INTRODUCCIÓN

Los cultivos en Panamá son afectados por una variedad de plagas insectiles que provocan muchas pérdidas y donde su control principalmente es utilizando plaguicidas con compuestos químicos que perjudican gravemente el ambiente (Martínez, 2009). Ciertamente el uso de estos compuestos ha producido grandes beneficios agrícolas y a la vez, graves problemas de salud pública. Por ello, es importante realizar aportaciones científicas para el control alternativo de estas plagas como el uso de hongos entomopatógenos nativos o comerciales.

Los hongos entomopatógenos (HE), son microorganismos que poseen la capacidad de infectar y matar artrópodos. Esta capacidad ha permitido que se utilicen como una alternativa segura a los insecticidas químicos tóxicos para el control de plagas (Altamira, 2020).

Las especies pertenecientes al orden Hypocreales, conformado por más de 750 especies de HE, han sido ampliamente estudiados y utilizados en biocontrol debido a que tienen un gran rango de huéspedes y son fáciles de producir a gran escala (Butt et al., 2016). Alrededor del 80% de los productos HE disponibles en el mercado se basan en los géneros Metarhizium y Beauveria (Butt et al., 2016; Faria & Wraight, 2007). Estos géneros están conformados por diferentes especies que en el transcurso del tiempo han ido aumentando debido a los nuevos aislamientos que se realizan en todo el mundo y al empleo de técnicas moleculares que permiten su identificación de forma certera y concluyente.

Los HE no sólo controlan naturalmente las poblaciones de artrópodos, sino que también forman complejas relaciones con las plantas. Se ha demostrado que las especies de HE, M. robertsii y B. bassiana, proporcionan a las plantas parte del nitrógeno que ellos asimilan durante la parasitación de insectos (Behie & Bidochka, 2014; Litwin et al., 2020), promoviendo el crecimiento de estas (Ríos-Moreno et al., 2016). Beauveria bassiana actúa como endófito (coloniza el interior de las plantas) de aproximadamente 25 especies de plantas, contribuyendo al control de plagas y hongos fitopatógenos (McKinnon et al., 2017; Litwin et al., 2020; Vega, 2018). Este hongo coloniza hojas y brotes, además de las raíces, permitiendo que las plantas sean más resistentes a los insectos (Klieber & Reineke 2016; Litwin et al., 2020).

Los HE se han desarrollado como una importante táctica dentro de la estrategia de manejo integrado de plagas en las últimas décadas (Quesada-Moraga et al., 2009), debido a que presentan mecanismos de invasión únicos que les permiten atravesar de forma directa la cutícula; lo que los hace excelentes agentes de control biológico actuando como insecticidas de contacto (Charnley & Collins, 2007; Faria & Wraight, 2007; Quesada-Moraga & Santiago-Álvarez, 2008). En ese sentido, es necesario seguir aportando estudios sobre la patogenicidad y endofitismo de diversos hongos en los diferentes lugares del mundo y en las diferentes especies de insectos plagas (Hernández et al., 2019).

La polilla mayor de la cera Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) conocido por ser una plaga en la industria apícola por sus hábitos alimenticios de las larvas y a los túneles que forman en medio de los panales (Rijo et al., 1996; Jackman & Drees, 1998; Chandel et al., 2003). Sin embargo, aparte de ser considerada una importante plaga en la apicultura, se utiliza en muchos lugares como un organismo modelo de estudio y se debe a que existe una buena correlación al evaluar la patogenicidad de varios microorganismos como es el caso de hongos y bacterias en larvas de G. mellonella (Jander et al., 2000; Joyce & Gahan, 2010). La comprensión del sistema inmunológico de G. mellonella para limitar o eliminar el ataque de patógenos, también ha ayudado a caracterizar este organismo como un modelo de estudio (Kavanagh & Fallon, 2010;Vilcinskas, 2010; Harding et al., 2013). Esto se debe a que los hemocitos son el principal mediador de las defensas celulares y son el tipo de célula más numeroso que se encuentra en la hemolinfa de G. mellonella (Lavine & Strand, 2002). Estas células son fagocitos y realizan funciones similares a los macrófagos y neutrófilos humanos.

Las larvas de G. mellonella, también son utilizadas como hospedantes alternativos para la producción de parasitoides y otros enemigos naturales de plagas perjudiciales para los agroecosistemas (Gallo et al., 1988). Es por esto que destaca como insecto modelo al evaluar la patogenicidad e incluso se utiliza como insecto trampa para capturar microorganismos como los hongos entomopatógenos (Vilcinskas, 2010).

Por todo lo expuesto, el propósito de esta investigación fue evaluar la patogenicidad de aislados nativos de hongos entomopatógenos obtenidos en la Provincia de Chiriquí, utilizando larvas de G. mellonella en condiciones de laboratorio.

MATERIALES Y MÉTODOS

Área del Estudio

El estudio se realizó en el Instituto de Innovación Agropecuaria de Panamá (IDIAP) en David y en la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá, sede Chiriquí.

Cría de Larvas de G. mellonella

La cría y evaluación biológica de G. mellonella, se estableció obteniendo larvas de panales infestados con la polilla, de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad de Panamá sede Chiriquí (8°23´41.79´´N – 82°19´47.60´´O) y trasladadas al laboratorio de entomología del Instituto de Innovación Agropecuaria, David, provincia de Chiriquí al occidente de la República de Panamá (8°26´05.48´´N – 82°27´47.94´´O). El pie de cría se estableció en una dieta artificial, que consistió en una mezcla de 400 g de salvado de trigo, 120 g de harina de trigo, 160 g de leche de ternero y 300 ml de miel por cada 680 g de dieta. Los valores ambientales registrados durante los 62 días en promedio que tardó el ciclo biológico de G. mellonella, en °C y humedad relativa (HR) fueron un mínimo de 25°C y un máximo de 33°C con una HR de 58% y un máximo de 86%, respectivamente; obteniendo un promedio de 28°C y 76% de HR. Durante el ciclo biológico se determinó los instares larvarios del insecto bajo las condiciones ambientales del área de estudio, donde se establecen ocho instares larvales, utilizando como referencia la exuvia de la cápsula cefálica (Flores-Pérez et al., 2005).

Hospedantes

Las larvas empleadas de G. mellonella fueron obtenidas del pie de cría que se mantuvo bajo condiciones de asepsia. Para este bioensayo, se emplearon larvas de instares intermedios, por lo que selecciono el instar V, de acuerdo con la biología realizada por el equipo de investigación institucional.

Hongos entomopatógenos

Los aislados nativos de Beauveria bassiana (IDIAP D-Bb1400) y Cordyceps javanica (IDIAP RS-Cj006), pertenecen a la primera colección de HE con utilidad en la agricultura del IDIAP y que recientemente fueron caracterizados de forma morfofisiológica y molecular (González-Dufau et al., 2015; González-Dufau et al., 2021). Estos aislados se multiplicaron utilizando medio de cultivo Sabouraud Dextrosa Agar (SDA), con antibiótico (Cloranfenicol 0.5 g/L) dentro de una cámara estéril de flujo laminar para evitar contaminación y la incubación se realizó a temperatura de 26°C ± 2°C.

Preparación de suspensión de Conidios:

La suspensión de conidios se obtuvo a partir de la multiplicación masiva de los dos hongos y sus estructuras reproductivas en un sustrato natural, que en este caso fue arroz y que fueron mantenidas bajo condiciones asépticas en incubadoras a 26°C ± 2° C durante 15 días. Luego, la matriz se sumergió en una solución de agua estéril con Tween 80 al 0,1% como dispersante de conidios. Estas suspensiones iniciales se sonicaron durante cinco minutos para homogeneizar la suspensión conidial y luego se filtraron a través de varias capas de estopilla para eliminar las estructuras miceliales.

Las suspensiones de conidios utilizadas para los bioensayos se calcularon realizando diluciones seriadas en agua destilada estéril a partir de una solución concentrada obtenida de una matriz y utilizando una cámara de Neubauer para realizar los conteos de conidios y la fórmula de French & Hebert, (1982). El tiempo de germinación de los conidios se determinó en ensayos anteriores con un Tiempo Medio de Germinación (TG50) de 9.38 horas para el aislado RS-CJ006 y 13.97 horas para D-Bb1400, según González-Dufau et al., (2021).

Número de conidios/ml= No. de conidios x factor de cámara (104) x factor de dilución

Patogenicidad de las Aislados D-Bb1400 Y RS-Cj006

La patogenicidad fúngica por aislados se evalúo en diez larvas de quinto estadio de G. mellonella, por replica, estas fueron sumergidas en diluciones de 1x107 conidios ml-1 durante 20 segundos y luego se colocaron individualmente en placas de Petri con dieta a temperatura ambiente promedio registrada de 26.2 con un mínimo de 25.1 y un máximo de 26.8℃; se realizó la misma metodología utilizando un grupo de larvas nuevas para las diluciones 1x108 y 1x109 conidios ml-1 respectivamente. La mortalidad sobre las larvas se registró diariamente durante 10 días posteriores al ensayo. Las larvas muertas se esterilizaron inmediatamente con hipoclorito de sodio al 1%, seguido de tres enjuagues con agua destilada estéril y se colocaron en platos Petri con papel filtro humedecido con agua estéril a temperatura ambiente, con el fin de observar crecimiento de estructuras fúngicas. Las larvas utilizadas como control se sumergieron en agua estéril con Tween 80 al 0,1% y se evaluaron de igual forma. Se empleó un diseño completamente al azar y se realizaron tres repeticiones para cada tratamiento incluyendo el control.

Análisis Estadístico

Los datos obtenidos se tabularon en una hoja de cálculo de Microsoft Excel®. Se verificó la normalidad y los valores atípicos de todos los datos mediante la prueba de Shapiro-Wilk, y posteriormente, la prueba de Levene para verificar la homocedasticidad de varianzas, antes de realizar cualquier análisis estadístico.

En algunos casos se utilizó la prueba no paramétrica de Chi Cuadrado para análisis de Proporciones. Los resultados fueron expresados como Media ± DS (desviación estándar). Se empleó un nivel de significancia de p<0.05, y los análisis se realizaron con el programa estadístico STATISTICA versión 10 (StatSoftV10) y los gráficos con Graph Pad Prism V.9.0. (San Diego, CA, USA).

La concentración letal media (CL50) se calculó a través del estimador de análisis Probit y el tiempo letal medio se determinó utilizando la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney. Los datos de supervivencia de G. mellonella durante los diez días de ensayo, se analizaron con el estimador no paramétrico Kaplan-Meier.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

· Resultados

El estimador de supervivencia no paramétrico Kaplan-Meier (Figura 1) mostró que no hubo diferencias significativas para ambas aislados (χ2 (1) = 1.41, p = 0.23).

Figura 1.
Porcentaje y días de supervivencia de acuerdo con las aislados IDIAP D-Bb1400 y IDIAP RS-Cj006, sobre instares (V) de Galleria mellonella.

La mortalidad para el aislado D-Bb1400 fue de 80, 86 y 100% para las concentraciones 1x107, 1x108, 1x109 conidios ml-1 respectivamente y para RS-Cj006 fue de 90, 96.6 y 100% para las concentraciones 1x107, 1x108, 1x109 conidios ml-1. La (Figura 2a) muestra la mortalidad de las larvas tratadas de los aislados D-Bb1400 y RS-Cj006 e indican que no hubo diferencias significativas de supervivencia (p = 0.41) entre ambos aislados y concentraciones evaluadas. (χ2 (2) = 0.41, p = 0.81). Se observa que en la aislados D-Bb1400 hubo diferencias en la mortalidad entre la concentración 1x109 con respecto a 1x107 conidios ml-1 (χ2 (1) = 15.05, p = 0.001) y 1x108 (χ2 (1) = 22.22, p= 0.001). Con relación, al aislados RS-Cj006 hubo diferencias estadísticamente significativas entre la concentración 1x107 con 1x108 conidios ml-1 (concentraciones (χ2 (2) = 4.03, p = 0.04) y entre 1x107 y 1x109 conidios ml-1 (χ2 (1) = 10.53; p = 0.001) y una tendencia entre las concentraciones 1x108 y 1x109 (χ2 (1) = 3.05; p=0.08) (Figura 2b).

Figura 2.
Mortalidad para larvas de V instar de G. mellonella, inoculadas con suspensiones fúngicas de los aislados D-Bb1400 y RS-Cj006 (a) a concentraciones de 1x107, 8, 9 conidios ml-1 (b). nsp>0.05; *p<0.05; ***p<0.001.

D-Bb1400 y IDIAP RS-Cj006 fueron de 7.31±0.22 y 7.00±0.25 días respectivamente (p>0.05). El CL50 se calculó con la función Probit dando como resultado 1.23x108 conidios ml-1 (6.86-7.76 IC 95%) para el aislado RS-Cj006 y 1.55x108 conidios ml-1 (6.48-7.51 IC 95%) para el aislado D-Bb1400 (p>0.05; Tabla 1). La TL50 para el aislado IDIAP

Tabla 1.
Valor del tiempo y concentración letal media (TL50), (CL50), sus intervalos de confianza al 95%, de los aislados D-Bb1400 y RS-Cj 006, a concentraciones de 1x107, 8, 9 conidios ml-1 sobre larvas de V instar de G. mellonella.

AISLADOS	CL50 (Conidios ml-1)	TL50 (Días promedio ±SE)	IC 95% (Días)
IDIAP D-Bb1400	1.55x108 a	7.31±0.22a	6.48-7.51
IDIAP RS-Cj006	1.23x108 a	7.00±0.25a	6.86-7.76

Las mismas letras dentro de las columnas indican que no hubo diferencias significativas (p>0.05) en el TL50 y en la CL50 en conidios ml-1. IC= intervalo de confianza al 95%.

· Discusión

La patogenicidad de los dos aislados nativos fue evaluada utilizando larvas del V instar del insecto modelo de estudio G. mellonella, proveyendo interesantes resultados según nuestro conocimiento por primera vez en Panamá.

En el presente estudio se obtuvo un TL50 de 7.31 y 7.00 días, una CL50 de 1.55x108 y 1.23x108 conidios ml-1 para los aislados D-Bb1400 y RS-Cj006 respectivamente, no mostrando diferencias significativas entre ambos aislados (p=0.41) pero si intraespecíficas para las concentraciones evaluadas. Sin embargo, es notable que IDIAP D-Bb1400 mostró un porcentaje inferior de mortalidad para cada concentración presentando diferencias intraespecíficas en la concentración 1x109 conidios ml-1 en donde alcanzó un 100% de mortalidad, en comparación a las concentraciones de 1x107 y 1x108 conidios ml-1 que lograron 80.0 y 86.6%, respectivamente en los días evaluados y por consiguiente su CL50 es mayor en comparación al aislado RS-006 y mostró estadísticamente diferencias significativas dentro de las concentraciones 1x107, 1x108 versus 1x109 conidios ml-1, cabe destacar que se logró una mortalidad de 90.0, 96.6 y 100%, para las concentraciones 1x107, 1x108 y 1x109 conidios ml-1 para el aislado RS-006. No obstante, presentó diferencias significativas de la concentración 1x107 versus 1x109 conidios ml-1 y mostró un porcentaje levemente más alto de mortalidad que el aislado D-Bb1400, cabe destacar que el testigo mostro 0% de mortalidad durante el ensayo.

Estos resultados son notables si se comparan con experimentos similares en donde, C. javanica ha mostrado un gran potencial como agente de biocontrol para varias plagas de insectos, dando como resultados tiempo medio de supervivencia (TMS) similares a los nuestros para larvas de lepidópteros y variando de acuerdo al orden de insecto, resulta importante mencionar que el aislado (RS-Cj006) recientemente se caracterizó molecularmente siendo encontrada y aislada a partir de broca del café (Hypothenemus hampei) (González-Dufau et al., 2015) con accesión al (GenBank: KF373690), lectotipo de la especie. En recientes investigaciones en Estados Unidos, se ha utilizado el aislado (Cj-wf-GA17) de C. javanica a una concentración de 1x106 conidios ml-1 contra larvas de G. mellonella del último instar, con el objetivo de determinar su potencial patogénico, bajo condiciones controladas de (20, 25, 30 y 35 ℃) que fluctúan dentro de nuestro promedio registrado que fue 26.2 con un mínimo de 25.1 y un máximo de 26.8℃; en la investigación mencionada se obtuvieron resultados de mortalidad de 25, 78 y 30% a temperaturas de 20, 25 y 30℃ respectivamente durante 7 días, sin embargo se realizó un segundo ensayo ampliando el rango de días de evaluación a 14 y se registró un porcentaje de mortalidad superior de 95, 100 y 80% en las temperaturas mencionadas anteriormente (Wu et al., 2020).

En otras investigaciones se informa que C. javanica también ataca otros lepidópteros como la polilla de la papa Phthorimaea operculella, donde se ha reportado mortalidades de 85, 80 y 90% para huevo, larvas y pupas a concentración de 1x108 conidios ml-1 durante 5 días a una temperatura de 27℃ y se ha demostrado que existe una relación inversamente proporcional, que ha medida que aumenta la concentración así mismo aumenta la mortalidad de los individuos (Cheng et al., 2018).

Otro estudio demostró que C. javanica fue patógeno para dos especies de áfidos, Hyalopterus pruni y Aphis pomi, causando 66,67 y 75,59% de mortalidad, respectivamente, después de seis días de inoculación con una suspensión que contenía 1x108 conidios ml-1 (Hasan et al., 2012). Incluso, Cordyceps javanica fue moderadamente virulenta contra la polilla gitana Lymantria dispar (mortalidad 58-100%) al sumergir las larvas en la suspensión de conidios (1x108 conidios ml-1) (Shimazu & Takatsuka, 2010).

En el caso de Beauveria bassiana el aislado (D-Bb1400), alcanzó un TMS de 7.31 días y una CL50 de 1.55x108 conidios ml-1, por lo tanto, fue moderadamente menos virulenta y causo una mortalidad inferior a RS-Cj006, en las concentraciones evaluadas, cabe destacar que no hubo diferencias significativas entre estas y que ambas mostraron un 100% de mortalidad en la concentración 1x109 conidios ml-1. Estos resultados, son similares a los obtenidos por González-Dufau et al., (2021), que con estos aislados evaluados en Hypothenemus hampei; quienes reportaron 100 % de mortalidad a los 15 días y Tiempo letal medio (TL50) de 3.98 días para el aislado RS-Cj006 y 7.86 días para el aislado D-Bb1400 a una concentración de 1x109 conidios ml-1.

En algunas investigaciones similares se identificaron datos muy parecidos a los obtenidos en esta investigación donde larvas de G. mellonella tratadas con el aislado 80.2 de Beauveria bassiana nativo de Francia a concentraciones 1x101 – 1x103, muestran que para obtener un 100% de mortalidad se necesitaron en promedio 7-9 días, mostrando síntomas de infección a los 4-5 días aproximadamente (Wojda et al., 2009; Vertyporokh et al., 2020).

Bidochka et al., (2002), evaluó 61 aislados de B. bassiana a una concentración de 1x107 conidios ml-1 y reportando un TMS de 3,2 días para G. mellonella. Sin embargo, estos resultados difieren de los obtenidos en esta investigación y puede asociarse a que, la patogenicidad de cada caislado está influenciada por componentes de origen genético (Mena, 1999). Por otro lado, los TMS para Bemisia tabaci y Trialeurodes vaporariorum (Hemiptera: Aleurodidae) en donde ninfas fueron tratadas con aislamientos de B. bassiana varían de 5.9 a 7.4 días a una concentración de 1x105 – 1x108 conidios ml-1 (Quesada-Moraga et al., 2006a). En otros estudios el TMS fue de 5,4 a 14,4 días para 10 aislados de B. bassiana en concentraciones de (1x107 y 1x108 conidios ml-1) para la patogenicidad frente a Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) (Quesada-Moraga et al., 2006b). Además, en adultos de Agrilus planipennis (Coleoptera: Buprestidae) tratado con tres aislamientos B. bassiana (1x107 conidios ml-1) (Liu & Bauer, 2006) el TMS fue de 4,2 días.

Es importante mencionar que el potencial patogénico de ambos aislados RS-Cj006 y D-Bb1400 podría estar influenciado por diversos factores: a) presencia de adherencias en la superficie de los conidios en unión a la cutícula de insectos (Anand et al., 2009), b) una o más factores de virulencia como quitinasas, proteasas Pr1 y Pr2. (Anand et al., 2009; Santi et al., 2010) y c) presencia de colágeno, capa protectora que permite a los hongos superar la inmunidad innata de los insectos cuando llega el hongo en contacto con la hemolinfa (Anand et al., 2009; Freed., 2012). Por lo que es importante seguir evaluando diferentes aislados de hongos entomopatógenos, como las de este estudio, debido a su posible potencial en el control de plagas en la agricultura.

CONCLUSIONES

Los aislados D-Bb1400 e RS-Cj006 mostraron una excelente actividad biocontroladora sobre G. mellonella en laboratorio, ocasionando mortalidades entre (80-100%) y (90-100%).

Teniendo en cuenta la alta mortalidad causada bajo condiciones de laboratorio sobre larvas de G. mellonella, ambos aislados IDIAP D-Bb1400 e IDIAP RS-Cj006 son promisorios para hacer estudios de formulación y la posterior evaluación bajo condiciones de campo.

Agradecimientos

A la Secretaria Nacional de Ciencia Tecnología e Innovación (SENACYT) y al Sistema Nacional de Investigación (SNI), por financiar este proyecto de investigación.

Al Instituto de Innovación Agropecuaria de Panamá, por autorizar la utilización de los aislados de hongos entomopatógenos evaluadas.

A grupo CALESA, por suministrarnos la metodología e ingredientes para preparar la dieta artificial del insecto.

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