INTRODUCCIÓN

Desde diciembre de 2019 en la ciudad de Wuhan China se reportan los primeros casos del nuevo coronavirus conocido como SARS-CoV-2, mucho más contagioso que el MERS del 2012 y el SARS del 2002 demostrando una tasa de transmisión muy elevada, propagándose rápidamente por todo el planeta provocando una pandemia a nivel mundial.

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), una de las principales acciones para contener tanto el contagio como la propagación se centra en el aislamiento de las personas infectadas, teniendo que permanecer en cuarentena quince días. Los pacientes que han sido diagnosticados con el nuevo virus presentan sintomatologías como: tos, fiebre, opresión en el pecho, dolor de cabeza entre otros síntomas agudos. Sin embargo, lo más grave de la transmisión e infección son los casos reportados de individuos asintomáticos, lo que los convierte en focos de transmisión silenciosa (Bai et el., 2020). Se estima que hasta agosto del 2021, la cantidad de infectados ascendió a 206.693.357 de personas con 4.352.488 de muertes confirmadas (World Health Organization, 2021), cifras no tan exactas debido a las personas asintomáticas que han fallecido sin reportar la causa de muerte o han llevado un tratamiento en casa. El índice de mortalidad es elevado debido a la falta de acceso a recursos, la indisciplina de la sociedad, o un limitado acceso a pruebas de diagnóstico en poblaciones aisladas o empobrecidas; esta tasa de mortalidad se ha reducido significativamente gracias a los programas masivos de vacunación que se están accionando en todo el mundo (Pérez Abreu et al., 2020) (El Universo, 2021).

A pesar de esto, hay que tener en cuenta que el mecanismo de supervivencia del genoma viral es la mutación, desde su aparición se han reportados diversas variantes de preocupación por su mayor transmisibilidad (B.1.1.7; B1.351; P.1-B.1.617.2) y de interés por diferir morfológicamente de la cepa original (B.1.427/B1.429; P.2; B.1.525; P.3; B.1.526; B.1.617.1; C.37). Actualmente, la B.1.617.2 denominada como delta es dos veces más contagiosa que la cepa original (Davis et al., 2021), lo que ha causado preocupación a nivel mundial por los estragos que se reportan en la población. Uno de los mecanismos efectivos para controlar la propagación del virus es la detección temprana, de ahí nace la necesidad de acceder a pruebas rápidas con un alto índice de certeza para la detección del SARS-CoV-2 a fin de detener el contagio y mitigar el índice de mortalidad.

Las nanopartículas se encuentran en auge como nanomateriales prometedores que presentan una mayor sensibilidad a la detección de virus (Moitra, 2021) (Lizarazo Salcedo et al., 2018). Es por esto que han sido ampliamente usadas en el ámbito sanitario, gracias a que aumentan la actividad catalítica y desactivan hongos, bacterias y virus mediante la generación de especies reactivas de oxígeno o formas fototérmicas (Ahmad et al., 2018).

Asimismo, las propiedades de resonancia del plasmón superficial (RPS) que poseen las nanopartículas metálicas permitieron desarrollar biosensores fototérmicos para detectar SARS-CoV-2 (Qiu et al., 2020), de igual manera, las propiedades conductoras de este tipo de partículas han sido aprovechadas por los investigadores.

Por otra parte, el grafeno desde su descubrimiento en 2004 por los científicos Geim y Novoselov (2004), quienes ganaron el premio nobel en 2010 por sus innovadores experimentos respecto a este nanomaterial bidimensional (2D), que se distingue por sus inigualables propiedades físico–químicas, haciéndolo un material muy interesante, posee una configuración electrónica sp2, donde las bandas de valencia y conducción se tocan en el denominado punto de Dirac; además sus electrones ubicados en regiones de orbitales deslocalizados se desplazan con gran libertad por su estructura, como si se tratase de cuasipartículas con masa efectiva nula (Gallach Pérez, 2020), lo que conlleva a que el grafeno presente una gran conductividad, a diferencia de otros materiales esta propiedad no varía con la temperatura (Smith et al., 2019).

Cuando otras especies químicas forman algún tipo de interacción con los electrones π deslocalizados, la conductividad del grafeno se ve alterada (Herradón, 2020), esta alteración es cuantificada por los biosensores. Otras notables propiedades son: la permeabilidad al agua, es deformable, es ligero, soporta la radiación ionizante, no es corrosivo ni tóxico, y gracias a sus propiedades eléctricas y químicas es fácilmente funcionalizable, convirtiéndose en una alternativa atractiva para aplicaciones biomédicas (Priyadarsini et al., 2018) (Valencia Giraldo, 2011). En la actualidad, existen varios estudios que se basan en transistores de efecto de campo para detección de moléculas, virus, entre otros (Kuo et al., 2018) (Gong et al., 2019). Éstos poseen ventajas muy notables, entre las que destacan ultra sensibilidad con poca cantidad de analito y mediciones instantáneas que pueden ser recogidas por sistemas de procesamiento de datos para su posterior visualización y diagnóstico (Liu et al, 2019). Por otro lado, las sensores electroquímicos son un método muy prometedor en la detección de anticuerpos o patógenos gracias a su transducción de señales (De Eguilaz et al., 2020). Este tipo de biosensores, han avivado un alto interés en la comunidad científica mundial, como alternativa viable en el análisis de biomoléculas (Lu et al., 2009).

Por todo lo expuesto, en este estudio se discute la posibilidad de presentar una alternativa al uso de las pruebas comunes, dando oportunidad al campo de la nanotecnología y la nano-ingeniería para sustituir las pruebas actuales tanto de anticuerpos, antígenos o las PCR, por biosensores que emplean nanomateriales basados en grafeno.

Tomando en cuenta que este tipo de biosensores pueden ser funcionalizados con distintas moléculas para detecciones más selectivas y específicas, con un adecuado método de recolección de muestras podrían ser pruebas de detección confiables y rápidas. Además, podrían ser manipuladas por cualquier individuo desde la comodidad de su hogar, controlando de manera efectiva futuros brotes y trazas de otros virus, brindando una ventaja con respecto a otras pruebas reportadas.

Se plantea analizar principalmente al grafeno funcionalizado con propósitos de bioingeniería para la detección de SARS-CoV-2, evaluando la fiabilidad de los dispositivos en función de diferentes indicadores (tipo de grafeno, proteínas detectadas, tipo de sensor, costo, tiempo y límite de detección), a fin de establecer si este tipo de biosensores son una alternativa viable para su escalamiento a nivel industrial (Torrente Rodríguez et al., 2020) (Mojsoska et al., 2021).

MATERIALES Y MÉTODOS

La presente revisión se desarrolló empleando una metodología mixta, a fin de establecer la viabilidad para el uso y la masificación de dispositivos basados en grafeno con propósitos de detección e identificación del SARS-CoV-2. Con base en la información estudiada, se han seleccionado los siguientes indicadores cualitativos: tipo de grafeno y tipo de biosensor. Cuantitativamente se seleccionó indicadores como: número de proteínas que detecta el biosensor, costo, tiempo y límite de detección. Entre los artículos elegibles se escogió aquellos que permitían una comparación cuantitativa y cualitativa de los diferentes dispositivos, otra métrica considerada fue el impacto que han tenido en la comunidad investigativa. El proceso metodológico del estudio se resume a continuación en el diagrama de flujo que presenta la figura 1.

Figura 1
Proceso de verificación de información y selección de los artículos científicos a ser discutidos.

RESULTADOS

SARS-CoV-2

El SARS-Cov-2 (síndrome respiratorio agudo severo coronavirus 2) pertenece a la familia Orthocoronavirinae y al subgénero Sarbecovirus que engloba a otras especies causantes de infecciones leves e incluso mortales a humanos (Zhu et al., 2019). El SARS-CoV-2 ha sido el séptimo coronavirus en contagiar a personas, precedido de otras especies de coronavirus (229E, NL63, OC43, HKU1, MERS-CoV y el anterior SARS-CoV) (Yüce et al., 2021).

La morfología estructural del SARS-CoV-2 está conformado por las glicoproteínas spike (S), proteínas de envoltura (E), proteínas de membrana (M) y en el interior el RNA viral pegado a la proteína nucleapside (N) (Díaz-Castrillón y Toro-Montoya, 2020). De todas las nombradas, aquella que juega un papel relevante en la infección, es la proteína S que está formada por 3 sub-unidades iguales (S1, S2, S3), organizadas en forma de círculo que se unen para encajar como una llave con el receptor ACE-2, esta unión es mediada por el RBD (Receptor Binding Domain) (Tolosa, 2020). Tomando en cuenta que, ACE-2 forma parte de una ruta bioquímica que interviene en procesos regulatorios como la presión sanguínea o inflamación, cuya actividad principal es modular a la angiotensina 2 para prever sus efectos dañinos.

En marzo de 2020, se encontró una variante del SARS-COV-2 que contiene una sustitución D614G (de ácido aspártico a glicina en la posición 614) de la proteína S, esta mutación se expandió rápidamente por todo el mundo posicionándose como una mutación predominante en toda la población, distintas investigaciones en modelos animales y humanos mostraron que estas mutaciones D614G pueden ubicar su dominio de unión RBD a modo de interactuar más eficientemente con el receptor ACE2 (Kantor et al., 2021), esta variación en el virus está asociada con una carga viral ARN más alta en la zona nasofaríngea, lo que aumenta la transmisibilidad.

Métodos de detección del virus SARS-COV-2

Actualmente, existen diferentes métodos de detección del virus como: RT-PCR (Real-Time Polymerase Chain Reaction), pruebas que detectan antígenos, y pruebas que detectan anticuerpos.

RT-PCR, es una versión de PCR en tiempo real desarrollado explícitamente para la detección de ARN del virus. Esta técnica es suficientemente específica, y muestra una alta fiabilidad (Yüce et al., 2021) (Green, 2020). Está fundamentada en 2 reacciones consecutivas, la primera convierte el ARN en ADN complementario con el uso de la enzima de transcripción inversa, la segunda amplifica la muestra de ADN por reacción de cadena de proteínas, empleando cebadores específicos de sondas y genes de hidrólisis marcadas por fluorescencia (Yüce et al., 2021). En la Tabla 1 se resumen algunas de las pruebas PCR permitidas por la FDA con autorización de uso de emergencia.

Por otra parte, las pruebas de antígenos se basan en la detección de un antígeno, substancia, o cualquier molécula que produce la activación del sistema inmunológico, y posteriormente produce la generación de anticuerpos para neutralizar agentes patógenos externos, protegiendo así el cuerpo humano (Yüce et al., 2021). Las pruebas de antígenos a diferencia de los métodos basados en PCR, permiten encontrar estructuras presentes en el virus como: liberación de glicoproteína S, proteína M, proteína N, o virus sin etapa de amplificación (Green et al., 2020).

En la tabla 2 se presenta los principales resultados acerca de las pruebas que detectan antígenos, se hace referencia a diferentes tests aprobados con autorización especial emergente por la FDA, donde se muestra el tipo de proteína detectada, la sensibilidad, el límite de detección (LOD), el tiempo de procesamiento de resultados, entre otros parámetros estudiados.

De la misma manera, los anticuerpos son proteínas generadas por el sistema inmunológico del cuerpo humano como reacción a la presencia de antígenos. Cada anticuerpo solo puede detectar a un único tipo de antígeno, eliminándolo del cuerpo (Yüce et al., 2021). Las inmunoglobulinas A(IgA), M(IgM) y G (IgG) son anticuerpos; IgA e IgM son detectables en la primera fase de la infección, se pueden detectar a partir del 5to al 7mo día posterior al iniciarse los síntomas. Posteriormente, se produce la fabricación de IgG como anticuerpos de memoria y protección; todas estas son secretadas en la sangre y mucosas (Jacofsky et al., 2020). A diferencia de las pruebas RT-PCR y antígenos, las pruebas de anticuerpos son de carácter cualitativo, semicuantitativo, y cuantitativo permitiendo establecer un nivel de presencia de anticuerpos (Tabla 4), el método más común empleado es el Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzima (ELISA) (Sethuraman et al., 2020) y el ensayo dispositivo de flujo lateral, que son tiras reactivas inmunocromatográficas. En la tabla 3 se recogen las pruebas de anticuerpos de diferentes fabricantes, donde se establece la proteína que se detecta, su nivel de sensibilidad y el tiempo de detección.

El grafeno y su funcionalización

El grafeno monocapa al ser de naturaleza hidrofóbica, precisa ser dotado con propiedades que conduzcan a la modificación covalente de los átomos de carbono, pasando de una configuración sp2 a sp3 (Aceituno Bueno, 2018), esto conlleva a cambiar la geometría hexagonal a tetraédrica, presentando enlaces más alargados, causando una distorsión geométrica que se extiende sobre múltiples posiciones de la red (Johns y Hersam, 2013); donde los electrones son compartidos por ambos átomos causando cambios significativos en sus propiedades electrónicas (Aceituno Bueno, 2018).

La funcionalización del grafeno es clave, puesto que se dota al nanomaterial de una afinidad covalente importante al momento de interactuar con las moléculas de sondas de detección, las cuales estarán en contacto con el analito, estas variaciones van a ser detectadas por el transductor de señales del biosensor. Por ejemplo, el grafeno funcionalizado con PBASE se emplea como enlazador heterobifuncional, ya que contiene un grupo pireno que se apila con el grafeno por superposición π - π y un éster de N-hidroxisuccinimida (NHS), que reacciona con aminas primarias presentes en las moléculas diana (antígenos, anticuerpos, material genético) (Kwong Hong Tsang et al., 2019).

Biosensores basados en Grafeno para detección de SARS-COV-2

Los biosensores de grafeno (Bio-G) detectan moléculas dianas específicas (ARN, antígenos o anticuerpos), de acuerdo con el ensayo que se desea aplicar para la detección, se recogen respuestas a partir de señales sensibles y rápidas. El principio de funcionamiento de los biosensores se basa en el cambio de la distribución de cargas a lo largo de la superficie del grafeno y del potencial eléctrico al unirse con las moléculas diana. Posteriormente se recoge la señal del transductor al medir las variaciones en conductancia, corriente, resistencia o voltaje (Yüce et al., 2021) (Chen et al., 2019).

El proceso de caracterización de los sensores es un paso fundamental en los artículos estudiados, mediante técnicas instrumentales como: Voltamperometría de Pulsos (DVP), espectroscopía de impedancia electroquímica, amperometría, voltamperometría cíclica, espectroscopía Raman, XPS, SEM, entre otras, se comprueba si las funcionalizaciones del grafeno con los enlazadores de detección están correctamente ensambladas. De manera que se mida, y verifique la fiabilidad y rendimiento de los biosensores.

En todos los casos las caracterizaciones se dieron en 3 etapas, las superficies de grafeno sin funcionalización, superficies funcionalizadas con bioreceptores y finalmente la respuesta a la unión con los analitos, de esta manera se fue corroborando y comprobando los cambios en el voltaje y la conductancia que se fueron produciendo al añadir al grafeno, las sondas y las moléculas diana.

Principio de funcionamiento físico – químico

Debido a la naturaleza hidrofóbica del grafeno monocapa muchas de las reacciones biológicas no podrían llevarse a cabo, de ahí que, es necesario añadir enlazadores como por ejemplo el ácido pirenobutírico (PBA) o éster succinimidílico del ácido 1-pirenobutanoico (PBASE) que constan de un grupo pireno y carboxílico, donde una vez funcionalizados con la capa de grafeno se unen mediante interacciones hidrófobas y de apilamiento π (Hinnemo et al, 2017).

Las capas de grafeno interactúan fuertemente con las unidades de pireno del PBA y PBASE, gracias a la afinidad de la unión covalente entre los grupos carboxilos de los enlazadores y los grupos amino de receptores de captura (Hinnemo et al, 2017), de esta forma sus propiedades se mantienen excelentemente conservadas. La detección de la señal eléctrica se basa en principios electroquímicos, donde se miden los cambios en la conductancia debido a las reacciones redox que ocurren en cada uno de los electrodos de trabajo al detectar los anticuerpos, proteínas o antígenos del SARS-COV-2 en los biosensores basados en sensores electroquímicos.

Una vez funcionalizado el grafeno-enlazador, otro punto importante son los receptores, la unión de los bioreceptores (anticuerpos, antígenos, enzimas u oligonucleótidos antisentido) identifican la molécula diana inmovilizada en el canal de grafeno o los electrodos de trabajo mediante reacciones químicas.

Sensores basados en arreglos de transistores efecto de campo con grafeno (G-FET)

De manera similar trabajan los biosensores G-FET donde se aplica un voltaje entre los electrodos fuente (S) y drenaje (D), donde se mide el flujo de corriente a través de la capa de grafeno como una función del voltaje del electrodo compuerta (G), que se mantiene en constante contacto con la solución buffer. Cuando se enlaza el complejo sonda de detección – molécula diana, la distribución de cargas del nivel de Fermi cambia en las inmediaciones de la capa de grafeno, modificando así su conductividad eléctrica. .El cambio de conductancia en el electrodo G, altera la cantidad de corriente que puede fluir entre los electrodos S y D (Zhang et al., 2020) (Mao, 2018).

Cabe mencionar que la mayoría de transistores analizados usaron grafeno monocapa producido mediante la técnica CVD, inmovilizado sobre el canal del transistor (Ghany et al., 2017). En la Tabla 5 se presentan los resultados más significativos en cuanto a biosensores de grafeno.

En la figura 2 (a) se puede apreciar el transistor desarrollado en la universidad de Pekín (UPK-2), donde se fabricó un chip conformado por 10 transistores efecto campo empaquetados en PQFP (paquete plano cuádruple de plástico), que mediante un apilamiento π-π se inmovilizaron sondas de ss-DNA en la superficie del grafeno monocapa y el antígeno. Para la detección de anticuerpos se usó una proteína recombinante a partir de la longitud completa de la proteína N y se conjugó con el dominio RBD de la proteína S (Ke et al., 2020), este sensor detecta ARN viral y la inmunoglobulina IgG, con un tiempo de detección de 10 minutos y un límite de detección de ARN viral que oscila desde 0.1 fg/ mL-1 a 1 fg/ mL-1.

Asimismo en la figura 2(b) se muestra un prototipo basado en un transistor FET (ULD-1) desarrollado en la universidad de Leiden, donde se efectuaron dos ensayos donde se funcionalizó el grafeno con dos enlazadores CSAb y ACE2, para determinar la afinidad de unión a la proteína de la subunidad S1 de COVID-19, donde CSAb demostró mejor afinidad de enlace con la sub-unidad S1 de la proteína S, lo que concluyó en una detección eficaz (Torrente Rodríguez et al., 2020). Con respecto al tiempo de detección, solo tardó de 2 minutos para mostrar los resultados una vez depositado el analito, y se necesitó un LOD de 2 pM aproximadamente (tabla 5).

Por otra parte, en Corea del Sur, figura 2(c) se desarrolló un FET (CNI-1), donde el grafeno monocapa fue previamente depositado sobre el canal, para luego sumergirlo en PBASE, y así exponerlo a un anticuerpo spike a fin de detectar el antígeno de la proteína S del virus, el tiempo de detección que reportan los investigadores es de 1 a 8 minutos una vez depositado el analito, con un LOD de 2,42 × 10 2 copias / mL. Cabe recalcar, que por lo general se usa albumina de suero bobino (BSA) para enjuagar la superficie de detección y evitar que se formen residuos que alteren la respuesta del biosensor.

Figura 2
Biosensores basados en transistores de efecto de campo para detectar SARS-Cov-2. (a) UPK-2 fuente: Ke et al., 2020 ; (b) ULD-1 fuente: Zhang et al., 2020 ; (c) CNI-1 fuente: Seo et al., 2020

Sensores basados en sistemas de electrodos

Generalmente un sensor electroquímico consta de 3 electrodos, el electrodo de trabajo (WE) de donde se deposita el analito y se generan las reacciones de oxidación – reducción, una vez generada la reacción, electrodo auxiliar o contra electrodo (CE) recoge las señales que produce el WE, y según el tipo de reacción produce un flujo de electrones que van hacia o desde el electrodo CE, este electrodo admite únicamente el transporte de la corriente. Posteriormente el electrodo de referencia (RE), que establece los valores de WE y posee una entrada alta de impedancia para no originar transporte de corriente a través del mismo (Arrieta-Almario y Tarazona-Cáceres, 2014). Finalmente, aplicando un potencial controlado (V) registra la respuesta del sensor, midiendo la corriente que circula por el sensor en función del tiempo (Bertrand, 1998).

En la figura 3(a) se presenta el diagrama de un estudio llevado a cabo en el Instituto Tecnológico de California (CTH-4), donde se grabó un sistema en poliimida que consta de un RE de plata (Ag/AgCl), un CE y 4 electrodos WE con grafeno monocapa multiplexados y funcionalizados con PBA, donde las unidades de pireno interactúan fuertemente con el grafeno y la sonda de detección está basada en ensayos de sándwich sencillo y doble (Torrente Rodríguez et al., 2020) (Ochoa Azze, 2012). Las muestras de sangre y saliva deben someterse a un pretratamiento y enjuagarlas con distintas soluciones (PBS y BSA) para formar suero purificado antes de agregarse sobre la superficie de detección.

Este sistema multiplexado es interesante, puesto que se agregaron 4 proteínas de captura específicas en cada WE para detectar distintas proteínas del virus. En la tabla 5 se reportan los límites de detección para la proteína C reactiva (CRP) en el rango de 10-20 μg mL -1 en muestras tipo suero, y 0.1-0.5 μg mL -1 en muestras de saliva. Mientras que, para la proteína nucleocápside (NP) el LOD se estableció en un rango de 0.1 a 0.8 μg mL -1 en muestras de suero y desde 0.5 a 2.0 ng mL -1 en muestras de saliva. Asimismo, la inmunoglobulina específica S1-IgG se detectó con un LOD establecido desde 20 a 40 μg mL -1 en muestras de suero y 0.2 a 0.5 μg mL -1 en muestras de saliva. Finalmente, la inmunoglobulina S1-IgM se detectó con un LOD de 20 a 50 μg mL -1 en muestras de suero y 0,6 a 5,0 μg mL-1 saliva) (Torrente Rodríguez et al., 2020). La detección simultánea de estas proteínas proporciona información sobre tres aspectos claves de la enfermedad: estado crítico, infección viral y generación de anticuerpos. Este dispositivo es capaz de generar una respuesta confiable un tiempo de 10 min, este sistema resulta interesante porque consta de un sistema electrónico que se encarga de enviar la señales mediante bluetooth al usuario y se visualizan los resultados en una aplicación (Torrente Rodríguez et al., 2020).

Siguiendo con el análisis en la Figura 3(b) se muestra otro experimento que se llevó a cabo en la Universidad de Illinois (UCH-1), un genosensor electroquímico que detecta de manera sensible y selectiva el ARN viral del SARS-COV 2, este sensor se diseñó sobre papel filtro usando una suspensión de nanoplaquetas de grafeno (Gnp) formando una película conductora vía spincoating, posteriormente se grabó sobre el papel/Gnp micro-Au electrodos, diseño que se presenta en la figura 3 (c). Para la fase de detección, se funcionalizó sondas de oligonucleótidos antisentido ssDNA con nanopartículas de oro (AuNPs+ssDNA) para un mayor rendimiento al reconocer y detectar el virus (Moitra et al., 2020) (Vikesland, 2018), esto debido a su gran área de superficie y propiedades conductoras (Ling et al., 2011) (Young et al., 2016). Este arreglo se unirá a dos zonas específicas del gen N, para obtener una aceleración en la transferencia de electrones, las Au+ssDNA fueron depositadas sobre los micro-Au electrodos (Alafeef, 2020).

Uno de los derivados de grafeno es el (rGO) es una capa de átomos de carbono similar a la del prístino pero con grupos residuales oxigenados los mismo que se tratan de eliminar mediante técnicas de reducción química (Dreyer, 2009).

Por otra parte, gracias a una colaboración entre la Universidad Carnegie Mellon y la Universidad de Pittsburgh (Figura 3c), se desarrolló un sensor UCM-2 (Ver tabla 5) basado en una celda electroquímica, donde en un portaobjetos de vidrio recubierto con cromo estampado (5 nm de espesor) y oro (100 nm de espesor) forma la capa base de los tres electrodos (WE, CE y RE) (Ali et al., 2020), para fabricar el canal donde se deposita la muestra se usó dimeticona (PDMS). Este sensor tiene un diseño singular con nano-impresión 3D AJ (aerosol jet), y se depositaron micropilares de AuNPs sobre el WE, a los cuales se agregó nano escamas de rGO unidas a dos antígenos virales como se indica en la figura 3 (c); la proteína S y el dominio RBD del virus, que son enlazadores para detectar la presencia de anticuerpos, esto se logró al activar los grupos -COOH de rGO usando una química de acoplamiento EDC: NHS (1-etil-3- (3-dimetil-aminopropil) carbodiimida, N-hidroxi-succinimida) (Liu et al., 2018). Así se facilita la formación de enlaces covalentes C-N entre rGO y antígenos a través de una reacción de amidación. Este sensor se puede reutilizar hasta 10 veces sin perder su sensibilidad, según los resultados obtenidos por los investigadores. Además, presenta límites de detección considerables; 2,8 × 10−15 M anticuerpos anti-proteína S1 contra el antígeno spike S1 y 16,9 × 10 −15 M anticuerpo anti-RBD contra (RBD).

Otro estudio reportado, comprende un inmunoensayo electroquímico URK-1 (Ver Tabla 5) a nivel de laboratorio que se realizó únicamente para detectar la proteína S como antígeno, adhiriendo a la superficie de grafeno (electrodo de trabajo) anticuerpos anti-proteína S como sondas de detección, este enfoque de antígeno anticuerpo es similar al canal de detección de dispositivo CNI-1, ambos utilizan el mismo mecanismo de anclaje entre el bioreceptor y el analito, la diferencia radica en que este dispositivo está basado en un inmunoensayo electroquímico sin etiqueta, que detecta la sub-unidad S1 de la proteína S. Se logró detectar una señal de respuesta por encima de 260 nM (20 µg / ml). La función de este sistema es detectar la perturbación de la señal obtenida de las mediciones de ferri / ferrocianuro después de la unión con el antígeno, este dispositivo reporta que se necesita únicamente 45 min desde la toma de la muestra, incubación hasta la detección (Mojsoska et al., 2021).

Para verificar la efectividad de todos los dispositivos reportados en esta revisión, los investigadores reportan que las muestras fueron estudiadas por el método tradicional de detección (RT-PCR), mostrando una efectividad de casi el 100 % en todos los casos.

Figura 3
Biosensores basados en sistemas de electrodos electroquímicos. (a) y (b) CTH-4 (Torrente Rodríguez, et al., 2020), (c) UCH- (Alafeef et al., 2020) , (d) UCM-2 (Ali et al., 2020)

DISCUSIÓN

Al analizar la viabilidad del uso de los transistores basados en grafeno para detección del COVID-19, es importante establecer una comparación cualitativa entre las pruebas PCR pruebas de antígenos y pruebas de anticuerpos, que actualmente se emplean para detectar estructuras de origen viral, por ejemplo, a diferencia de las RT- PCR, las pruebas de antígenos solo muestran la infección activa, más no el desarrollo de inmunidad, de manera que los anticuerpos son precedidos por los antígenos, es decir se forma un complejo de atracción entre ellos y son específicos de la molécula diana (Yüce et al., 2021), convirtiéndose así en pruebas más fiables que la de anticuerpos para identificar la fase activa de la enfermedad. Por otra parte, las pruebas de anticuerpos pueden ayudar a estimar cualitativa y cuantitativamente inmunoglobulinas G y M, con el propósito de conocer si el individuo estaba infectado con el virus, si ha desarrollado anticuerpos, cuánto tiempo estarán presentes en el cuerpo y si brindan inmunidad (Sharpless et al., 2021).

Los dispositivos reportados en este artículo se basan especialmente en 2 tipos de tecnologías; transistores de efecto de campo y sensores electroquímicos, ambos dispositivos tienen la ventaja de necesitar una mínima cantidad de grafeno a ser depositada en el canal y en el electrodo de trabajo respectivamente. Por otra parte, cabe resaltar que el grafeno monocapa actualmente es más costoso de obtener y sintetizar, puesto que para que se deposite o crezca la monocapa de grafeno sobre determinado substrato hace falta equipos de alto vacío, y para la fabricación de semiconductores es necesario cuartos limpios que requieren protocolos de limpieza estrictos y rigurosos (IEEE/IEC, 2011)(Phelan, 2021), es ahí donde incrementa el valor de la hoja de grafeno monocapa y dificulta su proceso de escalamiento a nivel industrial, aunque cabe destacar que las cantidades que se requieren para los electrodos y superficies de detección en estos biosensores son mínimas (Zhang et al., 2020) (Seo et al., 2020) (Ke et al., 2020).

Por otra parte, los sensores electroquímicos por lo general usan nanomateriales derivados de grafeno como óxido de grafeno reducido (rGO) y nanoplaquetas de grafeno, es interesante analizar por ejemplo el óxido de grafeno (Smith et al., 2019) (Maio et al., 2020) (Tene et al., 2020), puesto que al contener grupos funcionales es más fácil que se produzca la afinidad entre los enlazadores como el PBA y el PBASE (Kwong Hong Tsang et al, 2019) (Hinnemo et al., 2017) (Wu et al., 2015). Esto aporta una gran ventaja con respecto a los bio-sensores basados en transistores de efecto de campo, puesto que la etapa de funcionalización sobre la monocapa de grafeno ya no debería ser llevada a cabo.

Entre los dispositivos estudiados se observó que algunos son diseñados con nanopartículas de oro, dotando a la monocapa de grafeno con una funcionalidad extra y elevando de alguna forma la respuesta eléctrica en el dispositivo, visto desde este punto de vista, es interesante como el empleo de 2 nanomateriales puede ayudar al diseño y mejorar la respuesta de los sensores basados en grafeno (Alafeef et al., 2020). Cabe recalcar, que mientras más nanomateriales se emplee dentro de un dispositivo se corre el riesgo de elevar su costo final, lo cual no es conveniente para la industrialización de pruebas tipo POC (pruebas auxiliares ejecutadas por personal no clínico y externo a las instalaciones de un laboratorio).

En cuanto al costo, son pocos los dispositivos que reportan un costo real final, de una prueba para detección de COVID-19 utilizando nanomateriales basados en grafeno. De hecho, en nuestra investigación solo dos dispositivos mencionan el costo de la prueba como tal, el primero el dispositivo CTH-4 (Torrente Rodríguez et al., 2020) con un costo de 5 centavos por sensor, sin embargo no se menciona el costo total de todo el dispositivo junto con la aplicación (tabla 5). Mientras que el segundo, es un sistema basado en un sensor electroquímico con un costo final de USD$ 10 (Alafeef, 2020), los otros estudios solo reportan prototipos que son probados a nivel de laboratorio. Es interesante hacer mención del dispositivo CTH-4, puesto que los investigadores crean un diseño completo de detección, con una aplicación en la que se visualizan los resultados vía una aplicación en el celular, esto brinda al usuario la posibilidad de obtener un sistema de detección automatizado.

En cuanto a las proteínas detectadas, el dispositivo más eficiente es CTH-4, permite evidenciar 3 estados críticos de la enfermedad: respuesta inmune (IgG e IgM) (Li et al., 2020), infección viral (NP) (Diao et al., 2020), y gravedad de la enfermedad (PCR) (Gong et al., 2020), desde el punto de vista de las pruebas tradicionales, podríamos establecer una comparación con una prueba cuantitativa de anticuerpos, puesto que nos da trazas de 2 proteínas importantes en la generación de anticuerpos y desarrollo de la enfermedad (Jacofsky et al., 2020) (Ji et al., 2020). Por otra parte, la mayoría de los sensores desarrollados y reportados, presentaron la detección de proteínas N, S, ARN viral o IgG. (ver Tabla 5).

El siguiente parámetro para considerar depende del tiempo de detección, éste es fundamental para optimizar e incrementar el volumen de análisis clínicos, se analizó que todos los sensores necesitan purificación e incubación de muestras lo que representa un inconveniente si no se manipula de manera adecuada; aunque en comparación con las RT-PCR actuales son una alternativa altamente eficiente, ya que las pruebas moleculares requieren de mínimo 1 o 4 horas para ser procesadas y analizadas en laboratorios especializados. El tiempo de detección de los bio-sensores, varió en un intervalo desde 10 segundos a 12 minutos para detectar una señal medible en presencia del analito. Sin embargo, el reporte del artículo URK-1 muestra en sus resultados un tiempo de 45 min que incluye la incubación y detección de la proteína

Se debe recalcar, que aquel biosensor que presentó una respuesta en un tiempo más corto fue UCM-2, que detectó en un intervalo de 10 a 12 segundos anticuerpos de la antiproteína S1 con un LOD de 2,8 × 10−15 M y anti-RBD 16,9 × 10 −15 M, en suero fetal bobino y suero de conejo respectivamente (Ali et al., 2020).

Además, todos los dispositivos desarrollados presentan límites de detección ultra bajos capaces de competir con las pruebas convencionales PCR-RT, en esta investigación se reporta que el dispositivo capaz de detectar cantidades mínimas de analito y producir una señal detectable es el biosensor CNI-1, cuyo nivel de detección se ubica en- 2,42 × 10 2 copias / mL para virus completo y 100 fg / mL para la proteína S1. Tomando en cuenta que, las pruebas PCR que se reportan en este estudio detectan la presencia del virus en intervalos que van desde 137.850 copias/mL a 2730 copias / mL, este biosensor CNI-1 ofrece límites de detección bajos y sólo tarda entre 1 y 8 minutos en dar resultados. Mientras tanto, para los demás sensores estudiados no es posible establecer un límite de detección comparable con las pruebas tradicionales (antígenos y anticuerpos), ya que, reportan el límite de detección (LOD) en unidades de masa/volumen, sin poder diferenciar qué cantidad de muestra constituye ARN viral y ARN humano.

Los sensores basados en grafeno se presentan como una alternativa altamente viable, la funcionalización de este nanomaterial en sensores FET y sensores electroquímicos permite detectar con facilidad los antígenos especialmente con bajos límites de detección, en el orden de los 242 copias / mL (Seo et al., 2020), pudiendo ser comparados con los límites de detección de las pruebas PCR pero con tiempos de respuesta mucho más cortos. Los estudios se enmarcan en la detección de la proteína S y del RBD del SARS-COV-2, también se llevan a cabo ensayos para detectar anticuerpos y secuencias específicas de ARN, estos biosensores son altamente adaptables, y en caso de mutación únicamente se cambiaría la molécula a ser emparejada en la superficie detectora.

CONCLUSIONES

Los sensores investigados y reportados en este trabajo presentan tiempos de detección relativamente cortos en el orden de los minutos, con una sensibilidad comparada con las pruebas convencionales PCR. Además, los análisis realizados sugieren que existe la viabilidad para su implementación, pero por el momento a nivel de laboratorio, sí la síntesis de estos nanomateriales y los sistemas que se usan para la construcción de este tipo de bio-sensores se abaratarán en cuestión de costos, podría existir la posibilidad del escalamiento a nivel industrial, y podrían convertirse en una gran alternativa ante las pruebas tradicionales. En conclusión, los procesos de detección que usan grafeno podrían ser aprovechados para detectar trazas de otros virus, teniendo en cuenta que, se puede cambiar el bioreceptor, para detectar proteínas de nuevos virus, manteniendo el diseño base y el rendimiento del sistema de detección. Estos prototipos pueden diseñarse para reconocer otros agentes virales, lo cual puede convertirse en gran ayuda si se producen situaciones similares o futuras pandemias. El desafío actual es la reproducibilidad en gran escala del grafeno y su estabilización, además crear pruebas automatizadas que no requieran los tediosos procesos de tratamiento de muestras.

También se pretende reducir los requisitos técnicos, tiempo de respuesta, la viabilidad, menor riesgo de muestreo y preparación, para de esta manera lograr contener futuros brotes virales que produzcan emergencias sanitarias como la que causo el SARS-CoV-2, con una detección rápida y ensayos más económicos. Con la funcionalización de este nanomaterial se esperan aplicaciones en varios campos, en especial, este estudio muestra que el grafeno puede ser utilizado para desarrollar dispositivos ultrasensibles de detección, aprovechando sus propiedades físico-químicas y electrónicas.

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Información adicional

Cómo citar: Mena-Lizano, D., Acurio, E., Pachacama-Choca, R., & Tubón-Usca, G. (2021). Revisión acerca de biosensores basados en grafeno para la detección del SARSCOV- 2. FIGEMPA: Investigación Y Desarrollo, 12(2), 70–84. https://doi.org/10.29166/revfig.v12i2.3519