INTRODUCCIÓN

Lonchaea Fallen (Lonchaeinae: Lonchaeini), es el genero mas grande de los nueve que se reportan actualmente para la familia Lonchaeidae a nivel mundial. Este genero se encuentra en todas las regions zoogeograficas, excepto la Antartida, con 218 especies descritas (MacGowan & Rotheray, 2019). De acuerdo con sus habitos alimenticios y por sus efectos sobre la producción de frutas, el Instituto Colombiano Agropecuario ICA mediante la resolución 001 del 2011, estableció que algunas especies de la familia Lonchaeidae se consideran en la categoría de moscas de la fruta (ICA, 2011). Así mismo, en los planes de trabajo de exportación de frutas se incluyen especies de esta familia como de importancia cuarentenaria. En particular, el Oiler° Lonchaea ha sido reportado como plaga en cultivos comerciales de pasifloras (Chacon, 1984) y Pitahaya (Medina & Takumasa, 2012); sin embargo, no existen estudios epidemiologicos amplios para este grupo.

Se conoce muy poco sobre la taxonomia del genero Lonchaea, el cual parece estar bien representado en America tropical. Aunque solamente 29 especies se han registrado para la región Neotropical, existen seguramente muchas especies por describir, cuya gran similitud morfologica, hace sumamente dificil su determinación (Korytkowski & Ojeda, 1971).

La identificación taxonomica de los especimenes causantes de dafio y pertenecientes al Oilero Lonchaea, se basa principalmente en los caracteres morfologicos de los machos, condición de uso general para muchos insectos especialmente en el orden Diptera. Dado el alto porcentaje de hembras recuperado con las metodologias tradicionales de muestreo y su dificil identificación, se hace necesario considerar metodologías complementarias a la morfología tradicional para asegurar una adecuada identificación. Para este caso se ha considerado de importancia la metodología del codigo de barras; que no es mas que un sistema de identificación y descubrimiento de especies usando una sección corta de ADN de una region estandarizada del genoma (Hebert et al, 2003).

De acuerdo con Lanteri (2007)uno de los aspectos positivos de la iniciativa "codigos de barras de ADN" es que posibilita la asociación de los distintos estados de desarrollo ontogenico o de sexo de la misma especie. En concordancia con lo anterior, la presente investigación asigno las secuencias código de barras a individuos del genero colectados en campo, incluyendo algunos determinados hasta especie o morfoespecie mediante estudio detallado de su morfología y trabajo con un especialista. De esta forma se asigno la identidad a las hembras de acuerdo con su ubicación en los M-OTUs definidos por las secuencias. Este se considera un avance importante hacia el uso de la taxonomía integrativa y en particular la incorporación de caracteres moleculares para el trabajo con el Oilero Lonchaea.

MATERIALES Y METODOS

2.1. Muestras estudiadas

Del material colectado por el sistema de monitoreo de moscas de la fruta del Instituto Colombiano Agropecuario ICA en el departamento de Antioquia entre marzo de 2018 y enero de 2019, se seleccionaron 100 muestras. De estas, 44 fueron obtenidas a través de muestreo de frutos de pasifloras y 56 de trampas McPhail cebadas con proteína hidrolizada de maíz, enriquecida con borax. Del material colectado en las trampas se seleccionaron los especimenes del Oilero Lonchaea los cuales fueron previamente identificados con base en caracteres morfologicos utilizando las diagnosis y claves taxonomicas propuestas por Korytkowski & Ojeda (1971); Luna (1987) y que fueron corroborados por el experto en el grupo lain MacGowan y posteriormente depositados en la coleccion del Museo Entomologico Francisco Luis Gallego de la Universidad Nacional de Colombia sede Medellin MEFLG (NC MEFLG 50849 a MEFLF 50950); finalmente, se tomó una submuestra de especimenes de cada sitio con el fin de realizar la extracción de ADN, la amplificación de la region de interes y los demas procesos hasta la obtención de las secuencias a partir de cada uno de los especimenes del genero; las cuales fueron subidas al Genbank con codigos de accesión MZ189743 a MZ189778.

2.2. Extracción de ADN

Para la extraccion se utilizo el kit DNeasy 250 Blood & Tissue (Qiagen, Alemania) y se siguio el protocolo sugerido por el fabricante. De cada individuo se tom° el torax y dos patas, las demas estructuras se guardaron para los montajes de genitalias y como referencia para la identificacion con base en caracteres morfologicos. El exit° de las extracciones se verifico mediante cuantificacion de ADN, inicialmente en un espectrofotometro UV-VIS de barrido espectral y posteriormente en una electroforesis en un gel de agarosa al 0.1% con GelRed a 80 voltios durante 45 minutos.

2.3. Amplificacion y secuenciacion de coil

La amplificación, usando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa, PCR se realizo en un volumen de reacción final de 30 pl y los primers universales; LCO-1490 (5' - GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3') y HCO-2198 (5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3') (Folmer et al, 1994), incluyendo 3 pL de buffer 5x, 1.92 pL de 10 mM dNTPs, 2.6 pL de 25 mM MgC12, 0,5 pL Taq DNA Polimerasa de (5 U/ml) (Promega, USA), 0.96 pL de 10,uM de cada oligonucleotido; 15.26 pL H2O ultrapura y 4.8 pL de ADN. El programa de ciclo termico de PCR consistió en desnaturalización inicial de 5 min (94 °C), seguida por 35 ciclos de 94 °C durante 1 min (desnaturalización), 45 °C durante 1.50 min (alineamiento), 72 °C durante 1.50 min (extension), y una extension final a 72 °C durante 5 min y finalmente manteniendo a —25 °C hasta su análisis.

Luego de verificar la amplificación del fragmento de ADN objetivo se procedió a una purificación simple de los productos de PCR a través de un proveedor externo (Macrogen, Corea) y finalmente a la secuenciacion por el método de Sanger a través de un proveedor externo con un secuenciador automatic° ABI 3730x1 (Applied Biosystems').

2.4. Analisis de secuencias

La calidad de las secuencias obtenidas fue verificada a traves de programas bioinformaticos. Inicialmente a traves del programa Geneious Prime 2020.2 se verifico la calidad del electroferograma y seguidamente se hallo la secuencia consenso.

Durante el analisis para detectar la presencia de ADN mitocondrial nuclear NUMTS en las secuencias, segun lo sugerido por Song et al (2008), se examino la presencia de ambigüedades, lectura espectral ambigua y el ruido, entendido como dificil lectura de los picos. Posteriormente, se examine) la composicion nucleotklica para detectar sesgos y se verifico la ausencia de acumulacion de mutaciones, codones de parada e insercion o delecion. Posteriormente con el fin de verificar que las secuencias pertenecian al grupo estudiado se realize) un BLAST (Altschul, 2005) tomando como referencia el genoma de Ceratitis capitata Wiedemann, 1824 (NCBI: NC_000857.1), se alineo cada una de las secuencias para confirmar la identidad del gen.

Las secuencias consenso obtenidas para cada individuo se alinearon usando el algoritmo MUSCLE (Edgare, 2004). El alineamiento final fue caracterizado en terminos de variabilidad nucleotidica y frecuencia de transiciones y transversiones. El nermero de haplotipos se estimó en el programa DnaSP version 6.0 (Rozas et al, 2017).E1 analisis de divergencia entre las secuencias que correspondían a los individuos de 9 localidades, medido por distancias geneticas, se realize) a través del programa MEGA X (Kumar et al, 2018) las cuales fueron calculadas utilizando el modelo de distancia de Kimura 2 parametros - K2P (Kimura, 1980), con base en el cual se calcularon las distancias inter e intraespecificas con bootstrap de 10000 replicas. De acuerdo con los valores obtenidos se realize) el analisis Neighbour-Joining (NJ), el cual provee una representación gráfica de los patrons de divergencia entre especies.

2.5. Evaluación de la correspondencia morfología-molecular y asignación de identidad a las hembras con base en las secuencias

Para asignar la identidad de las hembras con base en su inclusion en M-OTUs de machos previamente identificados por morfologia y corroborados por expertos se utilizaron dos criterios de amplio use en estudios de esta Indole:

1. Los rangos de divergencia expresados como distancias geneticas: "la divergencia de la secuencia de codigo de barras de ADN entre la mayoria de las especies congeneres es generalmente superior al 2 %"

(Hebert et al, 2003), mientras que la variación intraespecIfica suele ser inferior al 1 % (Avise, 2000). Sin embargo, estudios realizados para el orden Diptera arrojan datos variables y se hace necesario realizar analisis puntuales; por ejemplo: Meier et al (2006) encontró que la variación intraespecifica e interespecIfica se superpone ampliamente en las secuencias coxl de Diptera (0 % a 15.5 %) con el 99 % de todas las distancias congenericas que caen en este intervalo.

En grupos cercanos a Lonchaeidae como la familia Tephritidae, las divergencias geneticas intraespecifficas basadas en el modelo K2P de las secuencias coxI entre 42 taxones de moscas de la fruta variaron de 0 a 10.3 % y las divergencias geneticas interespecificas mínimas oscilaron entre 0 % y 16.3 % con un promedio de 5.3 % (Kunprom & Pramual, 2019).

2. Las unidades taxonomicas moleculares operacionales (M-OTUs) fueron identificadas de acuerdo con las distancias geneticas intra e inter-especie calculadas y segan las agrupaciones dentro de un dendrograma inferido por el algoritmo de "Neighbor-Joining" (NJ) (Saitou & Nei, 1987) (modelo K2P, "bootstrap" = 10.000 replicas) (Felsenstein, 1985).

Adicionalmente, se llevo a cabo un analisis a través de un procedimiento automatico usando el software ABGD (Automatic Barcode Gap Discovery), a traves del sitio web del fabricante (https://bioinfo.mnhn.filabi/publiciabgd/abgdweb.html) (dia de ingreso 30 de julio, 2020), este software permite ordenar las secuencias en especies hipoteticas en funcion de la brecha de codigo de barras, que se puede observar siempre que la divergencia entre organismos pertenecientes a la misma especie es menor que la divergencia entre organismos de diferentes especies (Puillandre et al, 2012).

El programa ofrece tres modelos de distancia o separación, K2P (Kimura dos parametros), JC69 (Jukes & Cantor, 1969) y un modelo de sustitución simple. En el presente estudio se realizaron los analisis usando la version online, y el modelo escogido para las agrupaciones fue K2P.

Figura 1: Sitios de muestreo de especimenes de Lonchaea en Antioquia utilizados en este estudio. Los detalles de los sitios de muestreo se dan en la Tabla 1. Fuente: Elaboración propia.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Tabla 1: Códigos de las secuencias coxl de especies de Lonchaea colectados en Antioquia, Colombia relacionando especie, localidad, sexo e identificación de la secuencia.

Se purificaron y secuenciaron en ambos sentidos de la cadena de ADN, un total de 40 secuencias del mismo mimero de muestras para un total de 80 reacciones. Se obtuvieron 40 secuencias consenso del fragmento 5' del gen coxI, con un tamalio aproximado de 674 pb, cuyos ntimeros de accesion se encuentran en la Tabla

1. Del total, 22 secuencias corresponden a especimenes morfologicamente identificados de 7 especies del genero Lonchaea y 14 secuencias de hembras sin identificación a nivel de especie ademas de 4 secuencias provenientes de morfotipos de machos sin asignación por morfología. En cuanto a los sitios de ubicación de las trampas utilizados en este estudio, los detalles en la Tabla 1. Ademas, se indica los datos de cada una de las secuencias obtenidas. Todos los especimenes analizados provenían de colectas trampas McPhail ubicadas en cultivos de gulupa (Passiflora edulis f. edulis Sims 1818).

Tabla 2: Haplotipos de las secuencias coil

La verificación de la identidad de las secuencias realizada por comparación con el alineamiento de referencia de Ceratitis capitata Wiedemann, 1824 (NCBI: NC_000857.1) indico que las secuencias corresponden a las posiciones 1558 a 2234 del genoma mitocondrial de referencia, confirmando la amplificación de la región de interes que present6 un tamailo de 674 nucleotidos en promedio.

Las secuencias consenso fueron comparadas con secuencias del Genbank de la especie Lonchaea ragnari (HQ582074.1) y Lonchaea corea (KR660353.1) a través de la herramienta BLAST (Altschul, 2005)del Genbank, usando el algoritmo MegaBLAST en principio, para evaluar la brecha e identidad entre las secuencias. Se obtuvieron identidades por encima del 87 % y brechas menores a 2/651.

Posteriormente se realizo un alineamiento multiple utilizando el metodo de union de vecinos simple a traves del programa MEGA X. Para las 40 secuencias se obtuvieron 27 haplotipos (ver Tabla 2), donde todas las hembras sin identificar se agruparon en M-OTUs que inclulan con machos previamente identificados por morfologia y molecular.

Los haplotipos asignados a especfmenes previamente identificados por métodos morfologicos y corroborados por el experto fueron comparados con los haplotipos de hembras y machos sin determinar, para hallar la correspondencia entre los mismos. Para los 22 especimenes identificados correspondientes a 7 especies, se encontraron 17 haplotipos. En las 14 secuencias obtenidas a partir de las 14 hembras se encontraron 9

Figura 2: Distribución de frecuencias de divergencia genética intraespecifica e interespecifica de especimenes del getter° Lonchaea de Antioquia. Fuente: Elaboración propia.

haplotipos que correspondían a cuatro de las especies identificadas por morfología.

La divergencia medida como distancia génetica para los individuos previamente identificados por morfología como de una misma especie estuvo entre 0 y 2% con dos excepciones, L.aculeata 70-1 que vario entre 0 y 5.4 % y L.aculeata 23-1 con una variación entre 0 y 6.5 %. Para las secuencias de L. cristula la divergencia osciló entre 0 — 0.5 % siendo la especie con menor tasa de divergencia entre sus individuos con 9 individuos analizados con identificación previa por morfología. L. curiosa present6 una divergencia entre 0.3 % y 0.5 % para tres individuos analizados, L. longicornis presento distancias que fluctuaron entre 0 % y 0.8%, L. striatifrons presento una divergencia de 0 % entre sus dos individuos. Para L. aculeata la variación estuvo entre 2.2 % y 6.5 % siendo esta especie la de mayor divergencia y la que presenta valores que se solapan con la menor distancia entre especies.

Las divergencias medidas como distancias geneticas entre especies para las secuencias obtenidas de 22 individuos con igual ntimero de secuencias y separados por morfología en 7 especies, estuvieron entre 6.1 % ( L. cristula - L. striatifrons) y 16.9% ( L. cristula - L. longicornis). Asi, usando las 22 secuencias que representan 7 especies, se comprobo la presencia de un "gap de código de barras" ( ver Figura 2), con una separación intraespecifica entre 0.0 - 5.1 %, y una variabilidad interespecifica entre 6.1 %-16.9 %. Las distancias obtenidas son congruentes comparandolas con las de grupos cercanos como Tephritidae; donde variaron entre de 0 a 10.3 % intraespecie y entre 0% y 16.3 % entre especies (Kunprom & Pramual, 2019).

Figura 3: Dendrograma de NJ con el modelo K2P y bootstrapp de 10000 replicas para las 40 secuencias obtenidas. Machos: 1, Hembras: 2. Fuente: Elaboration propia.

Tabla 3: Distribucion de los M-OTUs obtenidos a travel de ABGD (Results of the Automatic Barcode Gap Discovery)

3.1. Asignación de identidad de las hembras y morfotipos sin asignación por morfología

3.1.1. Análisis NJ de las secuencias para el Oilero Lonchaea con material propio

El análisis de NJ (Figura 3) confirmo la identidad de las 14 secuencias obtenidas de especimenes hembra al ubicarlas en los M-OTUs correspondientes con base en sus haplotipos. También aparecen separadas cada una de las especies asignadas por morfologia con M-OTUs con soporte bootstrap del 100 %. Las unidades donde se incluyen especimenes para cada especie, recogen los especimenes provenientes de las diferentes localidades de las cuales estos provenfan, cuyas distancias geográficas maximas fueron 200 km. Dado que el analisis separa las secuencias de L. aculeata en dos M-OTUs, después de verificar las variaciones encontradas en morfología y los caracteres con que fue descrita inicialmente la especie, se infiere que, en efecto, las secuencias 70-1 y 23-1 pueden pertenecer a otra especie o que puede existir un complejo de especies, lo cual merece ser estudiado con mayor detalle.

3.1.2. Especies hipoteticas basadas en el Barcoding-gap

El análisis a través del programa ABGD separo las 40 secuencias propias en 10 grupos o M-OTUs (Ver Tabla 3, Figura 2), entendiendo estas como agregaciones de secuencias unidas por algún Indice de similitud (normalmente un corte de distancia predefinido) denotando que corresponden a una entidad bologica. El numero de grupos o M-OTUs, que equivale a las especies hipoteticas para este caso, no vario en la partición inicial realizada bajo los tres modelos (simple, JC y K2P), sugiriendo la existencia de 10 agrupaciones. Variando el porcentaje de divergencia hasta 5, el numero M-OTUs no varla, solamente una de las secuencias se mueve a otro grupo. Los resultados sugieren la existencia de 10 M-OTUs para todas las particiones con el modelo simple y de 10 con los modelos de JC Y K2P excepto cuando el porcentaje de divergencia es igual a 1 lo cual es poco probable entre especies de Diptera, donde p aumenta a 18. (Tabla 4). Bajo el modelo de sustitución K2P se identificaron 8 potenciales "gaps" del c6digo de barras. El total de secuencias se agrupo separando las especies que morfologicamente corresponden a una misma. Las 14 secuencias de hembras sin una determinación a nivel de especie por morfología quedaron separadas en 4 de

Tabla 4: Resultados del analisis ABGD (Results of the Automatic Barcode Gap Discovery)

Figura 4: Especies para las cuales se asignaron los haplotipos e information como herramienta para la identification Fuente: Elaboration propia.

los 10 M-OTUs correspondientes a las especies L. cristula (6), L. curiosa (2), L. longicornis(3) y L. aculeata (3). Las siete especies encontradas por morfología incluyeron todos los machos analizados excepto L. aculeata, que como se analizo en las distancias intraespecificas contenía dos individuos con una divergencia por encima del 5 % y que posiblemente pertenecen a una especie criptica o morfologicamente similar. Para las siete especies se provee una herramienta integrativa que permite asociar la identidad de organismos del genero Lonchaea sin importar el sexo (ver Figura 4). Usando 40 secuencias de las especies encontradas y 26 secuencias de 11 especies de la regi6n paleartica y neartica extraidas del Bold System, las secuencias utilizadas con origen en las bases de datos fueron sometidas a un proceso de depuración con el fin de identificar si cumplían con todos los criterios que garantizaran que su determinación taxonomica fue correcta por lo cual se trabajó con secuencias de 11 de las 24 reportadas en BOLD. Se obtuvo el dendograma correspondiente (Ver Figura 5); el cual exhibe una bifurcación inicial donde una rama contiene a la mayoría de especies tropicales y la otra rama incluye especies de la region paleartica y neartica como también algunas especies tropicales. En el M-OTU de las especies articas se alinearon L. curiosa, L. echinappinay L. chalybea, estando esta Ultima más cercana a las especies del grupo de especies tropicales. Lo anterior también corrobora lo encontrado por morfología donde se observa una gran similitud entre las especies L. cristula, L. striatifrons,

L. longicornisy L. aculeata, que ademas son las especies de mayor ocurrencia en Colombia. Las especies encontradas no cuentan con secuencias en las bases de datos, por lo que el presente estudio se muestra como un aporte importante a la taxonomia del grupo Cuando se incluyeron las secuencias de BOLD al análisis por NJ se observaron datos interesantes, por ejemplo, existe una clara separación entre las especies tropicales y las de origen neartico y paleartico (distancias intraespecificas vs distancias entre especies de 0.0 - 2.0 % y 6.1 -16.9 % para las secuencias propias, 0 - 0.8 % y 6.4 - 15 % respectivamente, para las secuencias de BOLD cuando se analizan de forma independiente), evidenciando que el origen geografico ha modificado las características de las especies del genero, lo anterior también se soporta en los datos de distancias para todos los individuos analizados en conjunto.

En las bases de datos por ejemplo BOLD se cuenta con un gran numero de registros, sin embargo, el numero de especies del Oilero Lonchaea solo asciende a 24 de las 218 reportadas a nivel mundial; los valores de distancias encontrados en el presente estudio coinciden con los estimados para las demás secuencias disponibles en las bases de datos. El 88 % de las secuencias encontradas en las bases de datos tienen como origen Centro de Genomica de la Biodiversidad de Canada (ver Figura 6) por lo que el presente estudio aportaría un mayor numero de secuencias que los demás depositarios de muestras reportados, ademas de ser las primeras secuencias reportadas para toda la region tropical incluyendo Latinomerica y el trópico africano. En cuanto a secuencias reportadas por países el estudio coloca a Colombia dentro del mapa como el segundo país con mayor amen) de secuencias de este grupo después de Canada y por encima de Estados Unidos, donde por tecnología y capacidad económica se debería tener un mayor numero de registros.

Figura 5: Dendrograma NJ con el modelo K2P y Bootstrap de 10000 replicas para todas las secuencias obtenidas mas 26 secuencias del genero Lonchaea de las bases de datos. Fuente: Elaboración propia.

Figura 6: Depositorios de secuencias de muestras del genero Lonchaea en el mundo. Fuente: Elaboración propia.

4. CONCLUSIONES

A través del use de la metodología del código de barras se logro conferir la secuencia correspondiente a 36 individuos distribuidos en 7 especies del genero Lonchaea. Todas las secuencias obtenidas pertenecen a especies que no contaban con datos en las bases de datos. Esto contribuye a ampliar la librería genética de esta secuencia para este grupo de insectos y evaluar la consistencia de esta región como marcador como herramienta para la identificación de especies. Ademas, se asignaron las secuencias de 14 hembras sin identidad a nivel especifico a M-OTUs con especies identificadas por morfología y corroboradas por expertos, ademas se logro determinar la presencia de tres morfotipos pertenecientes al genero Lonchaea a los cuales no se logro asignar a ninguna especie por morfología ni por molecular. Un mayor estudio de este grupo en las diferentes regiones mejorar la capacidad de crear un sistema de identificación basado en códigos de barras en Lonchaea y, en consecuencia, facilitard futuros estudios relacionados con la biología de estos insectos que en la actualidad es desconocida en muchos aspectos.

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