaron casos de pacientes con neumonía atípica en Wuhan, Provincia de Hubei, China. La mayoría de pacientes iniciales trabajaban, vivían o eran consumidores de productos del mercado mayorista de mariscos lo que sugirió un posible contagio de un patógeno de origen animal al ser humano. Posteriormente, se determinó que el responsable fue un coronavirus, que se llamó SARS-CoV-2, cuya rápida propagación produjo la pandemia de la enfermedad coronavirus disease 19 (COVID-19). La enfermedad es actualmente motivo de preocupación e intensa investigación a nivel mundial. Se han postulado teorías sobre el origen del coronavirus siendo la más aceptada que el virus proviene del pangolín malayo. Con la finalidad de reforzar esta teoría, en la presente investigación, a partir de secuencias nucleotídicas de dominio público, se seleccionaron fragmentos de secuencias nucleotídicas que codifican para la espícula glicoprotéica superficial de coronavirus en algunos organismos hospederos infectados por diferentes cepas de coronavirus incluyendo el SARS-CoV-2. De la filogenia y análisis de secuencias de amino ácidos de la espícula glicoprotéica del coronavirus se encontró posibles eventos de transmisión entre especies del virus responsable de la enfermedad incluyendo el ser humano.
ABSTRACT
At the end of last year, were reported cases of patients with atypical pneumonia in Wuhan, Hubei Province, China. Most of the initial patients worked, lived or were consumers of products from the wholesale seafood market, which suggested a possible transmission of a pathogen of animal origin to humans. Later, it was determined that the culprit was a coronavirus, named SARS-CoV-2, whose rapid spread caused the pandemic of coronavirus disease 19 (COVID-19). The disease is currently a cause for concern and intense research worldwide. Theories on the origin of the coronavirus have been postulated, being the most widely accepted that the virus comes from the Malay pangolin. With the intention of reinforce this theory, in this research, from nucleotide sequences in the public domain, were selected Fragments of nucleotide sequences encoding the coronavirus surface spike glycoprotein from some host organisms infected by different coronavirus strains including SARS-CoV-2. From phylogeny and acid amino acid sequence analysis were found possible cross-species transmission of the virus responsible of the disease including humans.
INTRODUCCIÓN
La aparición de un nuevo virus tiende a afectar de forma local a la población. La propagación, dependiendo de las características del virus, puede en cambio repercutir a nivel mundial afectando la economía, el sistema de salubridad de los países involucrados y el estado de ánimo de la población. A lo largo de la historia de la humanidad, esta se ha enfrentado a múltiples epidemias que han causado grandes pérdidas de vidas humanas y colapsado la economía mundial (Tabla 1).
La propagación de un patógeno animal a un humano, se conoce como transmisión entre especies o “spillover”. Este es un proceso complejo no comprendido del todo, que involucran muchos factores, ambientales, geográficos, sanitarios etc. (Plowright et al., 2017). Los virus son responsables directos de enfermedades en mamíferos entre ellos se encuentran los coronavirus. Estos forman parte de una familia cuyo genoma está compuesto por RNA monocatenario positivo. Se encuentran distribuidos en todo el mundo y son altamente infecciosos por naturaleza, causan enfermedades entéricas, respiratorias y en algunos casos neurológicas en una amplia variedad de animales y en humanos (Lai y Holmes, 2001; Gorbalenya et al., 2020). Entre los coronavirus de origen animal que se transmitieron al ser humano y provocaron epidemias se incluye el de Síndrome Respiratorio Agudo Severo (SARS-CoV), el coronavirus del Síndrome Respiratorio del Medio Oriente (MERS-CoV) y el recientemente identificado SARS-CoV-2 (Huang et al., 2020).
En los últimos días de diciembre de 2019, se detectó alrededor de 99 casos atípicos de neumonía en la ciudad Wuhan, provincia de Hubei en China; 49 de estos casos se relacionaron con el mercado mayorista de mariscos de Huanan entre consumidores, habitantes y trabajadores del mercado (Chen et al., 2020). Los casos siguieron aumentando y se emitió una alerta a los sistemas sanitarios del país asiático. Para el primero de enero del presente año, se descubrió el foco inicial del virus en el mercado de Huanan, lugar donde se vendía pescado y animales silvestres vivos como aves de corral, murciélagos, marmotas y serpientes (Lu, Stratton y Tang, 2020; Wu y McGoogan, 2020). En ese mismo mes, un grupo de científicos chinos secuenciaron el genoma del “Aislado del virus de la neumonía del mercado de mariscos de Wuhan (Wuhan-Hu-1)”. El grupo identificó que el virus era un coronavirus y reportó la secuencia de nucleótidos en la base de datos del NCBI (1988) con el número de accesión NC_045512.2.
El SARS-CoV-2 comenzó a propagarse de forma descontrolada. A mediados de enero se registró el primer caso fuera de China, se aisló la ciudad de Wuhan y posteriormente 15 ciudades chinas más. La curva epidémica tuvo un crecimiento muy elevado y la enfermedad presentó una tasa de mortalidad del 2.3%. Para el 30 de enero del 2020 la Organización Mundial de la Salud (WHO, por sus siglas en inglés) catalogó al SARS-CoV-2 como una “emergencia de salud pública de preocupación internacional” (Wu y McGoogan, 2020) y para el 11 de marzo, declaró la pandemia de COVID-19. Desde esa fecha el número de contagios progresó de forma sostenida a nivel mundial (Figura 1). La información sobre personas contagiadas, recuperadas y fallecidas en todo el mundo se actualizó en bases de datos públicas todos los días en tiempo real (Gardner, 2020; WHO, 2020).
El primer caso en el Ecuador se registró el 29 de febrero y se inició el crecimiento exponencial de contagiados en función del tiempo (Figura 2), convirtiéndose desde entonces en un problema de salud pública sumamente serio en nuestro país.
De acuerdo con Newman et al., (2006) los viriones o partículas virales (unidad estructural de los virus con capacidad de infección) del coronavirus son esféricos con un diámetro aproximado de 125 ηm. En la superficie del virión se encuentra una estructura trimérica denominada espícula glicoprotéica (Figura 3), esta es necesaria para la replicación del coronavirus ya que se une a receptores celulares de superficie de las células hospederas. El rango de hospederos del coronavirus depende de la afinidad entre ellos.
De acuerdo con Song, Gui, Wang y Xiang, (2018), algunos coronavirus se unen a la enzima convertidora de angiotensina 2 del receptor celular (ACE2) y media la fusión de las membranas del coronavirus y la célula promoviendo el ingreso del virus por endocitosis para posteriormente liberar la nucleocápside viral dentro del citoplasma de la célula e iniciar la replicación del virus (Figura 4).
Adicionalmente a los estudios de la función, estructura de la espícula glicoprotéica y sus reordenamientos conformacionales para promover la entrada del virus (Song, Gui, Wang y Xiang, 2018) también se encuentran disponibles las secuencias de nucleótidos que codifican para las espículas glicoprotéicas de coronavirus en diferentes especies (Kan et al., 2005; Hu et al., 2017; Liu et al., 2019).
De lo antes expuesto, con la información genómica disponible, en el presente estudio, se plantea definir el origen más probable del SARS-CoV-2 y así contribuir a fortalecer el conocimiento sobre este nuevo virus y las enfermedades derivadas del mismo
MATERIALES Y MÉTODOS
Considerando el gen que codifica para la espícula glicoprotéica de coronavirus, se utilizó fragmentos (48 pb de longitud) de 32 secuencias correspondientes a cepas reportadas por Kan et al., (2005), un fragmento de la secuencia viral del murciélago rufo de herradura (Rhinolophus sinicus) con número de accesión MG772933.1 descrita por Hu et al., (2018) y un fragmento homólogo a partir del genoma de SARS-CoV-2 (Sequence ID: NC_045512.2) responsable del COVID-19. Con la secuencia AY687357 se realizó una búsqueda mediante blast (Basic Local Alignment Search Tool referido por Altschul, Gish, Miller, Myers y Lipman, 1990) de nucleótidos contra las secuencias de pangolín malayo (Manis javanica) del proyecto PRJNA573298 (Liu, Chen y Chen (2019). De las secuencias resultantes del blast se seleccionaron aquellas que presentaron porcentajes de identidad cercanos al 100%, se depuró las secuencias y se trabajó finalmente con aquellas que fueron homólogas al fragmento de 48 pb.
Con las secuencias se realizó un alineamiento, un modelo y se obtuvo el árbol filogenético mediante MEGAX.10.1.7 (Kumar, Stecher, Li, Knyaz y Tamura, 2018). Se utilizó la secuencia At1g24610 como outgroup.
La traducción a proteína de las secuencias genómicas se realizó mediante la plataforma ExPASy (Gasteiger et al., 2003) y se verificó que correspondieran a la espícula glicoprotéica mediante blastp (Altschul et al., 1990). Para visualizar la composición de aminoácidos (aa) en las secuencias de cada clado y subclado se generaron figuras tipo logo mediante WebLogo (Crooks et al., 2004).
RESULTADOS
Del genoma NC_045512.2, se determinó que la secuencia de nucleótidos AAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCC codifica para la espícula glicoprotéica del SARS-CoV-2 (identificada en este trabajo como H. Sapiens SARS-CoV-2)
De las secuencias de pangolín malayo, 122 presentaron porcentajes de identidad adecuados y de estas 37 fueron homólogas y tenían la misma longitud que el fragmento referido en la publicación de Kan et al., (2005).
Mediante la información genómica disponible se elaboró un alineamiento con 71 secuencias (no se muestra este resultado) y un árbol filogenético por del método HKY con un bootstrap de 1000 y distribución gamma de 5. En el árbol (Figura 5) se observó dos grupos monofiléticos principales, el primero comprendido por la secuencia de pangolín malayo gnl|SRA|SRR10168377.9857580.2:2-150, referida como Sec1 en este estudio y un gran grupo monofilético con las 69 secuencias restantes.
Dentro del grupo monofilético mayor, se observan un grupo comprendido por 23 (clado rojo) y otro grupo con las secuencias restantes (subclados verde, azul, amarillo y violeta). El clado rojo y el subclado verde se componen exclusivamente de secuencias de pangolín malayo, indicativo de que diferentes cepas de coronavirus circulaban dentro de individuos de esta especie. En el siguiente grupo monofilético se encuentra un clado con 40 secuencias, conformado a su vez por subclados (amarillo, azul y violeta). La disposición de las secuencias dentro del subclado azul indicaría 2 eventos de transmisión entre especies del virus por tanto de la enfermedad, el primero desde el pangolín malayo hacia el murciélago rufo de herradura y el segundo desde el pangolín malayo hacia la civeta de la palma asiática. El subclado amarillo, es una nueva bifurcación de la cual derivó la secuencia viral H. sapiens SARS-CoV-2 (responsable del COVID-19), es probable que esta cepa haya surgido antes que las cepas responsables de la epidemia de SARS (subclado violeta) cuyo origen fue la civeta de la palma asiática (Wang et al., 2005).
Finalmente en el subclado violeta se encontró secuencias virales homólogas en la civeta de la palma asiática, mapache japonés y el ser humano lo que indicaría un nuevo evento de transmisión entre especies de la enfermedad.
Al realizar la traducción de cada secuencia de nucleótidos, que codifican para la espícula glicoprotéica de coronavirus se observó variaciones en cada clado y subclado que se resumen en una figura tipo logo (Figura 6). La secuencia Sec1 es la más divergente de todas, a partir de esta se observó la variación de los residuos de aminoácidos en cada posición (1 a 14). Siguiendo el sentido probable de la transmisión del coronavirus entre especies, las secuencias se vuelven menos divergentes conforme se establece en un grupo de especies en particular. Es así, que al llegar al subclado violeta la secuencia de la espícula glicoprotéica de diferentes cepas de coronavirus es exactamente la misma para el mapache japonés, la civeta de la palma asiática y el ser humano. Si bien la secuencia de nucleótidos que codifica para la espícula glicoprotéica del H. sapiens SARS-CoV-2 (subclado amarillo) es diferente, es exactamente la misma a nivel de residuos de aminoácidos (Figura 6).
DISCUSIÓN
De la filogenia obtenida en este estudio se observa que las cepas virales se desarrollaron inicialmente en pangolines malayos, las cuales fueron mutando y provocaron la transmisión del virus entre diferentes especies de mamíferos. Aun así, con este árbol filogenético no es posible aseverar que el pangolín malayo es el responsable directo de la transmisión del SARS-CoV-2 al ser humano ya que los árboles filogenéticos indican las relaciones evolutivas más probables entre secuencias (o especies). Adicionalmente cualquier otro mamífero que se vendía en el mercado de Huanan pudo ser el reservorio viral de la cepa que se transfirió al ser humano. Al inicio de la epidemia se pensó que el origen más probable del SARS-CoV-2 era la serpiente, al considerar la maquinaria traduccional de Bungarus multicinctusa y Naja atra y el sesgo en el uso de codones de estas dos especies (Ji, Wang, Zhao, Zai y Li 2020). Sin embargo, la evidencia posterior fue orientando al origen del virus en el pangolín malayo.
Además, existe la posibilidad de contagio con un mamífero que no esté en cautiverio. Los murciélagos son reservorios de coronavirus y su capacidad para volar les confiere la posibilidad de ocupar un amplio hábitat a nivel mundial y dispersar enfermedades (Woo et al., 2012; Hu et al., 2017, Tao et al., 2017; Luo et al., 2018).
Retomando nuevamente la filogenia, se observa que la secuencia viral H. sapiens SARS-CoV-2 probablemente haya aparecido antes que las cepas de SARS de la epidemia del 2003 (subclado violeta) y la cepa de origen animal SARS-CoV-2 haya estado presente en algún mamífero hospedero como el mapache japonés o la civeta de la palma asiática (subclado azul) hasta que, infectó a cualquiera de los 99 pacientes iniciales del COVID-19 reportados por Chen et al. (2020). De todo lo expuesto anteriormente, se aprecia que para entender la enfermedad y desarrollar posibles vacunas se requieren más ensayos, secuenciaciones y análisis genómico de cepas virales de hospederos infectados para poder elucidar completamente el camino mediante el cual el virus SARS-CoV-2 infectó el ser humano.
Según Geoghegan y Holmes (2008) la evolución de la virulencia es un tema no resuelto aún y los estudios experimentales referidos a los determinantes de esta enfermedad, dentro de un marco filogenómico, contribuirán a la comprensión integral de su evolución. Es importante mencionar que las infecciones por SARS-CoV-2, se presentarán de forma recurrente. La enfermedad se volvió estacional y se espera que afecte con mayor intensidad en países templados de América del Norte (Neher et al., 2020), sin embargo estos modelos pueden fallar al estimar el comportamiento de una epidemia y es probable que el Ecuador vuelva a presentar focos infecciosos en el futuro.
Debido al profundo impacto de esta pandemia la información genómica del SARS-CoV-2 se actualiza todos los días de forma vertiginosa y puede ser consultada libremente en bases de datos especializadas como el NCBI (NCBI Resource Coordinators, 2018) o ViPR (Pickett et al., 2012). Vigorosos esfuerzos se realizan a nivel mundial para contener al virus y buscar una posible cura.
Respecto a la traducción predicha de secuencias, es evidente que el código genético, al ser degenerado permite la codificación de un aa por más de un triplete; lo interesante en nuestro análisis es que, las secuencias de nucleótidos que codifican para la espícula glicoprotéica del H. sapiens SARS-CoV-2 y las del subclado violeta (encontrada en pacientes de la epidemia de SARS del 2003) son diferentes, pero a nivel de la traducción proteica son las mismas motivo por el cual el H. sapiens SARS-CoV-2 consiguió infectar las células en el ser humano.
Recientemente Zhou et al., (2020) determinaron que las proteínas ACE2 humanas son los receptores celulares a través del cual ingresa el virus SARS-CoV-2, justo como ocurre con la cepa Urbani de SARS-CoV común en Asia (Li et al., 2003), este estudio coincide con nuestro resultado ya que las espículas glicoprotéicas (idénticas en la secuencia de aa predicha) ingresan a las células a través de los mismos receptores celulares.
De acuerdo a nuestros resultados, nuevamente ha quedado en evidencia el enorme riesgo de interactuar con especies silvestres que son reservorios virales. Las especies silvestres no deberían formar parte de la cadena alimenticia del ser humano ni destinarse a la domesticación, recreación o compañía.
Según el Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades de Estados Unidos (CDC, 2013), la epidemia de SARS del 2003 se desarrolló en 29 países, contagió a 8096 con alrededor de 774 decesos. En esta ocasión enfrentamos una pandemia sumamente peligrosa, se debería endurecer la legislación a nivel local y mundial para regular estas actividades.
Debido a que existen costumbres arraigadas en diferentes culturas, al menos se deberían seguir las normativas internacionales como las de la OPS (2015), que especifican que los animales expendidos en mercados, destinados a la alimentación deben manejarse con prácticas de higiene análogas e igual de exigentes a las de un alimento procesado, con la finalidad de garantizar la inocuidad del producto final y proteger a los consumidores. Paralelamente se deben proseguir con las investigaciones referidas a virus de origen animal y la transmisión entre especies de acuerdo con las recomendaciones de Hu et al., (2018), Lu, Stratton y Tang (2020) y Zhou et al., (2020) entre otros.
CONCLUSIONES
Existe evidencia que respalda el origen más probable del SARS-CoV-2 en el pangolín malayo, a partir de las secuencias nucleotídicas que codifican para la espícula glicoprotéica de este coronavirus.
Los ensayos que se están realizando a nivel mundial ayudarán a definir con mayor exactitud el origen y comportamiento del virus así como el eventual tratamiento de la enfermedad en esta pandemia y en rebrotes. Se requieren medidas legales drásticas para evitar la interacción con animales silvestres, posibles reservorios de virus infecciosos para el ser humano. Cuando los animales se destinan al consumo humano deben respetarse al menos las normativas de manejo de alimentos para garantizar la higiene e inocuidad de los mismos.
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Notas
