INTRODUCCIÓN

El departamento del Huila es uno de los mayores productores de café en Colombia, con 2,5 millones de sacos producidos por año y 147.275 hectáreas sembradas en 35 de sus 37 municipios. El café producido en este departamento es reconocido a nivel mundial por la diversidad de sabores en taza, aroma y calidad, además de ser el principal factor económico y social de la región. A pesar de su importancia, el proceso de beneficio húmedo del café emplea grandes cantidades de agua en las etapas de despulpado, lavado y transporte del grano, registrando consumos aproximados de 4.154.354 m3 que equivalen a 37,2 L/kg de café pergamino seco (Rodríguez et al., 2015). El proceso, a su vez, genera grandes volúmenes de aguas residuales que contaminan las aguas y los suelos de las zonas circundantes a las áreas de producción. Debido a los altos volúmenes de agua residual se hace imposible aplicar tratamientos antes de su vertimiento a cielo abierto, lo que deteriora las fuentes hídricas en las épocas de cosecha. En cuanto al grado de contaminación causado por las aguas mieles del café en un cuerpo de agua, se ha determinado que la demanda biológica de oxígeno (DBO5) aproximada es de 25.109 t, los sólidos totales disueltos alcanzan 23.830 t y el DQO registra un valor de 55.000 mg/L (Rodríguez et al., 2015).

En ese contexto, los impactos ambientales generados por el procesamiento del café se relacionan con la pérdida de la biodiversidad en aguas y suelos, una disminución en la calidad de vida de los productores, quienes reportan problemas de salud por el consumo de aguas contaminadas, la presencia de malos olores y la aparición de insectos vectores, y un menor rendimiento de los suelos, ocasionado por el alto contenido de materia orgánica y acidez que altera el microbiota. Por lo anterior, la mitigación de los impactos ambientales causados por las aguas residuales del café mediante el uso de microorganismos nativos como microalgas y cianobacterias se convierte en una alternativa viable y con potencial para el tratamiento terciario de este subproducto del café en el departamento del Huila.

Durante los últimos años, las microalgas y cianobacterias se han utilizado como sistemas biológicos alternativos al tratamiento de aguas residuales, en gran parte por su capacidad de combinar su metabolismo autótrofo con el heterótrofo, con lo cual consumen sales e iones en presencia de luz, a la vez que pueden consumir moléculas orgánicas. Investigaciones desarrolladas por Li Wu et al. (2018), quienes cultivaron la cianobacteria Scytonema javanicum en aguas residuales sintéticas artificiales, determinaron el potencial remediador de nitrógeno y fosfatos de este organismo. Por su parte, Lynch et al. (2015) aislaron siete especies nativas de cianobacterias y un alga verde con el fin de evaluar su capacidad de eliminación de nutrientes, logrando con ello eliminar totalmente el fosfato y el amonio, y obteniendo al final un alto contenido de biomasa. Gorain et al. (2019) evaluaron la eliminación de nitrógeno y fosfato en aguas residuales agrícolas utilizando la cianobacteria Anabaena sphaerica y A. variabilis durante 30 días en un sistema de cultivo semicontinuo, encontrando que cerca del 90 % de N y P fueron eliminados, además de que la biomasa producida reportaba altos contenidos de ácidos grasos esenciales con potencial para su uso en la producción de nutracéuticos.

Sumado a lo anterior, se ha evaluado también el uso conjunto de microalgas y cianobacterias (Oscillatoria sp.) para la eliminación de nitrógeno y fósforo inorgánico en aguas residuales, encontrando que es posible eliminar 36 mg de N y 0,35 mg de P por día y generar una producción de biomasa de 0,15mg/día (Arias et al., 2017). Otras algas y cianobacterias que han dado buenos resultados en depuración son Phomidium sp., capaz de eliminar 100 % de ortofosfato, 87 % de nitrato, 68 % de fosfato total y 48 % de ion amonio (Cañizares-Villanueva et al., 1994), Chlorella vulgaris y Scenedesmus acutus, empleadas para la remoción de cromo en aguas de curtiembres (Ardila et al., 2017).

Para aguas residuales del proceso productivo de café no se han realizado tratamientos con algas, hasta donde conocemos, aunque sí se ha avanzado en la investigación con otros microorganismos que resultan ser eficientes en la depuración de las aguas finales del proceso. Entre los trabajos que se destacan por dar resultados positivos está el de Ashenafi et al. (2021), quienes evaluaron a escala laboratorio la eficiencia de las bacterias Pseudomona fluorescence y Escherichia coli, obteniendo en 144 horas reducción de DBO5, DQO y TS. De otro lado, Pires et al. (2021) desarrollaron un protocolo para la obtención de microorganismos con potencial para la remoción de la carga orgánica a partir de la microbiota autóctona de las aguas residuales de la producción de café, logrando efectividad en un consorcio bacteriano compuesto por Serratia marcescens, Corynebacterium flavescens y Acetobacter indonesiensisk, con el que se logró disminuir 85 % la DBO5, 60 % la DQO y 80 % el fósforo y el nitrógeno. Resultados similares se alcanzaron con cepas bacterianas autóctonas aisladas de las aguas residuales del despulpado de la cereza de café (Enterobacter ludwigii, Bacillus cereus, Enterobacter aerogenes y Enterobacter cloacae), disminuyendo hasta en 40 % la DQO (Jenifer et al., 2020). También se han realizado trabajos con los hongos Aspergillus niger y Aspergillus flavus, microorganismos aislados de las mismas aguas residuales, alcanzando una reducción de hasta 80 % de DQO y DBO (Navitha & Kousar, 2018).

Teniendo en cuenta lo anterior, el presente trabajo llevó a cabo una exploración de especies de microalgas aisladas de los procesos de producción de café con alta capacidad para depurar las aguas residuales y, a la vez, hacer posible que la biomasa algal producida tenga un valor agregado para su utilización en procesos tanto biotecnológicos como industriales.

MATERIALES Y MÉTODOS

Colecta de algas y obtención de cepas

Las muestras analizadas provienen de fincas cafeteras del municipio de Isnos (Huila, Colombia). Se realizó toma de muestras en los tanques de almacenamiento de pulpa de café, mucilago y en los procesos de filtrado de aguas residuales del proceso de producción de café. Las muestras de agua se recolectaron en tubos Falcon de 50 mL para luego ser etiquetadas y conservadas en oscuridad a temperatura ambiente hasta el momento de su procesamiento.

Para la obtención de cepas unialgales se utilizó la técnica de rayado en agar por agotamiento. Como medio de cultivo se utilizó medio básico Bold (BBM) enriquecido con agar-agar 1,5 %. En esta fase se hicieron tantos repiques como fueron necesarios hasta alcanzar una cepa unialgal (Andersen, 2005).

Identificación molecular de las cepas

Para la identificación de las cepas se aisló ADN siguiendo el protocolo del kit ZYMO Research Quick-DNA TM Plant/Seed Micropep (ZYMO Research Corp., Irvine, Estados Unidos, catálogo D6020). Para comprobar la obtención de ADN se realizó electroforesis en gel de agarosa a 1,5 %, utilizando como marcador buffer de carga e HydraGreen™ Safe DNA Dye-Thomas Scientific. Para las cepas se amplificó el gen 18s con los cebadores 18s F (AACCTGGTTGATCCTGCCAG) y 18s R (CACCAGACTTGCCCTCCA).

Todas las reacciones se realizaron en un termociclador MyCycler™ (Bio-Rad laboratorios Inc., Hercules, CA, EE. UU.) en alícuotas de 20 µL que contenían 10 µL de PCR mix – 100 2X (Corpogen, Colombia), 1 µL de cebador F, 1 µL de cebador R (cada cebador a una concentración de 10 µM), 0,5 µL de ADN y agua grado biología molecular, hasta alcanzar un volumen final de 20 µL. El programa de PCR fue 94 ºC durante 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de 94 ºC durante 1 min, 55 ºC por 1 s y 72 ºC durante 3 min, así como una extensión final a 72 ºC durante 10 min.

La limpieza de los productos de PCR se realizó con el Kit DNA Clean & Concentration TM-5 (ZYMO Research Corp., Irvine, Estados Unidos, catálogo D4013). La electroforesis se corrió en gel de agarosa al 1 % con marcador HydraGreen™ Safe DNA Dye-Thomas Scientific por aproximadamente una hora, con voltaje de 100 V. Finalmente, se observó el resultado en un documentador de geles (Gel Doc™ XR+, BioRad).

Los productos purificados de PCR fueron enviados a la casa comercial (SSigMOL, Instituto de Genética, Universidad Nacional, Colombia) para el respectivo secuenciamiento. Las secuencias se editaron usando el programa Sequencher 5.1 (Gene Code Corporation, 2017). Las comparaciones de secuencias se llevaron a cabo utilizando las bases de datos BLAST del National Center for Biotechnology Information.

Caracterización bioquímica de las cepas seleccionadas

Las dos cepas fueron cultivadas en medio BBM en un volumen de 1 L, las condiciones de cultivo fueron irradiancia de 300 µmol de fotones m-2 s-1, fotoperíodo de 12:12 horas luz/oscuridad, 25 °C +/- 3°C y burbujeo permanente con aire del ambiente. La biomasa se recolectó en fase estacionaria, siendo deshidratada a baja temperatura.

La determinación de proteínas se realizó por el método de Bradford (1976), para lo cual se pesó aproximadamente 0,01 g de biomasa liofilizada en tubos Falcon de 15 ml, se adicionó 6 ml de buffer de fosfato de sodio [0,02 M; pH 6] (Melgarejo, 2010) y perlas de sílice (para asegurar el rompimiento celular). Esta muestra se pasó por vórtex durante 5 min y se centrifugó a 6.000 rpm por 5 min. Se extrajo 0,8 ml de sobrenadante, el cual fue dispuesto en tubo Epppendorf de 2 ml, añadiendo 0,2 ml de reactivo de Bradford (Bio-Rad 2006) y agitando fuertemente en un vórtex por un minuto, para luego incubar por cinco minutos y medir la absorbancia a 595 nm. Cada mezcla de reacción se realizó por triplicado.

La determinación de carbohidratos se realizó por el método de DuBois (DuBois et al., 1956; Gerchakov & Hatcher 1972; Melgarejo 2010), para lo cual se pesó aproximadamente 0,01 g de biomasa liofilizada en tubos Falcon de 15 ml, agregando 6 ml de H2O destilada y desionizada y perlas de sílice (para asegurar el rompimiento celular). La muestra se pasó por vórtex durante 5 min y se centrifugó a 6.000 rpm por 5 min. Se extrajo 210 µl de sobrenadante, el cual fue dispuesto en tubo Eppendorf de 2 ml, posteriormente añadiendo 0,2 ml de fenol al 80 % y 1 ml ácido sulfúrico (H2SO4), para luego agitar la muestra fuertemente en un vórtex por un minuto y dejar enfriar a temperatura ambiente y en oscuridad (el compuesto que se forma es estable por 36 horas). Se midió la absorbancia a 485 nm. Cada mezcla de reacción se realizó por triplicado.

La determinación de lípidos se realizó por el método de Sulfofosfovainillina (Byreddy et al., 2016; Cheng et al., 2011; Mishra et al., 2014). Se pesó aproximadamente 0,01 g de biomasa liofilizada en tubos Falcon de 15 ml, se adicionó 2 ml de cloroformo:metanol [1:1] y perlas de sílice (para asegurar el rompimiento celular), pasando la muestra por vórtex durante 5 min y centrifugando a 6.000 rpm por 5 min. Se extrajo 60 µl de sobrenadante, siendo este dispuesto en tubo Eppendorf de 2 ml, para luego añadir 300 µl de ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado y someter la muestra a baño María de 90 °C durante 20 min, para así evaporar los solventes y propiciar la reacción de hidrolisis. La muestra fue luego enfriada en un congelador durante 10 min y se agregó 500 µl de ácido fosfórico al 17 % - Vainillina [0,2 g de vainillina/ml ácido fosfórico al 17 %]. Se agitó por vórtex y se midió a 540 nm. Todas las extracciones se realizaron por triplicado.

Tratamiento de aguas residuales del lavado de café

Para los tratamientos se utilizó agua proveniente del tanque del proceso de lavado del café, la cual fue recolectada en envases plásticos de 20 L y almacenada a -20 °C hasta el momento de su uso. Para limpiar las aguas residuales con microalgas se realizaron 2 experimentos con los siguientes tratamientos:

Experimento 1 (Parachlorella kessleri)

- Agua residual al 100 % + P. kessleri

- Agua residual al 50 % + P. kessleri

- Agua residual al 25 % + P. kessleri

Experimento 2 (Desmodesmus armatus)

- Agua residual al 100 % + D. armatus

- Agua residual al 50 % + D. armatus

- Agua residual al 25 % + D. armatus

Las aguas residuales se filtraron con ayuda de una bomba al vacío, usando filtros de 0,45 µm. Seguidamente, estas fueron esterilizadas durante 20 minutos a 120 °C y 15 PSI. Las diluciones del agua residual se realizaron con agua destilada desionizada. La unidad experimenta fue un frasco de vidrio 2.5 L, al que se añadió 1, 85 L de agua residual y 0,15 L de inóculo de alga, para una concentración final de algas de 1 x 106 células/mL.

Las condiciones de cultivo fueron irradiancia de 300 µmol de fotones m-2 s-1, fotoperíodo de 12:12 horas luz/oscuridad, 25 °C +/- 3 °C y burbujeo permanente con aire del ambiente. Los cultivos se mantuvieron por 15 días.

Para cada tratamientos se determinó DQO, fósforo total y nitrógeno total. Las mediciones se hicieron al inicio y final del cultivo, con el fin de determinar el efecto de las algas en la limpieza de aguas residuales del proceso de producción de café.

Análisis estadístico

Se realizó una estadística descriptiva, determinando la media para el resultado de cada tratamiento con su respectiva desviación estándar. Para los experimentos de limpieza de agua la unidad experimental fueron recipientes con 1,8 L de medio, luego de 4 repeticiones por tratamiento.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Obtención de cepas unialgal

Se obtuvieron dos cepas de microalgas de la clase Chlorophyceae:

- Cepa 1: Parachlorella kessleri (Fott & Nováková) Krienitz, E.H.Hegewald, Hepperle, V.Huss, T.Rohr & M.Wolf 2004 (figura 1).

Figura 1.
Parachlorella kessleri (1.000x)
Fuente: Luis Carlos Montenegro Ruíz.

La secuencia que se obtuvo del gen ribosomal 18s fue:

El resultado del Blast se muestra en la tabla 1.

Tabla 1.

Resultado del Blast para la cepa 1

Fuente: elaboración propia.

Cepa 2: Desmodesmus armatus (Chodat) E.H.Hegewald 2000 (figura 2).

Figura 2.
Desmodesmus armatus (1.000x)

La secuencia que se obtuvo del gen ribosomal 18s fue:

El resultado del Blast para esta cepa se muestra en la tabla 2.

Tabla 2.

Resultado del Blast para la cepa 2

Fuente: elaboración propia.

Análisis bioquímicos de las cepas de D. armatus y P. kessleri

Se encontró que bajo condiciones de cultivo óptimas, en el día 10, durante la fase estacionaria, la composición bioquímica de D. armatus fue: proteínas 493,33 mg/g peso seco, carbohidratos 310,01 mg/g peso seco y lípidos 166,66 mg/g peso seco. Para P. kessleri la composición fue: proteínas 396,66 mg/g peso seco, carbohidratos 320,03 mg/g peso seco y lípidos 255,05 mg/g peso seco (figura 3).

Los resultados obtenidos muestran que D. armatus y P. kessleri tienen contenidos de proteínas, carbohidratos y lípidos similares a los reportados para las especies de los géneros Chlorella, Parachlorella, Desmodesmus y Scenedesmus (Gómez et al., 2017; Palomino et al., 2019; Serrano et al., 2020). Además, se destaca el alto contenido de proteínas en D. armatus y el alto contenido de lípidos en P. kessleri, dando buenas expectativas para su uso biotecnológico en diferentes sistemas

Figura 3.
Contenido de lípidos, carbohidratos y proteínas en D. armatus y P. kessleri cultivadas bajo condiciones óptimas
Fuente: elaboración propia.

Las microalgas con alta producción de lípidos son consideradas como materia prima de tercera generación para la producción de biocombustibles (Palomino et al., 2019; Serrano et al., 2020). Los altos contenidos de proteína pueden ser aprovechados para el consumo humano o la elaboración de alimentos concentrados para animales (Chew et al., 2017; González-Delgado et al., 2017; Guccione et al., 2014). Además, se ha encontrado actividad antimicrobiana en varias proteínas en géneros de Parachlorella y Chorella (Yu-Cheng et al., 2019), por lo que otro mercado importante es el de pigmentos obtenidos a partir de estas algas, los cuales son utilizados en la industria alimenticia o nutraceútica como antioxidantes (Kulkarni & Nikolov 2014; Pozzobona et al., 2020; Safi et al., 2014).

Como se mencionó, después del tratamiento de aguas residuales, la biomasa de microalgas resultante se puede convertir en múltiples productos con alto valor agregado. Las proteínas corresponden a uno de los principales constituyentes de las microalgas y representan entre 50 y 70 %, junto con rendimientos en carbohidratos y grasas con valores cercanos a 40 y 30 % de la biomasa en peso seco, respectivamente (Alavijeh et al., 2020); esto, en función de las especies utilizadas y la fase de crecimiento del cultivo al momento de la cosecha. En el género Chlorella sp., cercano a Parachlorella, algunos estudios han realizado aproximaciones a sus rendimientos de macromoléculas, obteniendo porcentajes en aguas residuales de 51-63 % de contenido proteico, 12-17 % de carbohidratos y 14-22 % de lípidos (Mtaki et al., 2021). Por otro lado, en el género Desmodesmus sp. se reportan rendimientos de 11-25 % de proteína, 17-37 % de carbohidratos (Sun et al., 2020) y 26-60 % de lípidos (Chen et al., 2020; Sun et al., 2020; Zhang et al., 2020). A partir de estos hallazgos, se evidencia que el tratamiento de aguas residuales con microalgas puede tener un doble propósito, puesto que también contribuye a reducir la huella hídrica en algunos procesos productivos (Chen et al., 2020).

Remoción de nutrientes de aguas residuales del café

Se observó que P. kessreli y D. armatus son eficientes para la remoción de nitrógeno en aguas residuales, sin importar la concentración inicial de la misma. P. kessreli remueve 70, 67 y 61 % del nitrógeno de las aguas al 100, 50 y 25 % de concentración, respectivamente. Por su parte, D. armatus remueve 38, 70 y 50 % del nitrógeno al 100, 50 y 25 % de concentración, respectivamente (figuras 4 y 5).

Figura 4.
Disminución del contenido de nitrógeno total en aguas residuales del lavado de café utilizando P. kessreli durante 15 días de tratamiento
Fuente: elaboración propia.

Figura 5.
Disminución del contenido de nitrógeno total en aguas residuales del lavado de café utilizando D. armatus durante 15 días de tratamiento
Fuente: elaboración propia.

De otro lado, lo resultados muestran que D. armatus es más eficiente en la remoción de fósforo que P. kessreli. Para ambas especies, la capacidad de consumir fósforo es baja a bajas concentraciones de agua residual, puesto que P. kessreli remueve 15, 42 y 15 % del fósforo al 100, 50 y 25 % de concentración, respectivamente, mientras que D. armatus remueve 77, 87 y 38 % de este elemento al 100, 50 y 25 % de concentración, respectivamente (figuras 6 y 7).

Figura 6.
Disminución del contenido de fósforo total en aguas residuales del lavado de café utilizando P. kessreli durante 15 días de tratamiento
Fuente: elaboración propia.

Figura 7.
Disminución del contenido de fósforo total en aguas residuales del lavado de café utilizando D. armatus durante 15 días de tratamiento
Fuente: elaboración propia.

También se observó que P. kessreli es más eficiente disminuyendo la DQO que D. armatus, alcanzado cifras de remoción entre 60 y 70 %, de acuerdo con la concentración inicial. Por su parte, D. armatus solo disminuyó la DQO un 50 % a baja concentración, sin alcanzar valores importantes en altas concentraciones de agua residual (figuras 8 y 9).

Figura 8.
Disminución de la DQO en aguas residuales del lavado de café utilizando P. kessreli durante 15 días de tratamiento
Fuente: elaboración propia.

Figura 9.
Disminución de la DQO en aguas residuales del lavado de café utilizando D. armatus durante 15 días de tratamiento
Fuente: elaboración propia.

Las aguas residuales producto de las industrias agropecuarias se caracterizan por altas cargas de materia orgánica, nitrógeno amoniacal y fósforo. Estos compuestos constituyen un factor crítico para problemáticas ambientales como la erosión del suelo, la contaminación atmosférica producto de la volatilización de amoníaco y sulfuro de hidrógeno y la eutrofización de cuerpos de agua (Mousavi et al., 2020; Wang et al., 2020). En la actualidad, las aguas residuales se suelen someter a procesos oxidativos en lagunas para luego ser tratadas en lagunas anaeróbicas y, como etapa final, en lagunas aérobicas facultativas o reactores de película con lecho móvil (Wang et al., 2020), donde las microalgas son las protagonistas, ya que no solo gobiernan el consumo de CO2 sino que también brindan una alternativa segura y rentable a la aireación mecánica (Chen et al., 2020). Las microalgas juegan un papel esencial en estas últimas etapas, demostrando una notable capacidad de absorber nitrógeno y fósforo inorgánicos de forma eficiente, puesto que en este punto los contaminantes han sido degradados y mineralizados por acción de microorganismos heterotróficos (Nur & Buma, 2019; Wang et al., 2020).

Especies de algas como Scenedesmus obliquus y Chlorella sp. han sido estudiadas para el tratamiento de aguas residuales, generando resultados prometedores en la eliminación de DQO, P y N, con rendimientos aproximados para el género Desmodesmus sp. de 92,9 % para amonio y 88,5 % para nitrógeno total, así como remociones de 40,8 % para fósforo y 61,9 % para carbono orgánico disuelto (COD) en 14-17 días de tratamiento (Chen et al., 2020; Ferreira et al., 2017). Por otro lado, Chlorrella sp. reporta rendimientos para remoción de nitrógeno total de 95-100 %, fósforo de 85-95 % y COD de 90 % en 14-24 días de tratamiento (Chen et al., 2020; Sepehri et al., 2020), resultados similares a los encontrados en el presente trabajo.

CONCLUSIONES

Las microalgas Parachlorella kessreli y Desodesmus armatus son eficientes en la depuración de aguas residuales provenientes del lavado del café. Nuestros hallazgos muestran que en 15 días estas algas disminuyen el contenido de sustancias nitrogenadas y fosfatos en cifras superiores a 50 %, comprobando su potencial para los sistemas rurales de tratamiento de aguas contaminadas con características similares a los analizados en esta investigación.

Aunque existe una gran diversidad de microalgas con alto potencial para el tratamiento de aguas residuales, son pocas las que permiten su aislamiento y cultivo in vitro. En el presente estudio se alcanzó a tener dos cepas de clorofíceas Parachlorella kessreli y Desodesmus armatus.

Debido al alto contenido de lípidos de Parachlorella kessreli se recomienda su uso para la producción de biocombustibles o alimento para animales, mientras que Desodesmus armatus resulta ser adecuada para la alimentación humana y animal, gracias a su alta producción de proteína.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Servicio de Aprendizaje Nacional (SENA), convocatoria SENNOVA 2020.

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