Resumen: El café, en las provincias de San Ignacio y Jaén, de la región Cajamarca, es el cultivo de mayor importancia económica. El objetivo de esta investigación fue identificar los hongos asociados a granos de café pergamino, granos oro verde y granos tostados. De los almacenes de tres empresas exportadoras (Organización Agraria Cafetalera El Diamante, Cooperativa Agraria Cafetalera CASIL LTD y Cooperativa Agraria y de Servicios Unión de Cafetaleros Ecológicos-UNICAFEC). Las muestras fueron probabilísticas de 20 kg de café pergamino. De estas muestras se seleccionaron submuestras de 1.0 kg de café pergamino, 1.0 kg de café oro verde y 1.0 kg de café tostado, para el aislamiento de hongos. Se aislaron los hongos de Aspergillus niger, A. flavus, A. oryzae, A. tamarii, A. fumigatus y Penicillium citrinum. A. niger tuvo mayor incidencia con 76.6 % al 91.2 % en granos de café pergamino y del 80 % al 97 % en granos oro verde. Otras especies aisladas fueron Chaetomium globosum, Neurospora tetrasperma y Rhizopus delemar en porcentajes de 0.0 a 4.2 %, de 0.0 a 3.0 % y de 0.0 a 1.6 %, respectivamente. En granos de café tostado no se desarrollaron hongos.
Palabras clave: Café,grano,hongo,pergamino,oro verde,tostado.
Abstract: Coffee, in the provinces of San Ignacio and Jaén, in the Cajamarca region, is the most economically important crop. The objective of this research was to identify the fungi associated with parchment coffee beans, green gold beans and roasted beans. From the warehouses of three exporting companies (Organización Agraria Cafetalera El Diamante, Cooperativa Agraria Cafetalera CASIL LTD and Cooperativa Agraria y de Servicios Unión de Cafetaleros Ecológicos-UNICAFEC). The samples were probability samples of 20 kg of parchment coffee. From these samples, subsamples of 1.0 kg of parchment coffee, 1.0 kg of green gold coffee and 1.0 kg of roasted coffee were selected for fungal isolation. The fungi Aspergillus niger, A. flavus, A. oryzae, A. tamarii, A. fumigatus and Penicillium citrinum were isolated. A. niger had the highest incidence with 76.6 % to 91.2 % in parchment coffee beans and 80 % to 97 % in green gold beans. Other isolated species were Chaetomium globosum, Neurospora tetrasperma and Rhizopus delemar in percentages of 0.0 to 4.2 %, 0.0 to 3.0 % and 0.0 to 1.6 %, respectively. No fungi developed on roasted coffee beans.
Keywords: Coffee, bean, mushroom, parchment, green gold, roasted.
Resumo: O café é a cultura economicamente mais importante nas províncias de San Ignacio e Jaén, na região de Cajamarca. O objetivo desta pesquisa era identificar os fungos associados aos grãos de café pergaminho, aos grãos de ouro verde e aos grãos torrados. Dos armazéns de três empresas exportadoras (Organización Agraria Cafetalera El Diamante, Cooperativa Agraria Cafetalera CASIL LTD e Cooperativa Agraria y de Servicios Unión de Cafetaleros Ecológicos-UNICAFEC). As amostras eram amostras de probabilidade de 20 kg de café em pergaminho. Dessas amostras, foram selecionadas subamostras de 1,0 kg de café em pergaminho, 1,0 kg de café verde dourado e 1,0 kg de café torrado para isolamento fúngico. Os fungos Aspergillus niger, A. flavus, A. oryzae, A. tamarii, A. fumigatus e Penicillium citrinum foram isolados. A. niger teve a maior incidência com 76,6% a 91,2% em grãos de café pergaminho e 80% a 97% em grãos de ouro verde. Outras espécies isoladas foram Chaetomium globosum, Neurospora tetrasperma e Rhizopus delemar em percentuais de 0,0 a 4,2 %, 0,0 a 3,0 % e 0,0 a 1,6 %, respectivamente. Nenhum fungo se desenvolveu em grãos de café torrados.
Palavras-chave: Café, grão, cogumelo, pergaminho, ouro verde, torrado.
Artículos Científicos
Hongos potencialmente ocratoxigénicos aislados de granos de café pergamino, oro verde y tostado en Jaén y San Ignacio, Cajamarca
Potentially ochratoxigenic fungi isolated from parchment, green gold and roasted coffee beans in Jaén and San Ignacio, Cajamarca
Fungos potencialmente ocratoxigênicos isolados de pergaminho, ouro verde e grãos de café torrados em Jaén e San Ignacio, Cajamarca
Recepción: 19 Septiembre 2022
Aprobación: 30 Octubre 2022
Autor de correspondencia: james_tirado@unj.edu.pe
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El café peruano se produce en 350 000 hectáreas de cafetales distribuidos en 10 departamentos, principalmente en las regiones de Amazonas, San Martín y Junín (Junta Nacional del Café, 2020) además de otras regiones como Ayacucho, Cajamarca, Cusco, Huánuco y Puno (ComexPerú, 2018). De este modo, el Perú es el noveno productor y séptimo exportador de café, siendo Estados Unidos el principal mercado (Cámara Peruana del Café y Cacao, 2017).
La calidad de los granos puede verse afectado por la acumulación de cadmio, arsénico, plomo (Condezo y Huaraca, 2018), herbicida glifosato (Tejeda et al., 2020), ataque de broca del café (Bustillo, 2006; Puerta y Pabón, 2018) y presencia de hongos que producen la ocratoxina A (Lugo-Melchor y Marino-Marmolejo, 2017). Estos hongos son organismos productores de esporas microscópicas, que sobreviven en condiciones de alta humedad o cuando hay agua en el medio (Agrios, 2005). Su desarrollo se debe a condiciones de almacenamiento inadecuadas que afectan la inocuidad en el producto final (Oliveros et al., 2016) como lo es en el café crudo o “verde” (Rodríguez, 2006). En granos con una humedad de 11.5 % puede haber producción de ocratoxina A, aunque la aplicación de buenas prácticas de higiene son medidas preventivas, en el manejo del café orgánico en pergamino (Díaz et al. 2018).
Los hongos productores de la OTA en granos de café corresponden a los géneros Aspergillus y Penicillium (Agrios, 2005; Rosas et al., 2004; Gamboa-Gaitán, 2012; Rojas et al., 2015) siendo los más importantes el hongo Aspergillus ochraceus G. Wilh. (FAO, 2005; Fujii et al., 2002) y Penicillium verrucosum Dierckx (Pitt, 1987). Otros hongos que, posiblemente, producen ocratoxina en café son A. carbonarius (Bainier) Thom (Rodríguez, 2006), A. niger Tiegh. (Bau, 2003; Carrillo, 2003), A. melleus Yukawa, A. sulphureus Thom & Church, A. auricomus (Guég.) Saito, A. ostianus Wehmer, A. petrakii Vörös-Felkai, A. sclerotiorum G.A. Huber, A. alliaceus Thom & Church, A. albertensis J. P. Tewari (Carrillo, 2003).
En granos de café pergamino brocado se aislaron a los hongos A. ochraceus, A. nidulans, A. terreus, A. niger, Penicillium spp., Rossellinia sp., Fusarium sp., Lasiodiplodia sp. y Curvularia sp. (Tirado y Matos, 2007) mientras que en café cereza se presentan los hongos Aspergillus spp., Penicillium spp., Fusarium spp., Cladosporium spp., Mucor spp. y Rhizopus spp. (Cajiao et al., 2016).
Por lo antes mencionado, el objetivo de esta investigación fue identificar hongos asociados a granos de café pergamino, granos de café oro verde y granos tostados, procedentes de Jaén y San Ignacio.
Población muestral, estuvo constituida por todos los granos de café en kg producidos en las provincias de Jaén y San Ignacio del departamento de Cajamarca, Perú, durante el periodo 2021, que se acopia en las empresas cafetaleras: Organización Agraria Cafetalera El Diamante, Jaén (Latitud: 5° 42´ 28´´ S; Longitud: 78° 48´ 28 ´´ W; Altitud: 731 m); Cooperativa Agraria Cafetalera CASIL LTD y Cooperativa Agraria y de Servicios Unión de Cafetaleros Ecológicos-UNICAFEC, San Ignacio (Latitud: 5° 08´ 46¨´ S; Longitud: 79° 00´ 16´´ W; Latitud: 1283 m).
El muestreo se realizó usando la técnica del Muestreo Aleatorio Simple, teniendo en cuenta que
todos los individuos de la población tuvieron la misma oportunidad de ser elegidos. Se procedió a extraer porciones de granos de café con ayuda de una pluma, recorriendo, en forma de zigzag, todo el almacén hasta obtener la cantidad de 20 kg, de muestra, de granos de café. Los granos muestreados, fueron envasados en sacos de polipropileno, previamente rotulados, para ser trasladadas al Laboratorio de la empresa Peruinka Industrias S.A. y al Laboratorio Certificaciones del Perú S.A.-CERPER.
Para obtener el tamaño de la muestra, se siguió el procedimiento de las Normas Técnicas Peruanas, de muestreo de café verde y pergamino. La muestra fue obtenida con ayuda del calador o pluma cuyas medidas son de 29 a 36 de diámetro interno, muestreando en 3 puntos de cada saco (Norma Técnica peruana ISO 666:2013) en una cantidad de 30 ± 6 g en cada uno de 10 sacos, si en el lote hubiese entre 10 y 100 sacos y no menos del 10 % del total, si en el lote hubiese más de 100 sacos (Norma Técnica Peruana ISO 4072:2016). De los 20 kg de muestra de granos obtenidos de cada empresa cafetalera, se realizó muestreos al azar para seleccionar la unidad de análisis. Con ayuda de un táper limpio, se extrajeron sub muestras de 1.0 kg de granos de café pergamino, 1.0 kg de granos de café oro verde y 1.0 kg de granos de café tostado.
El aislamiento de hongos en condiciones asépticas, con ayuda de la cámara de flujo laminar, los granos de café se sumergieron en hipoclorito de sodio al 1 % por 5 minutos. Se dejaron secar y se colocaron, con ayuda de una pinza previamente flameada, 10 granos en forma simétrica en cada una de 50 placas Petri esterilizadas de 100 mm de diámetro conteniendo 20 ml de medio de cultivo Papa Dextrosa Agar. Las siembras fueron incubadas a temperatura de 25 °C, hasta obtener el crecimiento de los hongos.
De las colonias de los hongos crecidos en las placas Petri, se cortaron rodajas, con un sacabocado, de 0.5 cm de diámetro, inoculándose en medio de cultivo PDA contenidas en placas Petri. Estás placas inoculadas con los hongos, fueron incubadas a 25 °C hasta lograr el crecimiento típico del hongo aislado. Los aislamientos purificados fueron sometidos a la extracción del ADN en la empresa Plant BIOTEC SRL, mediante los siguientes procesos:
El método de extracción se llevó a cabo usando el método de buffer CTAB (2%) propuesto por Karthikeyan et al. (2010). Los ADN fueron cuantificados en Nanodrop para evaluar la concentración y pureza.
El ensayo de PCR se llevó a cabo usando los primers ITS1/ITS4 usando la Taq DNA recombinant polymerase de Thermo Scientific. Los ciclos de PCR incluyeron la pre-desnaturalización a 94°C por 6 min, seguido de 35 ciclos de 94°C por 30 s, 17 54°C por 45 s, 72°C por 45 s y un paso de elongación final de 72°C por 5 min. Los amplicones fueron verificados en gel de agarosa al 1.5%. El ensayo se repitió por segunda vez para los aislamientos que no amplificaron en una primera etapa.
La secuenciación fue llevada a cabo en los laboratorios MACROGEN (Corea) usando el método Sanger de electroforesis capilar y en doble sentido de secuenciación.
El alineamiento de las secuencias se llevó a cabo usando MEGA 10 y las secuencias consenso fueron buscadas en la base de datos del NCBI usando la herramienta de búsqueda BLAST. La incidencia de hongos asociados a granos de café. Se calculó
mediante la ecuación 1.
[1 ]Se identificaron los hongos Aspergillus niger, A. flavus, A. oryzae, A. tamarii, A. fumigatus, Penicillium citrinum. A. niger, sobre los granos de café mostró al inicio un micelio blanco que con el transcurso de los días formó el moho, característico, de color negro. Al ser purificado, en medio PDA, el hongo desarrolla masas de esporas de color negro. Por su parte, A. flavus, sobre los granos, desarrolló un moho de color verdoso brillante. A. oryzae mostró un moho de color marrón verdoso que al ser purificado desarrolló una colonia verdosa que conforme avanza la edad se tornó de color un tanto marrón. El hongo A. tamarii en los granos de café desarrollaron un micelio blanquecino al inicio que posteriormente, al esporular, los mohos se observaron de color marrón y marrón verdoso, en algunos casos. Al ser purificados, las colonias se mostraron de color marrón claro y en otros casos de color marrón chocolate. En cambio, A. fumigatus, tanto en granos de café como en el aislamiento puro, presentaron un moho de color verde azulado. P. citrinum sobre los granos de café afloraron como un moho verde grisáceo.
Otros hongos recuperados a partir de granos de café fueron: Chaetomium globosum que, sobre los granos de café, desarrolló una colonia blanquecina y en otros casos desarrolló una colonia lanosa amarillenta; Neurospora tetrasperma sobre los granos de café desarrolló un micelio con fibras marrones que al ser purificada la colonia se muestra blanquecina, y Rhizopus delemar
presentó una colonia lanosa con tonalidad marrón (Tabla 1 y Figura 1).
En café pergamino el hongo A. niger es el que se presentó con mayor incidencia con valores de 91.2%, 76.6% y 77.0% que corresponden a la Organización El Diamante, UNICAFEC y CASIL, respectivamente. El hongo A. flavus se presentó con una incidencia de 0.0 % hasta 5.2%; A. oryzae varía de 1.2% a 6.4%; A. tamarii de 1.2% a 4.0%; A. fumigatus de 0 % a 0.4% y P. citrinum de 0% a 2.8%. Los hongos C. globosum, N. tetrasperma y R. delemar, no superan el 5% de incidencia en granos de café pergamino (Tabla 2).
La incidencia de hongos en granos de café oro verde, al igual que en granos de café pergamino, el hongo A. niger es el que presentó mayor incidencia, con valores de 97%, 92.4% y 80% en la Organización El Diamante, cooperativa UNICAFEC y cooperativa CASIL, respectivamente. En la empresa CASIL, el hongo A. flavus no desarrolló su colonia mientras que en las empresas El Diamante y UNICAFEC obtuvo 0.2 % de incidencia. En cambio, A.oryzae presentó incidencia de 0.8% a 5.8%. A. tamarii solamente presento el 1.6% en la empresa UNICAFEC y no desarrolló en los granos oro verde de las otras empresas. A. fumigatus se presentó en la empresa El Diamante y CASIL con incidencia de 0.2% y 1.0%, respectivamente, y P. citrinum sólo se desarrolló en la empresa CASIL en un 0.2 % de incidencia. Los hongos C. globosum, N. tetrasperma y R. delemar no superan el 1.0% de incidencia. Al promediar los valores de la incidencia de las empresas El Diamante, UNICAFEC y CASIL (Tabla 3), se observa que el hongo A. niger presentó una incidencia del 81.6%, 89.8% y 0% en granos de café pergamino, granos de café oro verde y granos tostados, respectivamente.
Los hongos A. oryzae, A. tamarii, A. flavus, A. fumigatus y P. citrinum se presentaron con incidencia de 3.3%, 2.2 %, 1.9%, 0.3% y 1.2%, respectivamente; mientras que en café oro verde presentaron incidencia de 3.1%, 0.5%, 0.1%, 0.4 % y 0.1%, respectivamente.
Identificación molecular de hongos asociados a granos de café
Figura 1
Hongos asociados en granos de café. (A) A. niger: A-1 Desarrollados en granos, A-2 colonia pura, A-3 esporangióforo (45X); (B) A. flavus: B-1 Desarrollados en granos, B-2 aislamiento puro, B-3 esporangióforo (45X); (C) A. oryzae: C-1 desarrollado en granos, C-2 aislamiento puro, C-3 esporangióforo (45X); (D) A. tamarii: D-1 desarrollado en granos, D-2 aislamiento puro, D-3 esporangióforo (45X); (E) A. tamarii: E-1 desarrollado en granos, E-2 aislamiento puro, E-3 esporangióforo (45X); (F) A. fumigatus: F-1 desarrollado en granos, F-2 aislamiento puro, F-3 esporangióforo (45X); (G) P. citrinum: G-1 Desarrollados en granos, G-2 colonia pura, G-3 Fiálides (100X); (H) C. globosum: H-1 Desarrollados en granos, H-2 aislamiento puro, H-3 peritecios (10X); (I) C. globosum: I-1 desarrollado en granos, I-2 aislamiento puro, I-3 peritecio (10X); (J) N. tetrasperma: J-1 desarrollado en granos, J-2 aislamiento puro; (K) R. delemar: K-1 desarrollado en granos, K-2 aislamiento puro, K-3 zigoporangióforo (10X).
Porcentaje de incidencia de hongos asociados a granos de café
a=Número de granos afectados; b=Número de granos sembrados en medio PDA
Porcentaje de incidencia total en las tres empresas
a=Número de granos afectados; b=Número de granos sembrados en medio PDA
Los hongos, identificados, de los géneros Aspergillus y Pencillium son reportados como ocratoxigénicos (Luna et al., 2010; Rojas et al., 2015; Casas-Junco et al., 2018; Mantana et al., 2021). El hongo A. niger (Tabla 2) con 76.6% a 91.2%, de incidencia, en café pergamino y de 80% a 97% en café oro verde, coinciden con el reporte de Luna et al. (2010), quien reportó a A. niger con un 87 % y por Garrido-Ramírez et al. (2018) quien reportó una frecuencia de 82% a 89%. Es posible que, la alta incidencia de este hongo, daría lugar a la acumulación de la OTA en los granos de café, toda vez que A. niger es ocratoxigénico (Gamboa-Gaitán, 2012; Luna et al., 2010).
Por otro lado, A. flavus, A. fumigatus y Penicillium sp. fueron las especies con baja incidencia además que no son reportados como productores de OTA en café (Luna et al. 2010), pues A. flavus sólo produce aflatoxina (Arrúa et al., 2013) y A. fumigatus es ocratoxigénico, pero en cebada a nivel in vitro (Márquez-Benavides et al., 2022). Asimismo, A. tamarii tampoco produce ocratoxina (Frisvad et al., 2019) ni aflatoxinas (Abarca et al., 2000). El hongo A. oryzae también ha sido aislado de granos de café brocados (Alves et al. 2020) pero no es ocratoxigénico (Abarca et al., 2000; González, 2010) sino se comporta como detoxificador de OTA (Xiong et al., 2020); aunque, no se descarta que A. oryzae y A. tamarii sean ocratoxigénicos (Jeska-Skowron et al., 2017).
Alvindia y Acda (2010) reportaron a P. citrinum incidencia de 2.14% en granos de café lo cual coincide con la presente investigación ya que este hongo se presentó en porcentajes de 0.1 a 1.2% (Tabla 3), pero no existen reportes de la producción de OTA en granos de café por éste hongo, el mismo que produce citrinina, en maíz (Martínez, 2003). Por
su parte, Jeska-Skowron et al. (2017) manifiesta que P. citrinum posiblemente es productor de OTA.
Los hongos Chaetomium globosum (Zichao et al., 2018), Neurospora tetrasperma (Gladieux et al., 2022) y Rhizopus delemar (Gryganskyi et al. 2018), no son reportados como productores de ocratoxina A
En café tostado, Casas-Junco et al. (2018) recuperó Aspergillus en un 95.4 % y Penicillium un 4.5%, pero otros reportes indican que la cafeína actúa como fungicida (Montes- Belmont et al., 2000) y que al aplicarse en concentraciones de 0.1 a 1.0% de cafeína inhibe el desarrollo de A. flavus, Fusarium semitectum, Fusarium sp., Penicillium sp., A. niger y A. ochraceus (Fujii et al., 2004) y en concentraciones de 10 mg/mL de cafeína inhibe completamente el crecimiento de A. niger, A. terreus, Chaetomium globosum y Cladosporium herbarum (Kwaśniewska et al., 2018). Esto demuestra que la cafeína ha impedido el desarrollo fungoso, ya que, en granos de café tostado, no desarrollaron hongos.
Se aislaron, en granos de café pergamino y oro verde, los hongos Aspergillus niger, A. flavus, A. oryzae, A. tamarii, A. fumigatus y Penicillium citrinum, posiblemente ocratoxígenos. En los granos de café pergamino y oro verde se aislaron hongos que no producen ocratoxina como Chaetomium globosum, Neurospora tetrasperma y Rhizopus delemar. Mientras que en los granos de café tostado no se desarrollaron hongos.
Universidad Nacional de Jaén, sector Yanuyacu, Ciudad Universitaria, Jaén, Perú; Email: james_tirado@unj.edu.pe
Identificación molecular de hongos asociados a granos de café
Figura 1
Hongos asociados en granos de café. (A) A. niger: A-1 Desarrollados en granos, A-2 colonia pura, A-3 esporangióforo (45X); (B) A. flavus: B-1 Desarrollados en granos, B-2 aislamiento puro, B-3 esporangióforo (45X); (C) A. oryzae: C-1 desarrollado en granos, C-2 aislamiento puro, C-3 esporangióforo (45X); (D) A. tamarii: D-1 desarrollado en granos, D-2 aislamiento puro, D-3 esporangióforo (45X); (E) A. tamarii: E-1 desarrollado en granos, E-2 aislamiento puro, E-3 esporangióforo (45X); (F) A. fumigatus: F-1 desarrollado en granos, F-2 aislamiento puro, F-3 esporangióforo (45X); (G) P. citrinum: G-1 Desarrollados en granos, G-2 colonia pura, G-3 Fiálides (100X); (H) C. globosum: H-1 Desarrollados en granos, H-2 aislamiento puro, H-3 peritecios (10X); (I) C. globosum: I-1 desarrollado en granos, I-2 aislamiento puro, I-3 peritecio (10X); (J) N. tetrasperma: J-1 desarrollado en granos, J-2 aislamiento puro; (K) R. delemar: K-1 desarrollado en granos, K-2 aislamiento puro, K-3 zigoporangióforo (10X).
Porcentaje de incidencia de hongos asociados a granos de café
a=Número de granos afectados; b=Número de granos sembrados en medio PDA
Porcentaje de incidencia total en las tres empresas
a=Número de granos afectados; b=Número de granos sembrados en medio PDA
