INTRODUÇÃO

Na agricultura, as plantas daninhas são uma das causas que mais encarecem o manejo das lavouras, pois competem de forma direta por recursos essenciais para o desenvolvimento das culturas como água, luz, espaço para crescimento e de forma indireta porque podem liberar substâncias alelopáticas ou hospedar fitopatógenos, podendo danificar a cultura (Timossi et al., 2018).

O gênero Conyza, conhecido popularmente como buva, pertencente à família Asteraceae, possui cerca de 50 espécies. Essas plantas daninhas se destacam por invadirem as mais diversas áreas, entre elas cultivadas, não cultivadas, pastagens e culturas forrageiras, seu ciclo inicia no outono/inverno e termina no verão (Trezzi et al., 2011; Santos et al., 2014).

As espécies de buva ganham destaque, pois possuem grande adaptabilidade, alta produção de sementes, capacidade de dispersão, autopolinização, diversidade de biótipos e as sementes não apresentam dormência (Santos et al., 2013). Conyza bonariensis é nativa da América do Sul e ocorre de forma abundante na Argentina, no Uruguai, no Paraguai e no Brasil. Neste último, sua presença é mais intensa nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste. Conyza sumatrensis também é nativa da América do Sul, e tem relato frequentes de sua aparição no Rio Grande do Sul e Paraná, e Conyza canadensis é nativa da América do Norte (Lazaroto et al., 2008; Marochio et al., 2017).

O gênero Conyza possui espécies com alto grau de polimorfismo, que por vez dificulta sua identificação. O fato de Conyza estar distribuída por vários continentes mostra que é uma espécie com alta adaptabilidade - característica esta que depende diretamente da diversidade genética da espécie, além disso essas plantas apresentam plasticidade fenotípica, uma mudança na expressão fenotípica em resposta a fatores ambientais, que é considerada uma estratégia adotada pelas plantas daninhas para seu estabelecimento em diferentes ambientes (Paula et al., 2017).

A identificação correta dos diferentes biótipos de buva é o aspecto mais importante para garantir um controle e manejo adequado para prevenção da seleção de biótipos resistentes aos herbicidas (Santos et al., 2015).

A caracterização de biótipos é baseada em características morfológicas, sendo de grande importância, pois permite diferenciar espécies garantindo um controle mais preciso, porém tem como desvantagem a necessidade de que a planta realize todo seu ciclo de vida. O emprego de marcadores moleculares, tem permitido estudar a similaridade ou dissimilaridade genética dentro e entre populações, espécies e biótipos vegetais, sendo complementar a caracterização morfológica (Busato et al., 2004; Rocha et al., 2009; Schneider et al., 2018).

Entre as técnicas moleculares, o AFLP se destaca pois é uma técnica multilocus com alto índice de detecção de variabilidade genética e com ampla cobertura do genoma e baixo custo. De maneira geral a técnica se resume na extração do DNA genômico da planta que depois é clivado por enzimas endonucleases de restrição, logo mais são aplicados adaptadores às extremidades desses fragmentos de restrição, que anelam com primers específicos, durante a PCR (pré-amplificação e amplificação seletiva). Os fragmentos gerados são então separados por eletroforese em gel de poliacrilamida e visualizados por autoradiografia, corados com nitrato de prata ou fluorescência (Souza, 2015). O perfil de fragmentos é resultado de variações nos sítios de restrição das enzimas utilizadas, dentre suas principais vantagens é que não precisa se de informações genéticas prévias para construção primers (Frazon et al., 2009; Buttow et al., 2010), e por fim essas características da técnica AFLP a torna para a caracterização da variabilidade genética (Souza, 2015).

As características morfológicas, agronômicas e moleculares de plantas são geralmente utilizadas nos estudos de variabilidade genética e identificação de espécies, diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo caracterizar morfologicamente e molecularmente, por meio da técnica AFLP, biótipos de Conyza spp., também buscando a identificação e classificação de espécies, e de ferramentas que se mostram úteis e complementares.

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção e diferenciação de biótipos de Conyza spp.

Foram coletados e diferenciados, na fazenda escola da Universidade Estadual do Norte do Paraná, Campus Luiz Meneghel, dois morfotipos do gênero Conyza e feito uma identificação prévia: o morfotipo “A” com margens das folhas finamente denticuladas e os ramos não ultrapassam o topo do caule e o morfotipo “B” com folhas de margens inteiras e ramos laterais que ultrapassam o ramo principal. Sendo coletado uma amostra de 30 plantas de cada morfotipo. Foi feito uma análise morfológica das plantas, considerando as características diferenciadoras do gênero caule, folhas, nervuras, pilosidade, ramos e inflorescência (Suplementar 1). Folhas jovens dos morfotipos foram coletadas e levadas ao Laboratório de Biotecnologia e Biologia da Conservação da Universidade Estadual do Norte do Paraná, Campus Luiz Meneghel para a realização de análises moleculares.

Caracterização molecular

O DNA total foi extraído, a partir de cada amostra vegetal, segundo protocolo de Doyle; Doyle (1987). e testado quanto sua integridade, utilizando gel de agarose a 1% em corrida eletroforética. A quantificação foi feita por especfotometria utilizando espectrofotômetro UV/VIS. As amostras de DNA utilizadas para reação de digestão-ligação foram ajustadas para a concentração de 600 ηg/µL.

As reações de digestão-ligação foram realizadas em um volume total de 30µL, sendo cada reação composta por duas enzimas de restrição: EcoRI (20U/µL) e MseI (10U/µL) (0,25 µL e 0,5 µL respectivamente) e 2µL de Tampão da MseI (Buffer 10x); 2 µL de tampão da T4 DNA ligase 10X; 1µL de NaCl 0,5M; 0,5µL de BSA 1mg/mL; 0,5 µL de DTT 5mM; 1µL de adaptadores MseI 50mM; 1µL de adaptadores EcoRI 5mM; 1µL de T4 DNA Ligase 5U/µL completando-se o volume com H₂O ultrapura. As condições de termociclagem consistiram em 60ºC por 6 horas, 22ºC por 2 horas e 70ºC por 1 hora. Da reação de digestão--ligação, 5µL foram diluídos em 20µL de água ultrapura para o processo de amplificação pré-seletiva.

Para a amplificação pré-seletiva, foi utilizada uma reação contendo 4,5µL de GoTaq® Master Mix 2X; 0,58µL de primer pré-seletivo, com combinação Eco A (5’ GAC TGC GTA CCA ATT CA 3’) e Mse C (5’ – GAT GAG TCC TGA GTA AC 3’); 2,92µL de água do mix e 2µL da reação de digestão-ligação diluída, cujo volume total foi de 10 µL e as condições de termociclagem consistiram em uma desnaturação inicial de 94ºC por 2 minutos e 20 ciclos de desnaturação a 94ºC por 1 segundo, anelamento a 56ºC por 30 segundos e extensão a 72ºC por 2 minutos, seguindo de uma extensão final a 60ºC por 30 minutos, 5µL dessa reação foram diluídos em 45µL de água ultrapura para serem utilizados na amplificação seletiva.

Resumidamente, a amplificação seletiva insiste em 3,5µL GoTaq® Master Mix 2X, 0,54µL de primer seletivo EcoRI 1 µM; 0,54 µL primer seletivo MseI 5 µM; 2,92 µL de água do mix e 2,5 µL da amplificação pré-seletiva diluída foram misturados e submetidos a amplificação, a qual consistiu em 1 ciclo a 94ºC por 2 minutos, 65ºC por 30 segundos e 72ºC por 2 minutos; 8 ciclos de 94ºC por 1 segundo, 64ºC por 30 segundos (decrescendo 1ºC em cada ciclo de 64ºC a 57ºC) e 72ºC por 2 minutos; 23 ciclos de 94ºC por 1 segundo, 56ºC por 30 segundos e 72ºC por 2 minutos e um ciclo final de 60ºC por 30 minutos . Para esta foram realizados testes de combinações de diferentes pares de primers complementares aos adaptadores EcoRI e MseI com as mesmas condições de ciclagem citadas anteriormente, sendo os primers selecionados EcoRI e MseI, respectivamente, AC-GT, CA-CG, CG-CA, CG-CTT, GC-CG e GT-AC.

Finalmente, a separação dos fragmentos foi realizada em gel poliacrilamida a 8% (18g de acrilamida e 2g de Bis-acrilamida para 100mL de água destilada) a 200 volts por um período de 6 horas em eletroforese. Após a corrida eletroforética a coloração dos fragmentos foi realizada com nitrato de prata a 20%. Os géis foram analisados visualmente e os marcadores obtidos acessados para presença (1) ou ausência (0) de fragmentos, gerando uma matriz binária que foi utilizada nas análises estatísticas. Para o cálculo do coeficiente de variação foi utilizado o programa dBoot ver. 1.1 (Coelho 2001). Para verificar a variabilidade genética total entre e dentro de populações, bem como o índice de fixação alélica (FST) utilizou-se a análise de variância molecular (AMOVA) conduzido no programa Arlequin v.3.11 (Excoffier et al. 2005). A matriz de distância genética, a porcentagem de locos polimórficos, diversidade gênica de Nei (1978), e a distância genética foram obtidas utilizando o programa TFPGA (Tools For Population Genetcs Analyses) versão 1.3 (MILLER, 1997).

RESULTADOS

Diferenciação de morfotipos de Conyza spp.

Na análise de características e estruturas morfológicas diferenciadoras do gênero, baseando-se no Suplementar1, as plantas mostraram divergências o que indica que sejam espécies diferentes. O morfotipo A (Figura 2) apresentou margem denteada, nervura secundária visível nas folhas e coloração verde acinzentada, inflorescência na parte superior, e essas características indicam que seja a espécie Conyza sumatrensis. Já no morfotipo B (Figura 3) destacam-se, também, as folhas de margens inteiras e presença de ramos laterais que ultrapassam o ramo principal e inflorescência na parte superior dos ramos e caules, estruturas presentes em Conyza bonariensis e que se proponha a ser essa espécie, sendo as duas já relatadas no Estado do Paraná.

Figura 2
Morfotipo “A”. A) Juvenil. B) Caule. C) Inflorescência. D) Folha.

Figura 3
Morfotipo “B”. A) Folha. B) Ramos secundários e principal. C e D) Inflorescência e sementes.

Caracterização molecular

Um total de 218 loci foi amplificado, utilizando as seis combinações dos pares de primers, nas análises AFLP (Tabela 1), com uma média de 37 fragmentos amplificados por par. Dos 218 loci amplificados, 97 foram polimórficos, sendo 53 específicos para o morfotipo A e 44 para o morfotipo B, ou seja, 44, 49% do total de loci amplificados foram polimórficos.

Tabela 1.

Combinações de primers utilizados nas análises e número de fragmentos gerados por combinação.

A combinação de primers EcoRI GT – AC MseI apresentou a maior taxa de amplificação, com um total de 51 fragmentos. O perfil eletroforético apresentado na figura 4, utilizando o primer EcoRI GC – MseI CG, com apenas 15 indivíduos de cada população, demonstra que os biótipos analisados possuem padrões de banda diferentes. Já a Figura 5 traz a amplificação do par de primer EcoRI CG – MseI CTT, com os 60 indivíduos do presente estudo, que A e B tem fragmentos específicos destacadas com os retângulos vermelhos.

Figura 4.
Dendrograma mostrando a distância genética entre os 2 biótipos de Conyza spp.

Figura 5.
Perfil eletroforético dos biótipos estudados, com os fragmentos resultantes da amplificação com o par de primer EcoRI GC – MseI CG. 1-15 plantas do biótipo A e 16-30 plantas do biótipo B, a letra M= Marcador 100 pb.

Os resultados da AMOVA mostram que a variação molecular entre as populações é de 85,18% (tabela 2) e dentro das populações é de apenas 14,82%. O dendrograma das distâncias genéticas de Nei (1978) (Figura 6) ilustra a alta variabilidade existente entre os biótipos, corroborando com o resultado da AMOVA. O primeiro grupo é o biótipo A, com a espécie Conyza sumatrensis e o segundo grupo, biótipo B, com Conyza bonariensis. Essas ferramentas são uma contribuição importante para avaliações taxonômicas, associadas a estudos morfológicos sobre identificação de espécies (Rocha et al., 2009).

Tabela 2.

Análise de Variância Molecular AMOVA para os morfotipos de Conyza spp.

Figura 6.
Perfil eletroforético dos biótipos A e B, com os fragmentos resultantes da amplificação com o par de primer EcoRI CG – MseI CTT.

No presente estudo, a caracterização morfológica e a molecular corroboram e se somam indicando que as plantas analisadas sejam de espécies diferentes e não apresentem plasticidade fenotípica.

DISCUSSÃO

O gênero Conyza pode apresentar plasticidade fenotípica, uma mudança na expressão fenotípica em resposta a fatores ambientais o que dificulta muitas das vezes o manejo correto dessas invasoras (Paula et al., 2017).

Em nossas análises morfológicas demonstraram que os dois biótipos A e B, são as espécies Conyza sumatrensis e Conyza bonariensis, respectivamente. Essas duas espécies identificadas crescem em populações associadas e frequentes, e ambas ocorrem no Brasil, sendo comuns na região Sul e relatadas de forma contínua no estado do Paraná (Lazaroto et al., 2008; Marochio et al., 2017; Sansom, et al. 2013).

As seis combinações de primers, utilizadas no presente estudo, geraram 218 loci nas análises AFLP, e vários estudos demonstraram que a utilização de diferentes combinações de primers podem gerar quantidades variadas na amplificação de fragmentos. Em estudos com a arecácia Butia capitata, Buttow et al. (2010) utilizaram a combinação de quatro pares de primers gerando um total de 214 fragmentos. Franzon et al. (2009), estudando a variabilidade genética de pitangueiras, utilizando uma combinação de três primers obteve 178 fragmentos, e Karam et al. (2004), em um estudo genético de Panicum mileacium, com 8 pares de primers, amplificaram 450 fragmentos, apresentando um número maior de loci amplificados comparado aos resultados obtidos. Dos 218 loci amplificados, 97 foram polimórficos sendo 53 específicos para o morfotipo A e 44 para o outro morfotipo B.

Freitas et al. (2005), estudando Myracrodruon urundeuva, obtiveram 137 fragmentos polimórficos, e Franzon et al. (2010) obtiveram 114 loci polimórficos estudando pitangueiras, 64% do seu total de amplificações. Já Buttow alcançou um polimorfismo de 93,5% em seus estudos com Buita capitata, sendo esses resultados superiores ao deste trabalho. Já em Bertoni et al. (2010), em Jacaranda decurrens Cham., uma bignoniaceae arbórea, obtiveram um total de 205 bandas e 46,34% de polimorfismo, usando uma combinação de quatro pares de primers, número próximo ao do presente estudo. Schiavetto et. al. (2016) em seus estudos com três populações de Rottboellia cochinchinensis, do estado de São Paulo, utilizando a combinação de seis primers amplificou 399 fragmentos, sendo 101 polimórficos, correspondendo a 25,3% do total amplificado.

A AMOVA mostrou que a variação molecular entre as populações foi de 85,18% (tabela 2). Estudando Bidens pilosa (picão-preto), no Rio Grande do Sul, e utilizando a técnica RAPD, Vidal et al. (2007) atingiram o valor médio de 38% para a similaridade genética entre os acessos resistentes aos herbicidas inibidores da ALS, originários de uma mesma propriedade. Winkler et al. (2003), estudando Euphorbia heterophylla resistente ao herbicida inibidor de acetolactato sintase, também com RAPD, obtiveram coeficiente médio de similaridade de 40%. As plantas daninhas mostram elevada variabilidade genética e baixa similaridade nas populações, uma vez que se desenvolvem e evoluem em múltiplos ambientes (Vidal et al., 2005).

O resultado encontrado em buva pode indicar alto fluxo gênico das espécies, pois estas possuem estruturas em suas sementes para dispersão em longas distâncias, chegando até 500 metros (Santos et al., 2013). A variação molecular dentro das populações foi de 14,82%, que pode ser explicada devido a exposição a herbicidas, ocasionando a diminuição da heterozigosidade. Além disso, o processo de seleção de biótipos resistentes reduz ainda mais a heterozigosidade, implicando baixos níveis de diversidade genética (Circunsvis, 2013). Schneider et. al. (2020), estudando apenas plantas de Conyza sumatrensis, utilizando microssatélites, observaram a presença de uma alta diversidade genética e isso indica que os biótipos podem apresentar diferentes respostas a estratégias de manejo, flutuações ambientais e que a variabilidade genética das espécies pode ser um dos fatores envolvidos nos mecanismos de resistência a herbicidas.

Os perfis de bandas obtidos por AFLP são resultantes das variações nos locais de restrição das enzimas utilizadas e da amplificação seletiva dos fragmentos de DNA (Schneider et al., 2018). Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que a técnica AFLP foi útil para a caracterização molecular dos biótipos de Conyza spp, e esses resultados corroboram com o que Schneider et al. (2008) obtiveram. Assim, essa técnica molecular é uma ferramenta útil para estudar a variabilidade genética e estabelecer relações entre populações de plantas daninhas, uma vez que a maioria dos estudos se dá por meio do marcador molecular microssatélite (SSR), podendo então ampliar os estudos moleculares das invasoras.

O dendrograma das distâncias genéticas de Nei (1978) corrobora com o resultado da AMOVA. Essas ferramentas são uma contribuição importante para avaliações taxonômicas, corroborando com estudos morfológicos sobre identificação de espécies (Rocha et al., 2009). Em um estudo com Commelina, nos estados de São Paulo e Paraná, Rocha et al. (2009) obtiveram baixa taxa de polimorfismo, no entanto, demonstrando diversidade genética entre espécies, conseguindo construir quatro clusters.

Através das análises moleculares e da estrutura morfológica dos biótipos estudados, os resultados demonstram que o morfotipo A e B são, respectivamente, as espécies Conyza sumatrensis e Conyza bonariensis. Foi possível observar, ainda, que as plantas estudadas não apresentaram plasticidade fenotípica ou presença de híbridos. Por fim, a técnica AFLP é útil na diferenciação molecular de populações de plantas daninhas e, que, a partir da identificação correta das espécies, o manejo e o controle se tornam mais precisos e se evita a seleção de plantas resistentes aos herbicidas.

AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Educação Tutorial (PET) pelo apoio financeiro, ao Laboratório de Biotecnologia da UENP/CLM pela estrutura e a todos os que colaboraram para a produção deste artigo, em especial os colegas de laboratório e professores.

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Autor notes

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