Recepción: 16 Diciembre 2019
Aprobación: 05 Marzo 2020
Resumen: El fríjol caupíVignaunguiculata L. Walp. (Fabaceae) es una leguminosa de ciclo corto que se utiliza principalmente como abono orgánico y en rotación de cultivos, su forraje es de elevado valor nutritivo, constituyendo una opción importante en sistemas de integración agrícolas – ganaderos. Con el fin de medir el efecto biofertilizador de bacterias RhizobiumyAzotobacteren el cultivo Vignaunguiculata, se realizaron ensayos para aislarlas cepas Azotobacter a partir del suelo del Distrito La Molina, Provincia Lima,Perú en medio Winogradsky y las cepas de Rhizobium, a partir de nódulos de frijol, en el medio Agar-Levadura-Manitol. Estas cepas fueron inoculadas en semillas de frijol caupí o castilla (Vignaunguiculata), el tratamiento con mejor efecto en la germinación del frijol castilla, fue Azotobactercon un 80% de germinación en comparación con el tratamiento con el agua 66% y la cepa Rizo E10, en forma individual tuvo una mayor biomasa seca a los 18 días de evaluación. Así también, en invernadero, se apreciaron diferencias estadísticamente significativas en el peso seco de la raíz entre el tratamiento Rizo aisl+Azoto y el tratamiento con agua; en la biomasa fresca entre el tratamiento con Rizo aisl y el N+ (KNO3 0.1%), con la aplicación del test de rangos múltiples de Duncan. Estas características demuestran el efecto promotor en la germinación y en el crecimiento de las plantas, de aplicación para diversos cultivos de interés en reemplazo de la fertilización química.
Palabras clave: azotobacter, fijación biológica de nitrógeno, microbiología, rhizobium, vignaunguiculata.
Abstract: The cowpea bean Vignaunguiculata L. Walp. (Fabaceae) is a short-cycle legume that is mainly used as an organic fertilizer and in crop rotation. Its forage has a high nutritional value and is an important option in integrated agriculture-livestock systems. In order to measure the biofertilizing effect of Rhizobium and Azotobacter bacteria in the Vignaunguiculata culture, tests were performed to isolate Azotobacter strains from the soil of La Molina District, Lima Province, Peru in Winogradsky medium and Rhizobium strains from bean nodules in Agar-Yeast Mannitol medium.These strains were inoculated in seeds of cowpea or castilla beans (Vignaunguiculata), the treatment with the best effect on the germination of castilla beans wasAzotobacter with 80% germination compared to the treatment with water 66% and Strain Rizo E10, individually had a greater dry biomass at 18 days of evaluation. Likewise, in the greenhouse, significant differences were observed in the dry weight of the root between the Rizo Isolate + Azoto treatment and the treatment with water; in the fresh biomass between the treatment with Rizo Isolate and N + (KNO3 0.1%) with the application of Duncan's multiple range test. These characteristics demonstrate the promoter effect in the germination and growth of the plants, of application for diverse crops of interest in replacement of the chemical fertilization.
Keywords: azotobacter, biological nitrogen fixation, microbiology, rhizobium, vignaunguiculate.
INTRODUCCIÓN
El fríjol caupíVignaunguiculata L. Walp. (Fabaceae) es una leguminosa de ciclo corto que se utiliza principalmente como abono orgánico y en rotación de cultivos, su forraje es de elevado valor nutritivo, constituyendo una opción importante en sistemas de integración agrícolas – ganaderos (Calegari, 1995). Las bacterias del género Rhizobium y Azotobacter tienen la capacidad de fijar nitrógeno atmosférico (N2)y lo convierten en sustancias nitrogenadas como el amonio, en beneficio de las plantas a través del proceso de Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN) (Aguado, 2012).
Estas bacterias además son capaces de promover el crecimiento vegetal conocidas como PGPR (PlantGrowthpromotingRhizobacteria) (Kellman, 2008; Babu, Prasanna, Bidyarani, & Nain, 2015) y tienen un potencial de aplicación como biofertilizante enreemplazo de la fertilización química (Kloepper, Zablotowics, Tippin, & Lifshitz, 1991; Verma, Yadav, Tiwari, Lavakush & Singh, 2010; Jnawali, Bubu, & Marahatta, 2015). Para lograr un mayor rendimiento dediversos cultivos, se utilizan fertilizantes nitrogenados tradicionales, sin embargo,éstos contribuyen a la contaminación de los suelos (Hungría, Gómez, & Filho, 2016).
El uso excesivo de nitrógeno genera: problemas económicos, desequilibrios en el suelo que perjudican su fertilidad, provocan contaminación en el ambiente, principalmente en aguas utilizadas para consumo humano, animal y vegetal. Según la Agencia de Protección ambientalde los EE.UU. (EPA, 2016), genera problemas de eutrofización, crecimiento excesivo de algas y muerte de peces. Así mismo, según Mateo-Sagasta, Marjani y Turral (2017) de la FAO los organismos acuáticos son afectados por la contaminación agrícola (Gothandapani, Sekar, & Padaria, 2017).
Ante esta problemática, la biofertilización surge como una alternativa biotecnológica de interés ecológico y ambiental, por ejemplo Obando (2012) y Aguado (2012) realizaron estudios sobre los efectos positivos deRhizobium - Azotobacter y otras rizobacterias estimuladoras del crecimiento demostrando que aumentan significativamente el número y peso de nódulos, mayor fijación de nitrógeno, aumento del contenido de macronutrientes y micronutrientes, en comparación con la inoculación individual deRhizobiumsp. (CIAT, 1987; Zúñiga, 2012; Gonzales, 2013).
Las bacterias endofíticas han sido usadas para la fitoremediación de suelos contaminados con metales pesados (Ma et al., 2016; Etesami, 2018), factor que le da importancia a el uso de este tipo de bacterias para ser usados como biofertilizantes.Por estos motivos se planteómedir el efecto biofertilizador de bacterias Rhizobium y Azotobacteren el cultivo Vignaunguiculata; los ensayos se realizaron en el laboratorio y en un invernadero.
MATERIALES Y MÉTODOS
En los experimentos de caracterización bacteriana: se utilizaron medios de cultivo para la propagación y conservación de básico para la propagación de las cepas Rhizobium fue el medio LMA (Manitol 10g, extracto de levadura 0.5g, K2HPO40.5g, MgSO4,7H20 0.10g, NaCl 0.20g, agar 15g, colorante Rojo Congo 10mL/L, agua 1L, pH7) la bacteria posee las siguientes características crece a 48h a una temperatura de 28°C. Además,el medio de cultivoWinogradsky (medio para la propagación de las cepas de Azotobacter,KH2PO40.25g,MgSO4,7H2O, 0.125g, NaCl, 0.125g, Na2Mo.5H2O, 0.005g, MnSO4.4H20, 0.005g, CaCO3 0.1g, glucosa 10g, agar 15g, 1L pH7), crecimiento de 3 a 5 días a 28°C. Además, se utilizó una cepa control RIZO E1O, de la Universidad Nacional Agraria La Molina (Hungría et al., 2016).
Se requirió, además, materiales de laboratorio estériles, para ello se utilizó una autoclave, una estufa y agitador, frascos con magneto en su interior, termómetro de ambiente, semillas de frijol castilla suelo agrícola.
Muestreo del suelo y obtención de nódulos:
Se obtuvo una muestra de 100 g de suelo del campo agrícola experimental conocido como "Pancal" de la Universidad Nacional Agraria La Molina, de clase texturalfranco arcillo arenoso (55% arena, 23% limo y 22% arcilla) con una conductividad eléctrica de 1.14 dS/m y un pH de 7.34 de la Provincia Lima, Perú (12°05′06″S, 76°57′06″W, UTM ZONA-WGS84), a una altitud de 251 m.s.n.m.En el caso los nódulos fueron obtenidos de plantas de Phaseolusvulgaris, de campos de la Facultad de Agronomía de la misma universidad en un suelo de clase textural Franco arenoso de pH 7.61 y una conductividad eléctrica de 3,02. El resultado de análisis fisicoquímico del suelo se resume en la Tabla 1. Las muestras fueron trasladadas al Laboratorio de Bioprocesos de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos para los futuros ensayos.
Aislamiento e identificación bacteriana de cepas de Azotobacter:
Las cepas de Azotobacter fueron aisladas según el Manual de Bacteriología de La Universidad Nacional Mayor de San Marcos, publicado por León, Quillama y Huamán (2017). Se utilizó una muestra de 100g de suelo, el cual se le realizaron diluciones sucesivas hasta la dilución -3, por el método de las diluciones seriadas. Luego se dispensó 1mL de cada dilución en el medio Winodgrasky por la técnica de incorporación en placa. Las colonias eran transparentes en este medio y con diámetros de 1-2 mm.Estas cepas fueron purificadas y conservadas en agarinclinado Winodgraskya 4°C para posteriores estudios.
Aislamiento e identificación bacteriana de cepas de Rhizobium:
En relación con las cepas de Rhizobium, éstas se aislaron de acuerdo a la metodología propuesta por el manual del CIAT (1987). Los nódulos tenían un tamaño de 4 mm. Se colocaron en sobres de papel de filtro para hidratarse en agua destilada estéril durante 30 min, se desinfectaron en alcoholal 70% por 1 minuto en un frasco estéril, luego se transfirió los sobres a un frasco con hipoclorito de sodio al 3% por espacio de 3min. Se enjuagaron con agua destilada estéril hasta cinco veces. A cada nódulo se agregó una gota de agua destilada estéril por nódulo. Luego con una bageta, se aplastaron lo nódulos y el macerado se sembró en placas Petri con LMA (Agar-levadura-Manitol) con Rojo Congo por estrías. Las placas fueron llevadas a la incubadora a 28°C de 2 a 4 días. A las colonias características se les aplicó coloración Gram para corroborar la identificación de género.
Ensayo en bandejas:
Se colocaron las semillas en frascos estériles, se le agregó el desinfectante hipoclorito de sodio al 2%, por 3 min. Luego se realizaron hasta 3 lavados hasta retirar todas las impurezas. Luego se realizó la imbibición de las semillas con los inoculantes por 35 min. Al finalizar se procedió al secado por espacio de 40 min., luego se procedió a colocar las semillas en las bandejas. Se colocaron en bandejas de 31 cm de largo x 21 cm de ancho, de manera que se colocaron 10 semillas por filas x 5 semillas por columna, hasta obtener 50 semillas en total. Se evaluó el porcentaje de germinación a las 48h y biomasa seca a los 18 días de crecimiento en las bandejas.
Ensayo en macetas:
En el ensayo en macetas se requirió de la construcción de un invernadero de 1,4 m x 2,5 m. Allí se colocaron 42 macetas de plástico de 15.8 cm altura x 15.2 cm de diámetro. En este ambiente la temperatura fue de 20 a24°C. Además, se evaluó las características del suelo agrícola empleado como sustrato (Tabla 1). Se realizaron evaluaciones periódicas de longitud de la parte aérea en cm, cada cinco días, registrándose esos valores. Al caso de un mes de evaluación se realizó la evaluación final, en esta evaluación se registró también el peso fresco y seco de la parte área y radicular, el grosor del talo y la biomasa fresca.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En el procedimiento de aislamiento las colonias eran características. En el caso de Rhizobium, a las 48h eran colonias bacterianas tenían un diámetro de 3mm en el medio LMA, producen abundante mucosidad características similares a las observadas por Kellman (2008) y Hungría (2016). Las colonias de Azotobacter eran transparentes y translúcidas, redondas, similares a las colonias observadas por y León et al. (2017), (Figura 1). Además, en la tinción, eran Gram negativas, coloración roja característica, eran bacilares ambas cepas bacterianas. El suelo donde provenían las cepas era franco arenoso, con un pH de 6.1 y una conductividad de 3.02 (Tabla 1).
(a) Cepas de Azotobacter, colonias en el medio Winogradsky
(b) Rhizobium aislados de suelos de La Molina en el medio de cultivo LMA
(c) cepa control Rizo E10.
Los resultados de los diversos tratamientos aplicados a las semillas y plantas se aprecian en la Tabla 2. La germinación de las semillas se evaluó a las 48h y 72h de colocarlas en las bandejas. La temperatura del ambiente varió entre 20 a 21 °C durante la noche y 18-19 °C durante el día. La temperatura oscilaba entre 20-21°C y se realizaron riegos con agua destilada cada 3 días, en condiciones de esterilidad. Al finalizar el experimento se evaluó la materia fresca y seca de cada tratamiento evaluado. El resultado más resaltante fue el de la cepa Azotobacter, la cual obtuvo un 80% de germinación a los 2 días de sembrarlo, mayor al agua 66%, todo se contrastó con los resultados estadísticos y gráficas comparativas; muchas de las bacteriasfijadores de N2 presentan, además, diversosmecanismos que favorecen el desarrollo deplantas, lo que hace que sean consideradascomo bacterias promotoras del crecimientovegetal entre las más destacadas se encuentran laspertenecientes a los génerosAzotobacter y Azospirillum, las cuales sonbacterias de vida libre que constitutivamenteposeen la cualidad de fijar N2 atmosférico (Arjunet al., 2015; Camelo-Rusinqueet al., 2017; Mahato y Kafle, 2018).
El tratamiento que también tuvo un buen porcentaje fue el de la interacción Rizo E10 78% de germinación mayor al agua 66% y la cepa E10 tuvo mayor biomasa seca en comparación al control con agua y nitrato de potasio (Tabla 2 y Figura 2). El mejor porcentaje de germinación y de materia seca, se debe a la liberación de sustancias benéficas, tales como fitohormonas ácido Indolacético, giberelinasrivoflavinas, nicotina (Jnawaliet al., 2015). En la investigación realizada por Constantinoet al. (2010), al evaluar el efecto de los biofertilizantes en semilla de papaya, obtuvo que los tratamientos simples con Azotobacterchroococcum y Azospirillumbrasilense, incrementaron el porcentaje de germinación a 90.28% y 88.89%, respectivamente, similar al resultado obtenido en el experimento realizado.
En los ensayos en invernadero, luego de realizar la inoculación de las semillas, se aplicó 1 mLdel biofertilizante, se obtuvo que las plantas inoculadas con las cepas de AzotobacteryRhizobium, como inoculantes individuales tuvieron un mejor efecto en el crecimiento que las cepas en consorcio.El suelo empleado fue franco arenoso, con pH 7.44 y 0.34 óptimos para el crecimiento del cultivo de frijol caupí. En la Tabla 3 y Figura 3, se aprecian el efecto periódico de la LPA en las plantas de frijol caupí y el efecto durante la evaluación.
Los resultados en las plantas fueron evaluados diariamente, observándose que la cepa Rizo E10 tuvo un mejor crecimiento con respecto al N+ y al agua. Todos los resultados promedio de las evaluaciones de los parámetros de evaluación final se aprecian en la Tabla 4.
En base a los resultados podemos afirmar que las bacterias de vida libre, tal es el caso de Azotobacter mejoran el crecimiento vegetal, conocidas como bacterias promotoras de crecimiento (PGPR), las cuales pueden mejorar la germinación de las semillas a través de la producción y liberación de algunas sustancias reguladoras del crecimiento vegetal como la auxina (Sridevi y Mallaiah, 2007), las citoquininas o giberelinas en medios químicamente definidos y en asociación con plantas (Verma et al., 2010; Babuet al., 2015).
En relación con los biofertilizantes mixtos, según Babuet al. (2015) las cepas promotoras de crecimiento vegetal (PGPR), mejoran la biomasa de las plantas, la toma de nutrientes y el rendimiento, especialmente cuando son aplicados en combinación. En el caso de plantas no leguminosas, es necesario modular los procesos de colonización y supervivencia, como ocurre a menudo con las cepas RhizobiumyBradyrhizobium en la rizósfera, en los cuales es necesaria la incorporación de cepas adicionales, como Agentes Promotores de Crecimiento Vegetal (PGP) (Babuet al., 2015); tales como Azotobacter, debido a que, éstas incrementan el crecimiento de brotes y raíces, el desarrollo de la raíz, regulación hormonal de la planta, fijación de nitrógeno, la solubilización de minerales y la supresión de patógenos, la colonización de la raíz, los cuales son pasos importantes en la asociación microbiana con las plantas.
*LPA: Longitud de parte aérea
LR: Longitud de raíz
PFSA: Peso fresco de parte aérea
PFR: peso frescode raíz
PSPA: peso seco de parte aérea
PSR: peso seco de raíz, GR.
Tallo: Grosor de tallo
BIO FRESCA: biomasa fresca
Gothandapani et al. (2017) menciona que las bacteriasAzotobacter tienen propiedades benéficas en la promoción de crecimiento debido a la producción de Ácido Indolacético (AIA) o giberelinas. Finalmente, Verma et al. (2010) también consideran aRhizobium como un promotor de crecimiento vegetal, tal como ha sido demostrado en diversos estudios en la India. Según Lobo, et al. (2018) el uso de PGPR como inoculante proporciona un enfoque ambientalmente sostenible para aumentar la producción de cultivos. La eficacia de los inoculantes depende de su producción, formulación y almacenamiento adecuados para garantizar la aplicación del número necesario de células microbianas viables.
Los resultados obtenidos son una base para futuros ensayos de aplicación en campo, para mejorar la productividad del cultivo. Así como, para la recuperación de suelos agrícolas impactados por contaminantes por lo que existe un futuro prometedor para la aplicaciónde losbiofertilizantes a gran escala para este cultivo y diversos cultivos de importancia ambiental y agroindustrial. Así como contribuir al desarrollo de una agricultura sostenible generando un impacto positivo para el agricultor y el ambiente.
CONCLUSIONES
Con base a las evaluaciones microscópicas, características morfológicas Winogradsky y procedimientos de tinción podemos afirmar que las cepas estudiadas corresponden a bacterias Azotobactersp., con cualidades de una bacteria Azotobacterchroccocum una especie muy característica de los suelos agrícolas. Además, la cepa Rizo aisl1, de acuerdo con las características evaluadas en LMA (Levadura-Manitol Agar) son muy similares a la cepa Rizo E10 (control) y se trataría de una cepa de Rhizobiumsp.
En el experimento en bandejas con semillas del frijol caupi, el tratamiento con Azotobacter tuvo un buen porcentaje de germinación 80% superior al agua 66% a las 48h de evaluación. Además, el mismo tratamiento tuvo un buen crecimiento de la parte aérea y de la raíz, luego de 18 días de evaluación en las bandejas.
A los 18 días de evaluación en las bandejas, con frijol caupí, la mayor biomasa fresca fue de Rizo E10, con 46g de fresca en comparación con el agua, 37g y el N+, 45g. Además, al evaluar la materia seca esta misma cepa obtuvo una materia seca de 6.48g, la cual fue mayor al control con agua 6,26g.
En el experimento en invernadero, con plántulas inoculadas del frijol caupí, el tratamiento cepa Rizo E10 tuvo un buen crecimiento en la parte aérea y radicular, reflejado por un mayor número de hojas y peso seco en comparación con el control N+ (KNO3) y agua.
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