Introducción

Las actividades agrícolas son una de las actividades que inciden en el deterioro de la calidad del agua, la utilización de plaguicidas y de medicamentos veterinarios, para el control de animales y plagas, que causen daño a los cultivos, estos residuos se adhieren a la superficie de la tierra y se mezclan con las aguas del cauce, el mal uso que les dan a los sistemas de tratamientos de aguas servidas en las provincias de Herrera y Los Santos (Domínguez, Panamá América, 2014, Baquero et al., 2008). Estas fuentes de agua sin protección pueden contaminarse con bacterias a través de aguas residuales y heces de vida silvestre, haciéndolas inaceptables para los humanos (Barrantes et al., 2013).

Las bacterias resistentes a antibióticos se excretan a través de las aguas residuales, llegando a los medios acuáticos, principal vía de dispersión en el medio ambiente, este tipo de resistencia puede resultar de una característica de todas las especies o presentarse entre cepas de especies que por lo general son sensibles, pero desarrollan resistencia por mutación o transferencia genética (Becares, 2011, OMS, 2012). Esto se ha convertido en un problema de salud mundial debido al desarrollo de nuevos fármacos antibacterianos (Pérez y Robles, 2013).

Estos microorganismos deben ser resistentes a los antibióticos de producción propia, y los genes que portan este rasgo pueden transferirse a organismos no resistentes: un problema que se agudiza por la presencia de antibióticos en el ambiente puede ejercer presión de selección a largo plazo para la aparición y transmisión de genes de resistencia a organismos que no los producen (González y Cardona, 2018, Pérez, 1998).

La resistencia microbiana está fuertemente asociada con el uso de antibióticos, la falta de control en la comercialización (automedicación), el incumplimiento de tiempo y cantidades en los tratamientos o incluso el uso de antibióticos para el crecimiento animal (Castro y Molineros, 2016; Muñoz et al., 2004).

Antibióticos como la amoxicilina y el sulfametoxazol se destacan entre los fármacos más prescritos en medicina humana y las sulfonamidas son ampliamente utilizados en medicina veterinaria y entre los antibióticos más comúnmente reportados en el medio acuático, están, las tetraciclinas, los aminoglucósidos, macrólidos, betalactámicos y vancomicina, junto con la automedicación, ejercen una presión selectiva a favor de las bacterias con determinantes de resistencia a los antibióticos (Tejada et al., 2014; Toba et al., 2018). De esta manera surge la idea de determinar cuan resistente son los microorganismos a la exposición de estos fármacos que por alguna razón llegan el agua de los ríos, siendo un problema para la eliminación total en los sistemas de tratamiento de las potabilizadoras, comprometiendo la calidad microbiológica del agua de consumo. El objetivo de este trabajo fue, evaluar la resistencia de bacterias aisladas provenientes de las diferentes plantas potabilizadoras de Azuero.

Materiales y Métodos

El diseño de esta investigación fue totalmente al azar, descriptivo, el cual se realizó en tres tomas de agua cruda en la región de Azuero, siendo estas la planta potabilizadora Rufina Alfaro de La Villa de Los Santos, Roberto Reina de Chitré y río Estivaná en Macaracas, tomadas las muestras de abril a julio del 2017, para luego procesarlas en el laboratorio de Calidad de Agua del Ministerio de Salud de la provincia de Los Santos. (Figuras 1 y 2)

Figura 1
Mapa satelital de la toma de Chitré y La Villa de Los Santos
Nota: El punto azul representa la toma de Chitré y el amarillo la Villa de Los Santos.

Figura 2
Mapa satelital de la toma de agua de Macaracas

Se tomaron 3 muestras en cada toma de agua de las plantas potabilizadoras de Azuero, mediante una (1) muestra con dos (2) repeticiones y se muestreó cada 15 días, lo que da un total de 18 muestras por mes. Con los puntos establecidos para las muestras se tomó un registro de los parámetros físicos utilizando un medidor multiparamétrico portátil (HI 9829) que midió la temperatura, oxígeno disuelto, pH, turbiedad, sólidos totales y conductividad, se utilizó frascos plásticos de 150 ml con tapa de rosca totalmente estériles en la recolección de las muestras, se procedió a recoger la muestra de agua en el río y se etiquetó cada recipiente, hay que recalcar que se tomó por cada punto tres muestras las cuales se transportaron en una hielera con hielo para mantener la temperatura de 5 °C aproximadamente, fue llevado al laboratorio de microbiología de aguas de la provincia de Los Santos donde se realizó todo el análisis microbiológico.

Una vez en el laboratorio, las muestras son filtradas a través de membranas de celulosa, según el Standard Methods (1995), donde se filtró 25 ml de agua recolectada. Luego de la filtración con unas pinzas estériles se tomó la membrana y se colocó en tubos falcón con caldo peptonado y caldo rappaport y se agitaron. También en platos de agar chromogenic coliforms y agar Hektoen enteric. Se incubarán a 37 °C por 24 horas. Al pasar las 24 horas se procedió a contar las colonias del agar chromogenic coliforms, ß-galactosidasa de color rosa o rojo como presuntas bacterias coliformes que no son E. coli. (Figuras 3 y 4).

Figura 3
Conteo de colonias en agar Chromogenic coliforms

Figura 4
Sembrado para el aislamiento selectivo

Para el aislamiento selectivo con ayuda de un asa (ver figura 4), se estrió en los tubos con caldo, para sembrar en los medios XLD (Xylose Lysine Deoxycholate agar), agar Cetrimide y TCBS (Thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose agar). Se incubaron a 37 °C por 24 horas. Las colonias seleccionadas fueron transferidas a un cepario con Agar Tripticasa de Soya, incubándose a 37 °C por 24 horas.

De cada cepario se realizaron pruebas bioquímicas recomendadas y descritas por el manual de identificación de bacterias, para la determinación de la fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa, producción de ácido sulfhídrico (H2S) y gas. La prueba de TSI (Triple Sugar Iron Agar), SIM, Citrato de Simmons y Nitrato.

Una vez identificadas correctamente las bacterias con las pruebas bioquímicas evaluamos la resistencia y la sensibilidad a los diferentes antibióticos. Se utilizó el método de Kirby Bauer por difusión, para lo cual utilizamos los siguientes discos (Tabla. 1).

Se tomó con un asa bacteriológica cultivo puro en agar nutritivo, se realizó una dilución en NaCl 0.9 %, hasta alcanzar una turbidez. Luego se introdujo un hisopo estéril en el tubo de cultivo, eliminando el sobrante, apretando el hisopo contra las paredes del tubo con movimientos rotatorios, se sembró en la placa de Agar Müller Hinton, estriando en 3 direcciones de manera que quede uniformemente distribuido. Seguidamente, se colocaron 6 discos en cada plato para antibiograma, con una pinza estéril a 15 mm del borde y 20 mm de equidistancia, presionándolos con delicadeza y se dejó reposar durante 15 minutos y se incubó a 37 °C por 18-24 h. Pasado este tiempo se procede a la lectura de las placas, midiendo con una regla milimétrica los halos de inhibición, incluyendo los 6 mm de diámetro del disco de antibiótico y categorizando si el antibiótico probado era sensible, intermedio o resistente.

Los datos fueron tabulados y analizados a través de pruebas no paramétricas, , la prueba de Kruskal Wallis para determinar si existe diferencia significativa entre los parámetros físicos de las diferentes tomas y los sitios de muestreo y la realización de la prueba omega cuadrado-llamada W2 para determinar asociación entre la abundancia de bacterias entre tomas de agua y la resistencia a los antibióticos.

Resultados

De acuerdo con la caracterización y aislamiento de bacterias y su frecuencia se puede observar que existen una gran ocurrencia de géneros bacterianos entre las diferentes tomas de las plantas (ver figura 5 y 6).

Figura 5
Géneros bacterianos aislados de las tomas de agua de las diferentes plantas potabilizadoras de la región de Azuero

Figura 6
Frecuencia de bacterias aisladas en las tomas de agua de las plantas Potabilizadoras

Los datos obtenidos en las 3 tomas de agua de la región de Azuero, realizando la prueba de antibiograma a las diferentes bacterias encontradas durante cada muestreo, los antibióticos Ceftriaxona y Ticarcilina presentaron resistencia a todos los géneros bacterianos encontrados (Tabla.3)

Al evaluar las tomas de agua de las diferentes plantas potabilizadoras Roberto Reina de Chitré, Rufina Alfaro de La Villa de Los Santos y el río Estivaná en Macaracas se puede observar que hay diferencias significativas entre los parámetros evaluados (Figura 7).

Figura 7
Análisis de parámetros físicos evaluados en las diferentes tomas de agua

Los datos de la Tabla 3 nos muestran la relación entre las bacterias aisladas con los antibióticos.

En conclusión, se identificaron 7 géneros de bacterias encontradas en las 3 tomas de agua de las plantas potabilizadoras de Azuero, encontrando gran abundancia de bacterias principalmente de Klebsiella sp., Citrobacter sp., E. coli. Los 7 géneros bacterianos demostraron resistencia a dos antibióticos Ticarcilina y Ceftriaxona. Se encontraron diferencias significativas entre los parámetros físicos y los coliformes evaluados de las diferentes tomas de agua. De acuerdo con el estudio no se encontró relación entre los antibióticos y la abundancia de bacterias.

Discusión

Un total de 54 cepas bacterias aisladas, fueron obtenidos, durante los meses de abril a julio del 2017. Los datos obtenidos presentan los valores de ocurrencia de diferentes géneros bacterianos obtenidos en las tomas de agua de las potabilizadoras de Azuero (Ver Figura 5), el género Citrobacter sp. se destaca en las 3 tomas de agua, con un total de 15 veces aislada, (Ver Figura 6) la frecuencia de los aislados de cada toma de agua siendo Citrobacter sp. con un 28%, Klebsiella sp. con 22% y E.coli con un 19%.

En una investigación realizada por (Chiroles et al., 2007) en el río Almendares, Cuba, encontraron que entre los aislamientos más frecuentes a Escherichia coli (69.7%), seguido de Klebsiella pneumoniae (9.7%), Enterobacter aerogenes (9.0%), Klebsiella oxytoca (7.1%), Enterobacter agglomerans (3.9%) y Citrobacter amalonaticus (0.6%). Los géneros bacterianos reportados en este estudio fueron similares a los identificados para este estudio.

En otro estudio similar por (Rivera et al., 2006) en el río Alseseca, Puebla, aislaron e identificaron 91% de enterobacterias de las muestras de agua, siendo E. coli la más frecuente (44%), también se identificó Klebsiella sp., Enterobacter sp., Serratia sp., Providencia sp. y Citrobacter sp. la presencia de estas bacterias patógenas en el río Alseseca representa un problema de salud pública, ya que pueden llegar al ser humano a través de los vegetales que se riegan con sus aguas. Los géneros Klebsiella sp. y Citrobacter sp. se encuentran con alta frecuencia en aguas tropicales (Larrea et al., 2012). Estas bacterias colonizan la superficie interna de tuberías de agua y tanques de almacenamiento formando biopelículas en presencia de nutrientes, altas temperaturas, bajas concentraciones de desinfectantes y largos periodos de almacenamiento (Ríos et al., 2017).

Los betalactámicos siguen siendo los antimicrobianos más usados, cuyo mecanismo de acción es la inhibición del paso final de la síntesis de la pared celular bacteriana (Suárez y Guidiol, 2009). En tal sentido, los 7 géneros bacterianos identificados mostraron altos niveles de resistencia a los antibióticos Ticarcilina y Ceftriaxona (Betalactámicos), excepto los carbapenémicos (Hernáez y Leiva, 2005) (Ver Tabla 3).

(Álvarez, 2010) indico que las betalactamasas de espectro expandido (β-LEE) son una causa frecuente de resistencia de las enterobacterias, especialmente Klebsiella sp. y E. coli, a las cefalosporinas de tercera generación como lo es ceftriaxona. Cefuroxima (cefarosporina de segunda generación) presento resistencia a Klebsiella sp., Citrobactersp., E. coli y Salmonella sp. Trimetropin (trimetropina) resistencia a Klebsiella sp., Citrobacter sp. y Amoxicilina (aminopencilina) resistencia a Klebsiella sp., Citrobacter sp., Salmonella sp. Serratia sp. y Providencia sp. En un estudio por (Tejedor et al., 2015) en agua de riego encontraron diversos géneros de Enterobacterias con un elevado porcentaje de cepas resistentes a la combinación Amoxicilina + Ácido Clavulánico.}

Los resultados obtenidos demostraron que el género Citrobacter sp. y Klebsiella sp. obtuvo resistencia a más de un antibiótico, estas bacterias son multirresistentes, pueden presentar mecanismos de resistencia contra diferentes grupos de antibióticos. Los aislados multirresistentes se describen, con mayor frecuencia, en aguas residuales (Baquero et al., 2008). De acuerdo con el estudio de (Servais y Passerat, 2009) en la cuenca del río Sena (Francia), encontraron que el 42% de los 214 aislados de E. coli del río eran resistentes a al menos un antimicrobiano y el 35% eran resistentes a al menos dos antimicrobianos.

Estudios previos han demostrado que aguas residuales que contienen algún tratamiento y son descargadas a aguas superficiales pueden contener patógenos resistentes a antibióticos, generando una presión selectiva y proporcionando una diseminación de genes sobre comunidades bacterianas ya existentes (Raven et al., 2019).

Blaak et al., 2015, realizaron un estudio en aguas superficiales y residuales en Holanda, con la bacteria E.coli, encontrada en aguas residuales, fue resistente a ciprofloxacino estuvo significativamente sobrerrepresentada en comparación con E. coli de aguas residuales municipales y aguas superficiales.

De acuerdo al análisis estadístico de Kruskal-Wallis se señala que existe diferencias significativas entre todos los parámetros físicos evaluados, tales como pH, turbiedad, conductividad, oxígeno disuelto, solidos totales, temperatura y el conteo de coliformes, puesto que el valor-p es menor que el nivel de significación p ≤ 0.05, el estadístico de prueba H es igual a 64.313 (gl=6), se debe rechazar la hipótesis nula H0, y aceptar la hipótesis alternativa Ha que indica que existe diferencia significativa entre los parámetros físicos y los coliformes evaluados de las diferentes tomas de agua de Azuero. En estudio realizado por Him et al., (2018) encontraron resultados similares en el río Santa María en Veraguas, para los parámetros fisicoquímicos de pH, conductividad, sólidos totales presentaron valores mayores en época seca; y la turbidez fue mayor en época lluviosa. Los coliformes totales no presentaron diferencias; mientras que los coliformes fecales fueron mayores en la época lluviosa. Los resultados descritos muestran la alta resistencia en los géneros bacterianos aislados, pero los mismos no muestran relación entre las bacterias aisladas y los antibióticos.

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