INTRODUCCIÓN

Inicialmente, la biotecnología se hace un camino en el agro a partir del cultivo de tejidos vegetales (CTV) con el objetivo de mejorar las capacidades fitosanitarias y agronómicas de diferentes especies vegetales de interés comercial, dando origen a la propagación masiva de plantas (Suárez, 2020). A inicios del siglo XX, Knudson (1922) realizó una investigación que generó un gran impacto en el mundo de las orquídeas: desarrolló el primer método eficaz para la germinación asimbiótica de semillas de Cattleya, dando origen a la propagación de plantas en condiciones in vitro (Knudson, 1946). Asimismo, diferentes autores como Arditti (1982) y Fast (1980) realizaron sus contribuciones al cultivo de tejidos vegetales: formularon distintos medios de cultivos para muchos géneros y especies silvestres. Este hecho, en consecuencia, promovió la experimentación continua y la búsqueda de nuevas técnicas que permitieran obtener plantas de manera rápida y efectiva, y que, del mismo modo, garantizaran la calidad del producto. Ante este panorama, el concepto de conservación de germoplasma adquiere gran relevancia; siguiendo lo descrito por Sánchez & Jiménez (2010), la conservación de los recursos fitogenéticos expresa el uso de métodos que guarden y protejan la diversidad genotípica de una planta, así como el uso de técnicas de almacenamiento, conservación y regeneración que disminuyan sus cambios y alteraciones con el paso del tiempo.

Las plantas que son propagadas en condiciones in vitro también están expuestas a deterioros y complicaciones durante el periodo de comercialización; sin embargo, estos inconvenientes son superados con el uso de la técnica de encapsulación (Bonilla, Mancipe, y Aguirre, 2015). Esta técnica se fundamenta en la tecnología desarrollada para la producción de semillas artificiales, es decir, la encapsulación de explantes en perlas de alginato de sodio. El encapsulado de los explantes permite hacerles pasar por un proceso drástico, sin el cual no podrían sobrevivir (Díaz, 2015). Esta característica posiciona la técnica de semilla sintética como un método seguro de conservación de germoplasma, que permite protegerla de los inconvenientes físicos del ambiente (Singh, Singh, y Khan, 2013).

Asimismo, Colombia es uno de los países más biodiversos a nivel mundial en cuanto a especies vegetales y en animales, de ahí la gran importancia de adoptar nuevas técnicas y herramientas que salvaguarden este recurso natural. Como bien se sabe, las orquídeas forman parte de la flora más importante en el país, llevando a una de sus variedades, Cattleya trianae, a ser nombrada en 1936 como la Flor Nacional del país (Ministerio del Ambiente, 2015a; Salazar y Vega, 2017). Colombia es el país con mayor número de especies de orquídeas en el mundo, con un total de 4270 registradas, agrupadas en 274 géneros distribuidos en casi todo el territorio nacional. Sus colores, olores, formas, texturas y tamaños hacen que la familia Orchidaceae sea objeto de admiración permanente (Ministerio del Ambiente, 2015b, parr. 1; Salazar et al., 2019; Salazar et al., 2020a), lo que resulta en que sean apetecidas por diferentes grupos comerciales y el país pueda aprovechar estos recursos naturales como fuente económica (Lal y Singh, 2020).

De manera contraproducente, en los últimos años se ha intensificado la extracción de estas especies y no se controla su comercio respecto a la ley, lo cual ha producido un problema de amenaza de extinción (Pérez y Castañeda, 2016; Mercado et al., 2020). Según Orejuela (2010), esta familia ocupa lastimosamente el primer lugar como la familia de plantas con el mayor número de especies amenazadas de extinción, entre las cuales destacan negativamente los géneros Masdevallia, Restrepia, Anguloa y Cattleya, siendo estos incluidos globalmente en las categorías “Peligro Crítico (CR)” y “En Peligro (EN)” (Calderón-Sáenz, 2006). Estos géneros se encuentran gravemente amenazados por su comercio indiscriminado y la deforestación de hábitats naturales (Roura, 2010). Por lo tanto, la conservación de sus especies es un problema que debe ser tratado como prioridad para evitar la extinción de muchas especies de esta familia (Nandini y Giridhar, 2019). Además de esto, las orquídeas son plantas que poseen ciertas peculiaridades a nivel morfológico y ambiental; ante esta problemática, Chávez, Mosquera, y Otero (2014) explican que las orquídeas producen flores que pueden tardar un largo tiempo para su desarrollo debido a que sus semillas no cuentan con nutrientes de reserva para su germinación, por lo que deben ser suplementadas con hormonas o nutrientes externos. Dentro de este mismo punto es importante destacar la relación simbiótica utilizada por las orquídeas con algunos hongos micorrícicos, con el fin de incorporar correctamente los nutrientes del suelo para realizar su germinación, lo que implica que estas plantas necesitan algún tipo de suplemento o mecanismo externo para llevar a cabo su germinación natural (Knudson, 1922).

De esta manera, la técnica de encapsulamiento de embriones vegetales en semillas artificiales de alginato es una metodología que posee gran aplicación en el cultivo de tejidos vegetales (CTV), obteniendo resultados positivos en términos de conservación y viabilidad (Gantait y Mitra, 2019; Sunitibala y Neelashree, 2018). Esta técnica resuelve los problemas de reproducción de las orquídeas, los cuales limitan su propagación de modo natural; entre estos inconvenientes se encuentran el pequeño tamaño de las semillas (Arditti y Ghani, 2000) y la ausencia de sustancias de reserva, lo cual dificulta la viabilidad de las semillas (Calderón-Sáenz, 2006; Salazar et al., 2020b; Salazar et al., 2020c). Por tanto, dicha técnica puede desarrollarse como un método eficiente con potencial biotecnológico para la conservación y propagación masiva de plantas (Shaafi et al., 2021). Conforme a lo anteriormente descrito, es el objetivo de esta revisión recopilar los avances más significativos en la técnica de semillas artificiales para su comparación como método de conservación in vitro de orquídeas, resaltando su viabilidad, ventajas y desventajas con respecto a otros métodos, así como el desarrollo de un procedimiento general que permita la obtención de semillas artificiales de manera óptima.

Técnica de semillas artificiales

La técnica de producción de semillas sintéticas (artificial) hace referencia a la encapsulación de embriones somáticos o protocormos, en una matriz de algún agente gelificante, en su mayor caso, alginato de sodio (Bhattacharyya et al., 2018). Esta técnica permite la propagación y cultivo de especies que no pueden obtenerse mediante reproducción sexual, o en casos, donde esta, posea diversos inconvenientes que afecten su funcionamiento. Además, Pech (2017) agrega que, para facilitar la viabilidad y desarrollo del embrión encapsulado, es posible añadir reguladores de crecimiento y sustancias de reservas que cumplirían la función del endospermo, el cual no está presente en muchas especies de interés comercial, como es el caso de la familia Orchidaceae. Esto facilita el desarrollo normal de las semillas de las plantas, lo que conduce a una germinación sintetizada y una formación saludable de las plantas (Nongdam, 2016). La representación de la semilla artificial es mostrada en la Figura 1.

Figura 1.
Figura 1. Representación de una semilla artificial
Fuente: modificado de “Artificial seeds and their applications” (Saiprasad, 2001).

Teniendo en cuenta que las semillas sintéticas son análogas de las semillas tradicionales, es necesario resaltar que estas últimas poseen diversas limitaciones naturales, las cuales son resueltas a partir de las técnicas de encapsulación (Sevindik et al., 2019). Entre estos limitantes se encuentra el pequeño tamaño y la delicada estructura de las semillas de orquídea, la ausencia de tejido nutricional y la necesidad de germinaciones simbióticas para su correcto desarrollo. Por su parte, las semillas artificiales están conformadas por una cubierta que tiene la función de garantizar la protección de los explantes (Hung y Trueman, 2011); dicha cubierta o matriz debe incluir nutrientes y otros factores de crecimiento, formando así un endospermo artificial; igualmente, debe proteger la semilla artificial durante el almacenamiento y manipulación sin afectar su estado natural (Jain et al., 2018), permitir la germinación del embrión o protocormo, no ser tóxica y preferiblemente ser biodegradable (Sankari et al., 2020). Para el caso de las orquídeas, la formación de un endospermo artificial es fundamental para el mejoramiento de su viabilidad y germinación. Para el desarrollo de la planta, el endospermo artificial debe contener nutrientes, principalmente sales minerales, vitaminas y una fuente de carbono, sin que estos se lixivien (Sherif et al., 2017). De esta manera, el principal objetivo de la investigación en semillas artificiales es producir una estructura semejante que posea características de protección, nutrición y manejo práctico (Mudasir et al., 2017), donde la eficacia de la producción y de la conservación de dichas semillas artificiales está influenciada por varios factores, y la manipulación óptima de estos determinan el éxito de la técnica de las semillas sintéticas (Bekheet, 2017).

Uso de gelificantes para la encapsulación de semillas artificiales

Para la producción de semillas sintéticas, se han probado diferentes agentes gelificantes con el fin de determinar su eficiencia y practicidad para esta técnica; entre estos encontramos geles como el agar, el alginato, el polyco 2133, la carboximetilcelulosa, la carragenina, la gelrita, la goma guar, el pectato de sodio y la goma de tragacanto (Saiprasad, 2001); de estos, el alginato ha sido propuesto como el más adecuado para estos fines debido a sus propiedades de biocompatibilidad. Según lo descrito por Rihan et al. (2017), el alginato es seleccionado frecuentemente gracias a su moderada viscosidad y su baja toxicidad hacia los embriones, además de que es relativamente más económico que otros gelificantes; a esto se le suma su gran practicidad y capacidad de almacenamiento a largo plazo comparado con otros geles como el agar. El principio fundamental de la formación de la cápsula por parte del alginato es el intercambio de iones entre el sodio (Na+) del alginato de sodio y el calcio (Ca+) del cloruro de calcio; este intercambio produce un reordenamiento estructural en la cadena del alginato, resultando en un material sólido con las características de un gel (Reddy, Murthy, y Pullaiah, 2012). Este intercambio iónico no afecta la naturaleza de los embriones, los cuales se encuentran presentes en el proceso de formación de la cápsula. Un factor importante en este proceso es la solidez de la cápsula, la cual dependerá de las concentraciones de los dos agentes utilizados para el encapsulamiento (Kaur, Sharma, y Kaur, 2019).

De la misma manera, el alginato cuenta con propiedades que permiten la adición de nutrientes, como lo es su capacidad de retención de agua o su capacidad como absorbente, lo cual constituye diversas aplicaciones en diferentes industrias como la de los alimentos. Gracias a esta característica, puede formar retículos poliméricos tridimensionales, los cuales poseen grupos hidrófilos capaces de absorber grandes cantidades de agua o fluidos (Avendaño, López, & Palou, 2013, p. 91). Esto permite la formación de un endospermo artificial adicionando nutrientes esenciales y reguladores de crecimiento, los cuales aumentarán la capacidad de supervivencia de la semilla tradicional para su almacenamiento, así como la competencia de germinación de estas semillas.

Respecto a este último punto, muchas investigaciones aplicadas a la producción de semillas sintéticas están propuestas para determinar las concentraciones óptimas de alginato de sodio y cloruro de calcio para una determinada especie vegetal; entre sus resultados se ha destacado la estructuración de una matriz consistente cuando las concentraciones de alginato de sodio no superaban el 4 %. Lee et al. (2009) lograron obtener semillas artificiales a partir de embriones somáticos de Laelia anceps ssp. dawsonii, los cuales fueron encapsulados en una matriz de alginato de sodio y cloruro de calcio, en concentraciones diferentes de alginato (2 %, 3 % y 4 %), con el fin de determinar las concentraciones óptimas para la producción de semillas y así establecer una estrategia de rescate y conservación para esta especie a partir de semillas artificiales. En su investigación obtuvieron una germinación del 100 % cuando las semillas se encapsularon con 3 % de alginato de sodio en complejo con CaCl2 a 75 mM; mientras tanto, a la concentración de alginato de 4 %, los porcentajes de germinación descendieron a 41,6 %; resultados que pueden variar entre distintas especies de orquídeas. Así lo demostraron Pradhan et al. (2014), donde obtuvieron una alta producción de semillas artificiales de Cymbidium aloifolium al encapsular protocormos con alginato de sodio al 4 % y una solución de cloruro de calcio a 0,2 mol/L luego de cuatro semanas de almacenamiento, logrando una germinación del 97,5 %. Estos resultados demuestran la adaptabilidad de la técnica de semillas artificiales a diferentes tipos de explantes (embriones y protocormos). Resultados similares fueron evidenciados por Morales (2012), que obtuvo semillas artificiales usando brotes anteriormente propagados de Bletia purpurea, y evaluó los efectos de distintas concentraciones de alginato de sodio combinado con cloruro de calcio; como resultado se encuentra que el alginato de sodio al 4 % con cloruro de calcio en 50 mM es la concentración óptima para la formación de semillas sintéticas para dicha especie de orquídea.

Conservación in vitro de orquídeas

Con el paso de los años y el aumento en la necesidad de salvaguardar la biodiversidad del planeta, se han desarrollado técnicas que permiten el almacenamiento de distintas variedades vegetales en un espacio considerablemente pequeño y en condiciones favorables que evitan su pérdida. Para el caso de las orquídeas, las técnicas de conservación in vitro representan un método viable para su preservación, principalmente debido al problema de viabilidad y germinación existente en las semillas de esta familia, que, a causa de falta de sustancias de reserva, necesitan de la relación simbiótica con micorrizas para la absorción de estos nutrimientos; por ende, si estos hongos no forman parte del ecosistema microbial del suelo, muy difícilmente se obtendrán semillas germinadas (Apolo, 2021). En el caso de la conservación in vitro, estos nutrimientos pueden ser aplicados en formas asimilables por la semilla en los medios de cultivo. Asimismo, Santos (2020) explica que, aunque los bancos de semillas son utilizados como una alternativa para la conservación de germoplasma vegetal, no todas las especies son aptas para este método, ya que algunas especies no producen semillas en suficiente cantidad, o bien, no todas las semillas son viables para soportar las condiciones de almacenamiento. Este es el caso de las orquídeas, donde las técnicas biotecnológicas como el cultivo de tejidos vegetales (ctv) y sus derivados se convierten en una herramienta invaluable para la conservación de este tipo de plantas (Yücesan, 2019).

El almacenamiento de las semillas y tejidos vegetales se clasifica según su duración en “conservación a largo plazo” y “conservación a corto plazo”, y dentro de esta clasificación existen numerosas técnicas que se emplean con el fin de conservar una variedad específica (Engelmann, 1991). Estas técnicas son empleadas dependiendo del explante a utilizar, debido a que estas semillas y tejidos no están exentos de diversos problemas fisiológicos provenientes del mismo mecanismo de conservación. Para el caso de las semillas, existen variedades que pueden soportar un bajo contenido de humedad y almacenamientos a temperaturas extremadamente bajas; sin embargo, existen otras variedades que no soportan estos mecanismos y su longevidad es puesta en riesgo, por lo que es necesario el uso de otro tipo de material vegetal, como es el caso de los embriones somáticos o de los protocormos. En consecuencia, es indispensable el uso de nuevas técnicas que permitan la correcta conservación de los explantes de estas especies en diferentes periodos (Kocak et al., 2019).

En la actualidad, los métodos tradicionales de conservación de semillas representan una gran oportunidad para preservar distintos géneros de orquídeas, pues estas son reconocidas por producir enormes cantidades de pequeñas semillas que hacen posible la conservación de grandes cantidades en volúmenes de almacenamiento pequeños (Ekinci, 2019). Estos métodos implican la disminución de diferentes factores del medio de almacenamiento, como pueden ser la temperatura, la intensidad lumínica o las concentraciones de nutrientes en el medio. Estas condiciones de cultivo son utilizadas para almacenamientos en periodos cortos (Engelmann, 1991), pues se disminuye naturalmente la velocidad de crecimiento y maduración de la semilla. Algunas especies son almacenadas en temperaturas no inferiores a 0 oC, lo que permite disminuir la maduración de la semilla y almacenarla en periodos de 6 a 8 semanas hasta la formación de protocormos. Asimismo, Vendrame (2018) explica que la disminución de la temperatura debe ir acompañada de una reducción de la humedad que evite posibles contaminaciones en casos donde las temperaturas no sean muy bajas; y de la formación de cristales cuando estas sean cercanas a 0 oC. Lo anterior puede garantizar la estabilidad genética y los porcentajes de viabilidad de las semillas a corto plazo, los cuales aumentan cuando son sometidas al secado (Seaton et al., 2013).

Sin embargo, si bien la tolerancia al secado en las semillas obtiene buenos resultados, los datos acerca de la supervivencia de las semillas de orquídeas con el paso de los años son escasos; esto se debe a que los métodos tradicionales de conservación no son recomendables para almacenamientos a largo plazo, ya que la viabilidad y la variabilidad genética de las semillas se puede ver afectada (Merritt, 2014). Por lo tanto, es necesario implementar condiciones de almacenamiento adecuadas y periodos cortos con el fin de mantener la viabilidad de las semillas durante su conservación (Ikhlaq et al., 2010; Sharma et al., 2013; Tabassum et al., 2010).

Estos métodos de conservación son utilizados en diversos laboratorios de investigación y docencia, donde tienen lugar resultados variables, pues aún si el protocolo realizado es correcto, este material no se encuentra exento a su manipulación en las semanas de almacenamiento (Hung & Dung, 2015; Sharma et al., 2013; Banerjee et al., 2012). Este problema es resuelto con la aplicación de una matriz de alginato que confiera mayor protección externa a la semilla; de esta manera, el diseño de un protocolo de conservación que incluya la encapsulación de las semillas adquiere gran relevancia (Saxena et al., 2019).

En plantas ornamentales y orquídeas, la técnica de semillas sintéticas ha obtenido mucha importancia debido a la presencia de un endospermo nutricional en las semillas. Los explantes más empleados para la preparación de semillas artificiales son los embriones cigóticos, los protocormos y los cuerpos similares a protocormos (PLBs). Distintos autores han reportado resultados favorables en técnicas de encapsulación para dichos explantes. Khor et al. (1998) lograron desarrollar un sistema de doble-capa para formar encapsulados de semillas y protocormos de Spathoglottis plicata, donde dichas semillas soportaron el tratamiento de encapsulación con una alta tasa de viabilidad del 64 % y 40 %, respectivamente. Asimismo, Datta et al. (1999) produjeron exitosamente semillas sintéticas de Geodorum densiflorum utilizando PLBs. Los protocormos fueron encapsulados durante 30 días en alginato de sodio. Como resultado, las semillas artificiales almacenadas a 4 °C durante 120 días no presentaron reducción en su viabilidad. Por su parte, los protocormos no encapsulados no mostraron viabilidad luego de 30 días a 4 °C. Estos resultados demuestran la importancia y funcionamiento que posee el mecanismo de encapsulación, que permite a las semillas mantenerse viables luego de un corto periodo de almacenamiento.

Más adelante Verma y Pathak (2021) estudiaron la influencia de diferentes temperaturas para la conservación de orquídeas a partir de técnicas de encapsulación. En su investigación prepararon dos lotes de semillas artificiales de Cymbidium aloifolium a partir de embriones somáticos de plantas madre, y fueron almacenados a distintas temperaturas: 4 oC y 25 oC, respectivamente. Los resultados obtenidos demuestran que las semillas almacenadas a 4 oC conservaron su viabilidad al 60 % después de los 15 días, y se redujo gradualmente al 45 % después de 30 días, al 25 % después de 45 días y del 15 % a los 60 días, mientras que las semillas almacenadas a 25 oC perdieron completamente su viabilidad al llegar a los 45 días. Los autores explican esta pérdida debido a que las semillas sintéticas se secan rápidamente y son difíciles de almacenar durante largos periodos a menos que se mantengan en un entorno húmedo o se recubran con una membrana hidrofóbica, la cual se puede conseguir usando materiales como la cera, la resina o el poliorganosilicato (Verma y Pathak, 2021).

Aun así, existen técnicas que permiten extender aún más los tiempos de almacenamiento y lograr conservaciones durante largos periodos. La crioconservación es el almacenamiento de tejidos vegetales a temperaturas extremadamente bajas durante un periodo superior a 12 meses. Las estructuras vegetales comúnmente utilizadas son meristemos, protocormos y semillas (embriones cigóticos) y embriones somáticos, ya que estos garantizan la estabilidad genética del material (Martínez, 2001). Su fundamento se basa en el uso del nitrógeno líquido, el cual se encuentra a una temperatura de –196 oC (Sánchez y Jiménez, 2010) que detiene los procesos metabólicos y la división celular, de manera que el material puede ser almacenado durante un largo periodo sin alterar su fisiología. Además, el material vegetal requiere de un espacio y mantenimiento reducido, ya que, luego del almacenamiento, no es manipulado.

Sin embargo, los protocolos de crioconservación son utilizados principalmente en laboratorios especializados en la conservación de tejidos vegetales, por lo cual su uso en laboratorios de docencia e investigación es muy bajo, producto del alto costo de reactivos y del mantenimiento de los congeladores programables. Se espera que el éxito de este método de conservación produzca nuevas investigaciones cuyos resultados conllevan la disminución de costos y su uso general en laboratorios de docencia e investigación en biotecnología vegetal. Debido a esto, el uso de la técnica de encapsulación de embriones posee gran potencial dada la sinergia que ha presentado con otras técnicas (Sánchez & Jiménez, 2010; Díaz, 2015; Bonilla et al., 2015), por cuanto la matriz de alginato posibilita el almacenamiento de las sustancias crioprotectoras y cumple la misma función que en la encapsulación tradicional, ya que las cápsulas de alginato ayudan a que la toxicidad de las sustancias crioprotectoras disminuya significativamente (Díaz, 2015). Gracias a esto, los protocolos de criopreservación y semillas sintéticas son métodos criobiotecnológicos muy considerables para almacenamiento y conservación a largo y mediano plazo.

Esta sinergia es comprobada por Manokari et al. (2020), que realizan un almacenamiento a mediano plazo de semillas artificiales de Vanda tessellata (Roxb), una orquídea de importancia medicinal. En su estudio almacenaron un lote de embriones somáticos encapsulados con alginato de sodio y cloruro de calcio a una temperatura de –4 oC durante 12 meses en oscuridad. Como resultado, obtuvieron una germinación de 94 + 0,30 % de en medio ms luego de incubarlas durante 8 semanas a 25 + 4 oC. Esta alta tasa de germinación fue explicada a través de la influencia de la fuente de nitrógeno en el medio, ya que el nitrato de amonio presente en el medio provoca una fácil asimilación de NO3- y NH4+, lo que influye en el crecimiento y desarrollo morfológico (Manokari et al., 2020, p. 173). Tal fenómeno puede interferir en que la técnica de semillas sintéticas puede aplicarse en conservaciones a mediano y largo plazo si se cuenta con el equipo y material necesario para su almacenamiento, por lo que puede ser utilizado en sinergia con técnicas como la crioconservación.

Con esta prospección, se lograrían avances significativos dentro de la tecnología de las semillas artificiales, promoviendo la propagación masiva y la conservación de genotipos vegetales de élites (Reddy et al., 2012). Según Redenbaugh y Ruzin (1989), la encapsulación de embriones o protocormos debe proporcionar un método con potencial conservativo, que permita combinar las ventajas de gran volumen del cultivo de tejidos vegetales (CTV) con las capacidades de bajo costo de la conservación de semillas para ser considerado un método viable para la conservación y propagación de especies vegetales. De esta manera, los altos costes de técnicas como la propagación clonal y la crioconservación podrían reducirse al de las semillas verdaderas (Redenbaugh y Ruzin, 1989), proporcionando nuevos métodos de producción para los silvicultores, y de conservación para los laboratorios.

Tabla 1.
Tabla 1. Comparación de métodos de conservación de semillas

Nota. * La técnica de semilla artificial es utilizada para almacenamientos no mayores a 6 meses; sin embargo, su uso combinado con la crioconservación permite almacenarlas a plazos mayores a este límite. **La temperatura utilizada depende de la naturaleza del cultivo; si las semillas pertenecen a cima tropical, esta temperatura puede cambiar entre 4 ºC y 18 oC.

Aplicabilidad de la técnica

El éxito oportuno de esta técnica a partir de la encapsulación de embriones somáticos y protocormos derivados del cultivo de tejidos vegetales (CTV) ha propuesto nuevas metas y líneas de investigación sobre la producción de semillas sintéticas, dando una nueva prospección a la biotecnología vegetal. En investigaciones recientes, la técnica ha ganado una amplia aplicabilidad como herramienta en almacenamientos a cortos y medianos periodos, facilitando así la germinación de plántulas y el intercambio entre laboratorios (Maqsood et al., 2021).

Después de 30 años de investigación en la técnica de semillas artificiales, esta tecnología sigue en desarrollo, obteniendo buenos resultados en pruebas a pequeña escala; sin embargo, su implementación en procesos comerciales sigue siendo un concepto. La comercialización de un sistema de encapsulación requiere de un conocimiento aún mayor acerca de los mecanismos y conceptos básicos que envuelven a las semillas sintéticas (Pond & Cameron, 2017). Dentro de los inconvenientes presentes en la técnica, se encuentran la falta de resistencia a la desecación para un almacenamiento a largo plazo (Reddy et al., 2012), el cual puede ser resuelto con el uso en sinergia de técnicas de crioconservación, aumentando el costo de producción pero garantizando la calidad de la conservación y del producto final (Díaz, 2015; Bonilla et al., 2015). Asimismo, para el caso de semillas sin endospermo, es necesaria la incorporación de una fuente de azúcar para la germinación para así evitar una disminución en los porcentajes de conversión.

Se espera que los avances en la técnica y la investigación continua permitan el desarrollo de un sistema de producción de semillas sintéticas rentable que sincronice la siembra y germinación de un gran número de protocormos encapsulados que muestren un alto grado de conversión. Para ser considerada útil, la técnica de semillas artificiales debe reducir los costes de producción o aumentar el valor del cultivo (Saiprasad, 2001). Este tipo de beneficios debe ser relacionado con los costes de desarrollo, y el resultado de dicha revisión determinará si su uso se encuentra justificado para una determinada especie. Para el caso de las orquídeas, considerando los demás tipos de conservación de germoplasma actuales, existen técnicas para realizar conservaciones con un coste más reducido, como lo es el cultivo in vitro; no obstante, estas técnicas son conocidas por necesitar un mantenimiento constante y cuyos almacenamientos son limitados por el tiempo (Sharma et al., 2013). Otro punto central planteado por Sharma et al. (2013) dentro del mecanismo de encapsulación es la posibilidad de trasplantar los protocormos encapsulados y cultivados asépticamente, de modo directo al suelo, reduciendo considerablemente los costos en las fases de aclimatación y enraizamiento, logrando un funcionamiento análogo en comparación a las semillas naturales.

Esta conversión ex vitro de semillas sintéticas ha sido comprobada por Corrie y Tandon (1993), donde utilizaron protocormos de Cymbidium giganteum para la producción de semillas artificiales, e indujeron plántulas sanas al transferirlas a un medio nutritivo o de manera directa a arena y suelo estériles. Como resultado obtuvieron una conversión de 100 % en condiciones in vitro y de 88 % en condiciones in vivo. La siembra ex vitro de semillas sintéticas proporciona un mecanismo importante y rentable para la recuperación de plántulas (Sharma et al., 2013), ya que, si bien se puede producir un gran número de plantas a través de embriogénesis somática, esta no conservaría la diversidad genética de la familia orchidaceae; además, en algunos casos, el transporte de estas plántulas es complejo. Por su parte, los protocormos encapsulados presentan mayor flexibilidad de manipulación y transporte en comparación con las plantas in vitro (Maqsood et al., 2021). Igualmente, la siembra directa de los protocormos encapsulados en el suelo u otros sustratos ayuda a evitar el procedimiento de aclimatación necesario para las plántulas obtenidas del cultivo de tejidos vegetales, y se disminuyen los costos de mantenimiento y mano de obra.

La reducción de mano de obra conseguida al producir plantas por semillas artificiales, en comparación con el cultivo de tejidos vegetales, confiere una ventaja en los costos de la técnica (Gray, 1991). Asimismo, la posibilidad de encapsular embriones cigóticos y protocormos permite el almacenamiento de germoplasma silvestre, como resultado de una mejor manipulación de estos embriones y almacenarlos en condiciones in vitro. De este modo, las semillas sintéticas pueden utilizarse para propagar y conservar ciertos cultivos ornamentales como las orquídeas, que ahora se producen laboriosamente por cultivo de tejidos vegetales.

Procedimiento general para la producción de semillas sintéticas

El método utilizado comúnmente para la germinación de semillas es la propagación in vitro, en la cual las semillas se cultivan en condiciones favorables en medios de cultivo como el MS (Murashige-Skoog), con fuentes de carbono. Sin embargo, este método es usado cuando la propagación es efectuada a pequeña escala, ya que requiere de mucha mano de obra y su tasa de multiplicación es relativamente baja (Siew et al., 2014). A raíz de lo anterior, con el paso de los años se ha implementado la técnica de semillas artificiales para plantas que tienen una baja tasa de germinación y viabilidad en semillas, debido a que esta tecnología permite la inclusión directa de las semillas producidas a condiciones de invernadero, lo cual proporciona un fácil manejo, una capacidad de almacenamiento con mayor uniformidad genética y una disminución considerable de los costos (Gray, 1991).

Figura 2.
Figura 2. Metodología propuesta para la conservación de orquídeas
Fuente: elaboración propia.

Selección de material vegetal

En esta etapa se obtiene el material vegetal que será utilizado para la ejecución de la técnica. Una selección correcta del mejor material disponible para su encapsulación y posterior conservación es un factor importante para garantizar el éxito de la técnica. En esta etapa es posible usar diferentes explantes como de embriones somáticos, protocormos, yemas y propágulos (Shajahan et al., 2019); sin embargo, para garantizar la conservación de diversidad genética, los explantes que deberán considerarse serán embriones cigóticos (semillas) y los cuerpos similares a protocormos (PLBs). De dicha selección se obtendrán los explantes que se utilizarán en el montaje del diseño.

Selección de agentes gelificantes y nutrientes

Se ha establecido el uso del alginato de sodio y el cloruro de calcio como gelificantes para la encapsulación de los protocormos, debido a que con ellos se obtienen mejores resultados en comparación a otros agentes. Sin embargo, sí es posible elegir las fuentes de estos dos materiales que mejor se adapten a las condiciones de material vegetal y costos, ya que si bien las presentaciones genéricas comercializadas por los fabricantes para los laboratorios de tejidos vegetales es la más usada, es posible emplear las presentaciones de alginato de sodio y cloruro de calcio que son utilizadas en la industria de alimentos debido a la similitud de sus propiedades (Avendaño et al., 2013) y de sus resultados en esta industria (tabla 2). Esto representaría una disminución aceptable en los costos de la técnica sin afectar el posible resultado final. En esta etapa también es esencial tener en cuenta la cantidad y tipo de material vegetal que se utilizará como factor clave para la elección de los nutrientes esenciales, ya que estos son muy variables entre distintas especies y su éxito depende de su correcto uso en términos de concentración de sales, disponibilidad en el medio de cultivo, tiempo de almacenamiento y/o conservación de semillas (Soni y Sharma, 2017).

Preparación de semillas

A partir de esta etapa comienza el manejo práctico de la técnica propuesta. Las semillas seleccionadas deben estar en las mejores condiciones fisiológicas y asépticas para garantizar el éxito del procedimiento. Para el proceso de desinfección y siembra de las semillas, estas deben ser tratadas con el método de jeringa propuesto por Salazar y Botello (2020), con modificaciones en caso de ser necesario. Para este proceso se usa una jeringa estéril de 5 mL, la cual debe estar aislada en su punta con un filtro de tela; a esta jeringa se le agrega una pequeña cantidad de los embriones utilizados y se sumergen en etanol al 70 %, se repite este proceso con una solución de hipoclorito de sodio al 1.0 % (NaOCl), realizando los correspondientes lavados. Luego de llevar a cabo este procedimiento, se retira el filtro de tela de la jeringa y se procede a hacer la siembra en las cajas de petri con su respectivo medio de cultivo, donde se espera que las semillas maduren y formen protocormos para su posterior encapsulación. Todo este procedimiento debe efectuarse en condiciones asépticas en cabina de flujo laminar con materiales e instrumentos previamente esterilizados.

Con este proceso se busca la eliminación de cualquier agente contaminante presente en los explantes y que estos se encuentren en condiciones óptimas para su encapsulación.

Obtención de la cápsula y endospermo artificial (encapsulación)

Una encapsulación óptima es fundamental para la producción de las semillas sintéticas. Estas semillas deben presentar una buena consistencia que permita su manipulación y su posterior almacenamiento sin sufrir ningún tipo de desgaste o problema mecánico; igualmente, esta matriz debe derivar en la obtención de nutrientes por parte de la semilla natural (Sharma y Roy, 2020). Para cumplir con este objetivo, se deben evaluar distintas concentraciones de los reactivos utilizados para la obtención de la matriz, por lo que es muy importante realizar una extensa revisión de antecedentes acerca de la aplicación de la técnica de semillas artificiales; en este caso, se toman como base los reportes realizados por Calderón (2020), Faisal y Alatar (2019), Pradhan et al. (2014) y Lee et al. (2009), donde se aplican distintos tratamientos con concentraciones variables de alginato de sodio (3.0 %-5.0 %) y cloruro de calcio (25-100mM). Así también, debe ser complementado con sales ms y su constitución dependerá exclusivamente de la especie y tipo de material usado para la encapsulación (Tabla 2).

Tabla 2.
Tabla 2. Aplicación de la técnica de semillas artificiales en distintas especies de orquídeas

Nota. AS: alginato de sodio; CaCl2: cloruro de calcio; Ca (NO3)2: nitrato de calcio.

El proceso de encapsulación comienza con la recolección de las semillas previamente sembradas en cajas de petri, las cuales han madurado hasta la formación de protocormos; estos últimos son transferidos en condiciones asépticas (cabina de flujo laminar) a la solución de alginato de sodio suplementado con sales ms; luego, con ayuda de una micropipeta 50-500 µl, son transferidas nuevamente a un matraz de 500 ml que contiene una solución de cloruro de calcio suplementado de la misma manera con sales ms, con el fin de lograr la incorporación de estos nutrientes a la cápsula. Es recomendable el uso de cultivos líquidos, ya que facilita la incorporación de nutrientes o reguladores del crecimiento en la semilla. Además, el cultivo en líquido proporciona una mayor eficiencia en la producción (Tissa, 1992); los PLBs son goteados de modo individual y se dejan aproximadamente 30 min en el matraz con agitación para permitir que la cápsula se forme alrededor del protocormo (Lee et al., 2009). Luego de este tiempo, las cápsulas obtenidas deben ser lavadas con agua destilada estéril para eliminar los restos de cloruro de calcio, y transferidas a papel filtro estéril, donde serán secadas dentro de la cabina de flujo laminar para posteriormente almacenarse en condiciones óptimas dentro del cuarto de conservación.

De este proceso se espera obtener semillas artificiales de aproximadamente 5 mm de diámetro (Quito y Yunga, 2019), y a partir de las distintas concentraciones evaluadas de los gelificantes, un endospermo artificial rígido que protegerá a las semillas y que además captar los nutrientes esenciales para estas.

Almacenamiento

Las semillas sintéticas se deben guardar en recipientes de vidrio sellados y estériles en un rango de temperatura establecido previamente, de acuerdo con las condiciones naturales de las semillas, pues la temperatura de almacenamiento óptima para la conservación a corto o mediano plazo varía según la especie de planta. Este rango debe abarcar entre 4 y 18 oC (con modificaciones según la especie), como describen Baskaran et al. (2014), ya que temperaturas superiores pueden activar el metabolismo energético de la planta y, en consecuencia, su maduración y germinación, evitando así su conservación. Por su parte, Manokari et al. (2020) plantean que los almacenamientos a temperaturas menores a 0 oC son posibles si se determinan condiciones favorables para las semillas, como pueden ser bajos niveles de luminosidad, poca manipulación y el uso de medios de cultivo con altas fuentes de nitrógeno, logrando así almacenamientos de 48 semanas. El tiempo de almacenamiento es variable según los objetivos de cada investigación; sin embargo, se recomienda el almacenamiento durante 12, 16, 20 y 24 semanas en cuarto oscuro, pues permitirá evaluar la capacidad de las semillas artificiales en conservaciones a mediano plazo, para luego dar paso a conservaciones más largas. Asimismo, Salma et al. (2019) establecen la importancia de que el medio de cultivo en el cual se almacenen las semillas sintéticas posea una menor concentración de sales con el fin de disminuir y ralentizar de manera efectiva el metabolismo de la semilla.

Germinación y aclimatación in vivo

El endospermo artificial tiene un gran efecto sobre la germinación de las semillas sintéticas. En diferentes investigaciones se ha reportado un aumento en los porcentajes de germinación de semillas encapsuladas artificialmente, en comparación con las semillas naturales utilizadas como control (Javed et al., 2017). Las plántulas obtenidas a través de semillas artificiales son conocidas por su capacidad de cultivo en diferentes sustratos para su conversión en plantas completas en invernadero o directamente en campo (Qahtan et al., 2019). Estas semillas deben ser plantadas en sustratos que posean concentraciones de nutrientes superiores a las establecidas en su conservación, con el fin de reestablecer su metabolismo natural (Bektas y Sökmen, 2016). Después de realizar la metodología en laboratorio, las plántulas deben ser transferidas a bolsas que contengan suelo estéril y se mantienen bajo condiciones de invernadero durante seis semanas, periodo en el que aparecen las primeras hojas eficientes (Lee et al., 2009) y deben ser monitoreadas semanalmente, con el fin de seguir su proceso de desarrollo y maduración hasta la obtención de plántulas completas.

Esta siembra directa disminuye considerablemente los costos necesarios en otras técnicas de cultivo, pues parte de estos se deben a la mano de obra aplicada para los múltiples pasos de cultivo y enraizamiento, de manera que la sustitución de dichos sistemas de cultivo por la siembra directa de los protocormos encapsulados reducirían ciertos gastos (Tripathi, 2017).

Conclusiones y recomendaciones

Al igual que todas las técnicas de micropropagación, la encapsulación con alginato es un proceso muy laborioso. Cada explante se manipula varias veces: en la selección de material, la desinfección, el recubrimiento con alginato de sodio, la inmersión en cloruro de calcio, el lavado en agua y, finalmente, su disposición en un recipiente para su almacenamiento. Sin embargo, los resultados obtenidos en las investigaciones reseñadas han corroborado la importancia de su uso en la conservación de germoplasma vegetal de orquídeas: se resaltan las ventajas que posee en términos de costos y tiempos de conservación con respecto a los métodos tradicionales de conservación in vitro y a métodos más sofisticados como la criopreservación, mostrando incluso cómo la técnica de semillas artificiales se logra adaptar y trabajar en sinergia con este último método, hasta alcanzar resultados óptimos y eficaces para la conservación de embriones. El coste total de la aplicación de la tecnología de semillas sintéticas será variable para cada cultivo, y este será el resultado entre la relación de los costes de desarrollo y de la producción total de semillas, de manera que, entre mayor nivel de investigación en el uso sofisticado de la técnica, mayor será la rentabilidad de esta. De este modo, es necesario generar más investigación en semillas artificiales, con el fin de mejorar las capacidades que poseen estas semillas en sustratos no esterilizados, además de proponer el uso de distintos agentes, como antibióticos, que podrían mejorar las condiciones de calidad y resistencia de las semillas, y evaluar las concentraciones óptimas de sustrato y agentes gelificantes para cada especie de orquídea.

Los protocolos de encapsulación disponibles se encuentran optimizados para laboratorios de alto nivel que tengan como objetivo la conservación del germoplasma vegetal; sin embargo, es importante que distintos laboratorios de investigación adopten esta práctica con el fin de ampliar las investigaciones y recursos en el tema, a fin de generar un mayor desarrollo de la técnica y un impacto significativo en la conservación de tejidos vegetales. Por esto, se espera que los resultados obtenidos en investigaciones planteadas en esta revisión permitan continuar la investigación sobre la encapsulación de embriones en otros laboratorios de cultivo de tejidos vegetales (CTV) de la región y el país.

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