INTRODUCCIÓN
Cada año, unas 500.000 personas sufren una lesión de la médula espinal en el mundo, lo que aumenta su probabilidad de morir prematuramente.1 Según el Servicio Nacional de Rehabilitación de la Argentina, en 2013, se identificaron 2.176.123 pacientes con discapacidad (54% de hombres y 46% de mujeres), de los cuales el 30% sufría una discapacidad motora pura.2 Esto genera la necesidad de buscar nuevas terapéuticas que permitan mejorar la calidad de vida de los pacientes. Nuestra propuesta consiste en investigar el uso terapéutico de la hipotermia. En nuestro laboratorio, hemos demostrado su capacidad para reducir el daño del sistema nervioso central en modelos murinos de asfixia perinatal y trauma del nervio óptico, con resultados alentadores.3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 La reducción ligera de la temperatura corporal protege al sistema nervioso central contra daños de diversa índole.3,5,8,12,13,14
Numerosas publicaciones muestran que los niveles leves de hipotermia después de una lesión mejoran la función neurológica y reducen el daño histopatológico en la médula.14,15,16,17,18 El papel neuroprotector de la hipotermia está bien establecido en animales de experimentación y en pacientes con paro cardíaco (Hakim y cols., 2018), encefalopatía hipóxico-isquémica (Yum y cols., 2018), lesión cerebral traumática (Leng, 2017) y otras enfermedades (Zhu y cols., 2015). Aunque los mecanismos neuroprotectores de la hipotermia en diferentes enfermedades varían y aún no se han determinado por completo, la neuroprotección se ha atribuido comúnmente a su efecto sobre la disminución de la tasa metabólica, la reducción de la generación de radicales, la mejoría de la inflamación, la inhibición de la excitotoxicidad y la apoptosis. Se ha descrito el aumento de la expresión de diferentes proteínas inducibles por frío, como la CIRBP (cold-inducible RNA binding protein) y la RBM3 (RNA binding motif protein 3). La CIRBP, también conocida como CIRP o ribonucleoproteína heterogénea nuclear A18 (hnRNP A18), es una proteína de 18 kDa compuesta por 172 aminoácidos, cuyo gen se encuentra en el cromosoma 19, región p13.3 en los seres humanos. Al igual que otros miembros de la familia de las hnRNP, la CIRBP se une al ARN mensajero y ribosomal presente en la célula y regula su semivida, la expresión potencial de múltiples genes y, por tanto, su función. Tal como sucede con otras proteínas de unión al ARN, se ha visto que la CIRBP es capaz de modular la apoptosis jugando un papel antiapoptótico en situaciones de hipotermia. En células neuronales de rata, este efecto parece darse a través de la ruta de apoptosis mitocondrial, ya que muestran una disminución de la expresión de moléculas proapoptóticas (Bax, Bad, Bak, Cycs, Apaf1, caspasa-9 y caspasa-3). Recientemente, hemos mostrado el aumento de la expresión de la CIRBP en el asta anterior de la médula espinal de ratas sometidas a hipotermia sistémica.7,9,11,12,19,20,21,22,23,24 Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo de este estudio fue evaluar la protección medular del frío mediante la expresión de la CIRBP en motoneuronas del asta anterior de la médula espinal de ratas expuestas a una lesión medular y tratadas con hipotermia sistémica. Para ello, aplicamos nuestro modelo hipotérmico como tratamiento para la contusión medular (MASCIS®),25 y estudiamos la expresión de la CIRBP como proteína inducida por el tratamiento hipotérmico, y la de caspasa-3 y Neu-N para estudiar la viabilidad neuronal.
MATERIALES Y MÉTODOS
Modelo y diseño experimental
Los procedimientos se llevaron a
cabo de acuerdo con la guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio
de los NIH (National Institutes of Health
Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals-CCAC 2002; CCAC
2003). El protocolo fue aprobado por CICUAL, resolución Nro. 970/2015
(Universidad de Buenos Aires, Argentina). La rata Sprague Dawley (desarrollada
a partir de la Winstar) es una raza multipropósito exogámica de rata albina
utilizada ampliamente en la investigación médica. Entre sus ventajas están su
apacibilidad, facilidad de manejo y la experiencia que tenemos en el
laboratorio con esta raza, ya que, desde la década de 1980, trabajamos con
ellas en hipotermia.
Se utilizaron 24 ratas Sprague-Dawley macho adultas de 60 días de vida que fueron distribuidas en cuatro grupos (6 por grupo): a) de control, b) con lesión NT 12 h: lesión en normotermia a 24 °C y sacrificadas 12 h después de la lesión, c) con lesión NT 24 h: lesión en normotermia a 24 °C y sacrificadas 24 h después de la lesión, y d) con lesión HT 24 h: lesión en hipotermia a 8 °C, en cámara fría, durante 180 min y sacrificadas 24 h después de la lesión.24 A los animales se les administró anestesia intraperitoneal con una mezcla de xilazina (Rompun®, Bayer, Kiel, Alemania) 10 mg/kg del peso corporal y ketamina (Ketolar®, Pfizer, Alcobendas, Madrid, España) 60 mg/kg del peso corporal. Se colocó al animal sobre la platina quirúrgica con un realce torácico para mejorar la separación de espinosas y se usó una bolsa de suero tibio a 38 ºC como lecho para evitar la hipotermia durante el procedimiento. La médula espinal torácica se expuso quirúrgicamente mediante una incisión en el dorso y laminectomía de T9 a T11. La contusión medular se provocó con el impactador MASCIS®, de acuerdo con los protocolos publicados. Brevemente consiste en dejar caer una barra de 10 g de peso, que se eleva a 25 mm de altura, lo que da una carga lesional de 24 g al caer, esta impacta directamente en la región dorsal de la médula espinal de la rata en T9-T10.25 Luego de la contusión, la lesión se cerró quirúrgicamente y los animales fueron colocados en cajas individuales para su recuperación en condiciones de bioterio estándar a 24 ºC (grupos con lesión NT 12 h y con lesión NT 24 h), o expuestos a hipotermia a 8 °C, en cámara fría, durante 180 min, después de la lesión y luego trasladados para su recuperación en condiciones de bioterio estándar a 24 ºC (grupo con lesión HT 24 h). El control de la hipotermia se realizó según se detalla en estudios previos del grupo de investigación.7,8,9,10,11,12,13 El bioterio cuenta con ciclos de luz/oscuridad de 12/12 horas. Se utilizó Tylenol® para analgesia posoperatoria (65 mg/kg). La eutanasia fue por decapitación a las 12 o 24 h de la lesión según se indicó antes. El procesamiento de tejidos se realizó siguiendo el procedimiento descrito en publicaciones anteriores.12,26
Hematoxilina-eosina
Las médulas espinales a la altura
de la región torácica (donde se provocó la lesión) fueron incluidas en
parafina, cortadas con un micrótomo (Leitz, Lauda MGW, Alemania) en secciones
coronales de 5 µm de grosor y montadas sobre portaobjetos gelatinizados. Las
secciones medulares fueron hidratadas con xilol seguido de concentraciones
decrecientes de alcohol y procesadas mediante la tinción con
hematoxilina-eosina. Las secciones teñidas fueron observadas con microscopio
óptico (Carl Zeiss Axiophot, Alemania) conectado a una cámara digital (Olympus,
Q-Color 5, EE.UU.) y se procesaron mediante el
programa NIH Image (Wayne Rasband, 1995, NIH, Research Services Branch, NIMH,
Bethesda, MD, EE.UU.).
Inmunohistoquímica
Las secciones medulares fueron
rehidratadas, la peroxidasa endógena se inhibió con H2O2
(3% en metanol) y las uniones inespecíficas se bloquearon con incubación en
suero normal de cabra. Posteriormente las secciones se incubaron en cámara
húmeda toda la noche a 4 ºC con los anticuerpos primarios anti-CIRBP policlonal
de conejo (Proteintech®, Reino Unido, Cod. 00055668) en una dilución 1:1000 o
anti-Neu-N monoclonal hecho en ratón (Abcam, Cod. ab177487) en una dilución
1:1000. El anticuerpo anti-Neu-N reconoce una molecula de 46/48 kDa de masa
molecular conocida como proteina nuclear neuronal especifica (Neu-N o “NEUronal
Nuclei”) localizada en la zona de union con el ADN que esta presente en la
mayoria de las neuronas viables del sistema nervioso central, por lo que, en
esta investigación, se usó para la cuantificación de la viabilidad neuronal. Al
día siguiente, la inmunorreactividad se reveló con anticuerpo secundario
biotinilado especie específica: anticonejo (Vector Labs, EE.UU,
catálogo número PK-6101) o antirratón (Abcam Labs, EE.UU. ab6788) según
correspondiera, ambos en una dilución 1:200. La marcación se detectó mediante
diaminobencidina, usando el kit SK-4100 (Vector Laboratories, EE.UU.). El análisis del grado de respuesta y el número de
células inmunorreactivas se llevó a cabo con un microscopio óptico (BX40,
Olympus Optical Corporation, Tokio, Japón), acoplado a una cámara digital
(390CU 3.2 Megapixel CCD Camera, Micrometrics, España), empleando el programa
Micrometrics SE P4 (Micrometrics, España). Se analizaron tres animales por
grupo experimental.27
Procesamiento del tejido para Western
blot
Se incubó la membrana con el anticuerpo anti-CIRBP de conejo (Proteintech®, Reino Unido) en una dilución 1:1000 y el anticuerpo anticaspasa-3 monoclonal hecho en ratón, en una dilución 1:500 (Santa Cruz Biotech. A2921, EE.UU.). Luego, la membrana se incubó con anticuerpo anti-IgG de conejo (Amersham Pharmacia Biotech, EE.UU.), en una dilución 1:5000, o anti-IgG de ratón en una dilución 1:3000 (Amersham Pharmacia Biotech, EE.UU.) según correspondiera. Para el revelado se utilizó el kit de detección ECLTM (AmershamTM). Las bandas se visualizaron con el fotodocumentador UVP Biospectrum/Biolite (Analytik Jena). Se analizaron tres animales por grupo experimental. Para el control de carga se incubó la membrana con anticuerpo monoclonal de ratón anti-ß-actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) en una dilución 1:5000. El peso molecular de las bandas de proteína se estimó utilizando una escalera de proteínas comercial (PageRuler®, Fermentas UAB, Vilnius, Lituania).
Análisis de imágenes
Las imágenes de las secciones con
tinción de hematoxilina-eosina o inmunotinción se obtuvieron por microscopia y
fueron digitalizadas. La cuantificación de las neuronas inmunopositivas se
realizó de acuerdo con lo publicado previamente por nuestro grupo de
investigación.3,7,8,9,10,11,12,13 Las
secciones de médula espinal se seleccionaron de modo que fueran comparables
entre los distintos animales. La densidad óptica relativa de las neuronas
inmunopositivas y el número de neuronas inmunorreactivas se determinaron con el
programa de análisis de imágenes ScionImage. En la tinción con anti-Neu-N, se
consideraron motoneuronas viables a aquellas que presentaron una marca
homogénea en el núcleo y el citoplasma. Se analizaron 6 secciones por
anticuerpo y se contabilizaron 10 campos por sección utilizando un aumento x40.
Se consideró marca inmunopositiva a aquella cuya densidad óptica superó 4 veces
o más la densidad óptica del fondo. Para la cuantificación de la densidad
óptica de las bandas obtenidas por Western blot, se utilizó el programa
informático ImageJ (NIH, EE.UU.). Los valores de
densidad óptica de CIRBP y de caspasa-3 obtenidos en Western blot fueron
normalizados según el valor de densidad óptica de ß-actina correspondiente y
los resultados se expresaron como el valor medio del grupo ± la desviación
estándar, y en porcentaje respecto al grupo de control. Todos los experimentos
se realizaron por duplicado.
Análisis estadístico
Los datos se cargaron en una base
de datos, se analizaron con el paquete estadístico InfoStat versión 2020, y se
graficaron utilizando el programa GraphPad Prism (versión 5.0 para Windows,
GraphPad Software). A fin de determinar si las diferencias resultaban
estadísticamente significativas, se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de
una vía seguido del test de Tukey. Antes de la prueba
de hipótesis, se verificaron los supuestos de normalidad mediante la prueba de
Shapiro-Wilk modificada y de homogeneidad de varianzas con la prueba de Levene.
Se consideró estadísticamente significativa una diferencia p <0,05.
RESULTADOS
Western blot
Se obtuvo una banda de ≈20,5 kDa
indicando la expresión de CIRBP, de 37 kDa para caspasa-3 y de 42 kDa para la
actina (Figura 1A). En el caso de la CIRBP,
se puede observar un aumento significativo de la expresión en el grupo con
lesión HT 24 h con respecto al grupo de control y al de lesión NT 12 h (Figura 1B). En lo que respecta a la expresión de
caspasa-3, se aprecia un aumento significativo en los grupos con lesión NT 12 h
y 24 h con respecto al grupo de control. Cabe destacar que las ratas tratadas
con hipotermia (lesión HT 24 h) presentan una disminución significativa en los
niveles de caspasa-3 con respecto a ambos grupos lesionados en normotermia,
llegando a ser indistinguible del grupo de control (Figura
1C).
Morfología
Se obtuvieron imágenes del asta anterior de la médula espinal correspondientes a
las láminas VII, VIII y IX de Rexed, y se analizaron las motoneuronas alfa con
tinción tanto con hematoxilina-eosina como con inmunohistoquímica para CIRBP y
Neu-N.
Figura
1
A.
Western blot (WB) de los homogenatos
de médula de los 4 grupos, inmunotinción para CIRBP,
caspasa-3 y el control de carga con actina. B. Gráfico de semicuantificación de las
bandas de CIRBP por densitometría y análisis, test de ANOVA y test de Tukey. Se
observa una diferencia significativa entre el grupo con lesión HT 24 h y el
grupo de control (a/b p <0,05). C.
Gráfico de semicuantificación de las bandas de
caspasa-3 por densitometría y análisis, test de ANOVA y test de Tukey. Se
observa una diferencia significativa entre los grupos con lesión NT 12 h y NT
24 h, y los grupos de control y con lesión HT 24 h (p <0,05). NT = normotermia; HT = hipotermia; DO = densidad óptica.
Propia
Hematoxilina-eosina
En los controles, la estructura
está conservada con la distribución en H de la sustancia gris, se observan las
grandes motoneuronas; en los cortes de los otros grupos experimentales, se
puede ver una pérdida de cohesión marcada por una zona donde se produce una
degeneración temprana y desaparece la estructura neurológica, dando paso a una
cavitación lesional por ruptura medular con algunos elementos sanguíneos (Figura 2).
Figura
2
Cortes de médula espinal teñida con técnica de
hematoxilina-eosina. Aumento x10. Se observa una pérdida de cohesión marcada
por una zona donde se produce degeneración temprana y desaparece la estructura
neurológica habitual, dando paso a una cavitación poslesión
con algunos elementos sanguíneos. NT = normotermia;
HT = hipotermia.
Propia
Inmunohistoquímica
Expresión de la
CIRBP
Cualitativamente, en el grupo de
control, se observa una marca inmunorreactiva para CIRBP débil con distribución
citoplasmática, y su expresión es levemente superior en el núcleo y el
neuropilo. En las imágenes de ratas lesionadas NT 12 h y 24 h, la marca fue
algo mayor que la del grupo de control. El grupo con lesión HT 24 h mostró la
aparición de marca intensa en el núcleo y en forma de “gránulos”
citoplasmáticos, en las alfa motoneuronas y en el neuropilo circundante (Figura 3).
Al cuantificar la densidad óptica
para CIRBP, se observó un aumento significativo de la densidad óptica de CIRBP
en el grupo con lesión HT 24 h con respecto al grupo de control (p = 0,01), sin
diferencias con el resto de los grupos experimentales (Figura
4, Tabla 1).
Figura
3
CIRBP. Cortes comparativos. Aumento x40. Ampliación de
láminas VII y VIII de Rexed. Motoneurona con escasa
marca en los controles y a las 12 h de la lesión (punta de flecha). La marca
aumenta a las 24 h en normotermia con una expresión
mayor a las 24 h con hipotermia. Células gliales con mayor concentración en los
grupos lesionados (flechas). NT = normotermia; HT =
hipotermia.
Propia
Figura
4
Gráfico de cuantificación densitométrica
de la inmunohistoquímica con anticuerpos anti-CIRBP en cortes de médula espinal
de tres ratas por grupo: de control, con lesión NT 12 h y NT 24 h, y con HT 24
h. Como se observó en las microfotografías previas, hay un aumento progresivo
de expresión de CIRBP, que es menor en animales de control, moderado entre NT
12 h y NT 24 h, y significativo con HT 24 h. Mediante el análisis con el test de ANOVA y el test de Tukey, se observó una
diferencia significativa entre el grupo de control y el grupo con lesión HT 24
h (a/b p <0,001). NT = normotermia; HT =
hipotermia; DO = densidad óptica.
Propia
Tabla 1
Densidad óptica relativa de CIRBP en inmunohistoquímica
Nota: En el test de Tukey, se observa la diferencia significativa entre el grupo de control y el grupo con HT 24 h; si bien el incremento de CIRBP se observa en los grupos con lesión NT, la diferencia no es significativa entre ellos como así tampoco con los controles. NT = normotermia; HT = hipotermia.
Viabilidad celular por expresión de
Neu-N
Cualitativamente, al analizar la
distribución inmunohistoquímica de Neu-N, en los grupos con lesión NT, se ve
una disminución de la intensidad de la tinción nuclear, con un halo perinuclear
y núcleo excéntrico, retracción citoplasmática con membrana irregular. Algunas
células tienen aspecto de “neurona fantasma”, y se aprecia el incremento de
células gliales (Figura 5).
Figura
5
Neu-N. Cortes comparativos.
Aumento x4. Se puede observar la tinción franca en el grupo de control y el
grupo con lesión NT 12 h, también con HT 24 horas. NT = normotermia;
HT = hipotermia.
Propia
Sin embargo, en el grupo con
lesión HT 24 h, se observan neuronas en vías de muerte, pero en menor número (Figura 6).
Figura
6
Neu-N. Cortes comparativos.
Aumento x2. Controles con fuerte marca y glia
circundante sin marca para Neu-N, las lesiones NT 12
h tienen un leve aumento de la glia y pérdida de
tinción en algunas neuronas, algo mucho más marcado en las lesiones NT 24 h,
con neurona fantasma (punta de flecha) o neurona con núcleo excéntrico
(flecha). La lesión HT 24 h tiene un aspecto parecido al del grupo NT 12 h, con
algunas motoneuronas en vías de muerte, pérdida de tinción leve (punta de
flecha). NT = normotermia; HT = hipotermia.
Propia
Al cuantificar el número de
neuronas viables por campo en los cortes medulares teñidos con inmunomarcación
de la Neu-N, donde este anticuerpo marca la fibra neurológica de citoplasmas y
núcleos vitales, y se pierde tinción cuando la célula está muerta o en vías de
muerte, se contabilizaron las células con núcleo central y tinción
citoplasmática homogénea. Se observó una reducción significativa en los grupos
con lesión NT 12 h y NT 24 h comparados con el grupo de control (p <0,0001)
(Figura 7, Tabla 2).
Figura
7
Gráfico de cuantificación densitométrica
de la inmunohistoquímica con anticuerpos anti-Neu-N
en cortes de médula espinal de tres ratas por grupo: de control, NT 12 h y NT
24 h, y HT 24 h. Como se observó en las microfotografías previas, hay una
pérdida de expresión con destrucción neuronal progresiva entre las 12 h y 24 h
del grupo con lesión NT. En el grupo con lesión HT 24 h, se observa una
persistencia de la estructura de las motoneuronas viables. Mediante el análisis
utilizando el test de ANOVA con test de Tukey, se
observó una diferencia significativa entre el grupo de control y el grupo con
lesión HT 24 h (a/b p <0,001).
Propia
Tabla 2
Test multiparamétrico comparativo de Tukey.
Inmunohistoquímica Neu-N
Nota: Test multiparamétrico comparativo de Tukey. Recuento celular a un aumento x40 cada 10 campos de células viables con anticuerpos anti Neu-N en el asta anterior de la médula. Hay una diferencia significativa entre los grupos, excepto entre los grupos con lesión NT 12h y 24h. NT = normotermia; HT = hipotermia.
Asimismo, se comprobó un aumento
significativo en el número de neuronas viables en el grupo con lesión HT 24 h
comparado con ambos grupos con lesión NT (p <0,002). Sin embargo, los
niveles de neuronas en hipotermia no llegaron a alcanzar los niveles del grupo
de control (Figuras 6 y 8).
Figura
8
Neu-N. Cortes comparativos.
Aumento x40. En los grupos de control y con lesión HT 24 h, se puede observar
la tinción de la Neu-N con marcada intensidad nuclear
y moderada en el citoplasma de las motoneuronas (flechas). En tanto
que, en los grupos con lesión NT 12 h y NT 24 h, se visualizan neuronas en vías
de muerte (punta de flecha). NT = normotermia; HT = hipotermia.
Fuente
DISCUSIÓN
En la actualidad, se desarrollan modelos de lesión medular en animales buscando que sean fiables, coherentes y que reproduzcan las lesiones que se observan en los seres humanos.28,29Persisten interrogantes sobre su validez y si son comparables con las condiciones clínicas en los seres humanos, lo que muestra las limitaciones del artículo, y especialmente porque solo se evaluaron motoneuronas del asta anterior. Algunas revisiones han examinado los modelos de lesión de médula espinal y sus usos potenciales en la imitación de este cuadro.30,31
Las terapéuticas posibles con frío para evitar el daño neuronal después de una lesión de la médula espinal son de dos tipos: local y sistémica. La local se ha utilizado en la profilaxis de la isquemia medular durante la cirugía aórtica. En este caso, la hipotermia mediante enfriamiento epidural proporciona citoprotección,32pero, por lo complejo del procedimiento, se opta por la hipotermia sistémica,33 sus riesgos son conocidos: aumento de la incidencia de infecciones, insuficiencia renal, necrosis de zonas expuestas y escaras, por lo que su manejo debe ser prudente. La evidencia sugiere utilizar esta última cuando hay una lesión medular aguda.34
A la CIRBP se la considera una proteína citoprotectora, que acelera la recuperación de las células ante el estrés.35,36 Zhang la describe como un modulador de las telomerasas a 32 °C y a 37 °C. Esta se asocia con el complejo de la telomerasa activa a través de la unión directa del componente ARN de telomerasa (TERC) y regula la localización de la telomerasa en el “cuerpo de Cajal”.37,38 La posible interacción de estos cuerpos con ribonucleoproteínas pequeñas nucleares podría tener implicancias en fenómenos de protección generados a nivel nuclear. En 2019, Mingyue Liu (https://doi.org/10.1016/j.jtcvs.2018.08.100) describe los efectos neuroprotectores al reducir la degradación de la barrera hematoencefálica en ratas. Además, Lihui Chen publicó en 2013 (https:// doi.org/10.21203/rs.3.rs-2628773/v1) un estudio sobre la hipotermia y observó que la sobreexpresión de CIRBP en neuronas podría reducir la liberación de sustancias reactivas al oxígeno inducida por OGD/R (oxygen-glucose deprivation and reoxygenation [privación/reoxigenación de oxígeno-glucosa]) al reducir los niveles de malon-dialdehído y aumentar el nivel de superóxido dismutasa y glutatión, reduciendo la apoptosis neuronal inducida por OGD/R al regular negativamente la expresión de caspasa-3 y la regulación positiva de la expresión de Bcl-2 (efectos ya conocidos de la CIRBP).
A nivel experimental, la hipotermia sistémica tiene propiedades neuroprotectoras en isquemia cerebral y medular.39,40,41 Los ensayos para realizarla en modelos experimentales generan grandes dificultades debido a los costos y la complejidad de los sistemas.42,43 La mayoría tiene dos inconvenientes: invasividad y costos.
En investigaciones previas, hemos determinado que una breve exposición al frío induce la expresión de CIRBP en la médula de ratas a nivel torácico (T8-T9-T10), su expresión es significativamente mayor en animales expuestos a hipotermia con una cinética de expresión y localización horaria diferente posintervención.12 Sobre la base de este modelo, pasamos a una nueva etapa donde evaluamos la lesión medular y su tratamiento con frío, midiendo la expresión de CIRBP y el número de neuronas viables después de la lesión.
El uso del impactador MASCIS® está probado como generador de lesión contusiva medular y resulta útil para diversos tipos de estudio, por ejemplo, el publicado por Colón y cols., en 2017,44 con el uso de tamoxifeno como tratamiento posterior a la lesión. En este estudio, a las ratas se les provocó una contusión torácica (T10) usando el impactador, y se les administró placebo o gránulos de tamoxifeno (15 mg, por 21 días) con intervalos de 0, 6, 12 y 24 horas. Se practicó la eutanasia a los 2, 7, 14, 28 o 35 días de la lesión para estudiar los cambios moleculares y celulares en etapas aguda y crónica. La terapia inmediata o diferida (6 horas después de la lesión) mejoró la función locomotora, aumentó el tejido respetado de la materia blanca y la supervivencia neuronal.44 Si bien nuestro estudio no se extendió en el tiempo buscando etapas crónicas, los resultados inmediatos (24 h) usando frío luego de una contusión moderada son alentadores.
La investigación sobre los mecanismos fisiopatológicos de la lesión medular espinal ha dado lugar a un esquema de clasificación de lesión primaria y secundaria,45,46 incluso la secundaria se divide en fase aguda (de 0 a 48 h), fase subaguda (primeras 2 semanas) y crónica (luego de la anterior y dura años).47 Es importante resaltar y recordar a los autores que han marcado esta diferencia, ya que la acción terapéutica postrauma debe basarse en el tratamiento de la lesión secundaria mediada por la cascada inflamatoria, las citocinas, las proteínas proapoptóticas, así como las causas asociadas a la hipoxia relativa generada por múltiples factores, como la reducción de la presión arterial sistémica a causa del shock (puede ser por dolor o neurogénico o hipovolémico, o una combinación de todos), la hipoxemia por reducción de la ventilación generada por estados de coma o por la reducción en la excursión de la jaula torácica en inspiración y espiración debida al dolor.48
La familia de caspasas regula la ejecución del programa de apoptosis de los mamíferos. La caspasa-3 escinde varios sustratos “downstream” esenciales implicados en la expresión del fenotipo apoptótico in vitro (gelsolina, PAK2, fodrina, láminas nucleares y la subunidad inhibidora del factor de fragmentación del ADN8-12). La activación de caspasa-3 in vitro puede desencadenarse por eventos “upstream”, lo que lleva a la liberación de citocromo c de la mitocondria y la subsiguiente activación de procaspasa-9 por Apaf-1. Estudios en ratas mostraron que componentes de la vía apoptótica de la caspasa-3 se activan “upstream” y “downstream” después de una lesión contusiva de la médula espinal y ocurren temprano en las neuronas en el sitio de la lesión y horas o días después en la oligodendroglia adyacente y distante del sitio de la lesión.49 En nuestro estudio, vemos la presencia de necrosis y de mediadores de apoptosis, como la caspasa-3, cuya manifestación es mayor en los grupos con lesión NT 12 h y NT 24 h, su reducida presencia en el grupo con lesión HT 24 h es estadísticamente significativa, lo que, en parte, estaría explicado por el hecho de que el frío y, en particular, la CIRBP intervienen tanto en los procesos de apoptosis como de muerte celular bloqueándolos.
La proteína CIRBP actúa bloqueando varias de estas cascadas inflamatorias, de muerte celular y vías apoptóticas. Si bien, en este estudio, no se buscó marcar todas estas vías, sí podemos observar que hay una mayor cantidad de neuronas viables (Neu-N inmunopositivas) en el grupo con HT que en los grupos con NT, es similar a las lesionadas a las 12 h que a las 24 h normotérmicas, lo que muestra que probablemente estas cascadas han sido inhibidas por esta proteína.
Como limitaciones del estudio, debemos aclarar que se ha realizado con un número reducido de animales con el fin de adecuar la investigación a las normas de buen uso y cuidado de animales de laboratorio, por lo cual esta investigación deberá continuarse, aumentando el tamaño de la muestra, así como su prueba en otras razas de rata y otros modelos animales, con el fin de trasladar, en un futuro, esta investigación a la práctica médica.
Aníbal J. Sarotto sarotto@icloud.com
