INTRODUCCIÓN

La biología molecular y la genética en la sociedad del conocimiento del siglo XXI se mezclan cada vez más con disciplinas tradicionalmente separadas pero rela­cionadas, como la física, la informática y la matemáti­ca (Furge, Stevens-Truss, Moore, & Langeland, 2009). El proyecto genoma humano, iniciado en 1990, pro­dujo el desarrollo de una ciencia sin la cual la gran cantidad de datos del genoma no hubiera podido ser analizada: la bioinformática. Esta ciencia –que cada día toma más fuerza–, unida al uso de métodos com­putacionales, puede resolver problemas biológicos que requieren nuevos enfoques. Un plan de estudio bien estructurado e integral en biología molecular debe incluir esta ciencia. De otra parte, el aprendizaje basado en problemas, orientado a la investigación y el desarrollado en equipos, y dirigido de manera ade­cuada por profesores, se convierte en una estrategia centrada en el estudiante que apoyan el aprendizaje activo y que son muy efectivas en la educación cientí­fica (Prieto, 2006).

La bioinformática se refiere a: “La investigación, de­sarrollo o aplicación de herramientas y enfoques computacionales para expandir el uso de datos biológicos, médicos, conductuales o de salud, incluidos aquellos para adquirir, almacenar, organizar, archivar, analizar o visualizar datos” (BISTIC, 2000). Teniendo esta definición en mente, y siguiendo nuestro programa durante la semana siete de clases, se desarrolló el tema de métodos en biología molecular, específicamente los métodos de RT-PCR, PCR tiempo real, sondas, hibridaciones de Southern, Northern y Western, así como la utilización de vectores (plásmidos, cósmidos, fásmidos, cromosomas bacterianos y cromosomas de levaduras) para la clonación de genes. Paralelamente, se realizaron aplicaciones bioinformáticas para aprender a descargar secuencias de GenBank y utilizar programas para el corte con enzimas de restricción [Nebcutter V2.0, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/] (Vincze, Posfai, & Roberts, 2003) y construir los perfiles electroforéticos. Adicionalmente, los estudiantes aprendieron a realizar alineamientos de secuencias de ADN utilizando ClustalW [https://www.genome.jp/tools-bin/clustalw] (Li, 2003), diseñar primer con Primer3web versión 4.1.0 [http://primer3.ut.ee/] (Untergasser et al., 2012), hacer PCR virtuales con iPCR [https://embnet.vital-it.ch/software/iPCR_form.html] (Lexa, Horak, & Brzobohaty, 2001) y, de manera destacada, a manejar la herramienta BLASTn de GenBank para la búsqueda de secuencias homólogas [https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi] (Altschul, Gish, Miller, Myers, & Lipman, 1990); este último programa además compara secuencias de nucleótidos o proteínas con bases de datos de secuencias y calcula la significación estadística (GenBank, 2020). Teniendo en cuenta lo anterior, se puede afirmar que los estudiantes se relacionaron con las más actuales y modernas herramientas para el aprendizaje de análisis de secuencias proteicas y de ácidos nucleicos.

Históricamente, la educación en ciencia ha requeri­do desarrollar un enfoque que propicie enseñanza contextualizada o en contexto del mundo real, con lo cual el aprendizaje se convierte en altamente signifi­cativo. Así, cuando la nueva información se relaciona con algún aspecto de lo ya existente en la estructu­ra cognitiva del individuo, se produce un proceso que conduce al aprendizaje significativo (Novak, 1988). A partir de este argumento, se introdujo a los estudian­tes en el conocimiento de la pandemia producida por el nuevo coronavirus (NCOV 19) descubierto a finales de 2019 en Wuhan, provincia de Hubei, China (Wu et al., 2020). Este coronavirus causa una infección severa en las vías respiratorias. Desde su aparición a princi­pios de diciembre de 2019 hasta el 26 de marzo de 2020, el número de casos ha aumentado exponencial­mente hasta 858.785, con un total de 42.151muertes y una recuperación de 178.119 pacientes (Dong, Du, & Gardner, 2020). La pandemia se ha generalizado a 180 países, donde las naciones con mayor número de infectados son China (82.290), Italia (105.792), Esta­dos Unidos (189.035) y España (95.923). Colombia no ha sido ajeno a la pandemia, registrando su primer caso de contagio el 3 de marzo de 2020. Actualmen­te, el país cuenta con 906 casos reportados (Dong et al., 2020).

Dentro de las políticas que han tomado la mayoría de los países que presentan individuos infectados por covid-19 se encuentran: el aislamiento de los enfer­mos, la cuarentena de personas que posiblemente han estado expuestas al virus, el confinamiento de to­dos sus habitantes para prevenir nuevos contagios y la realización de un mayor número de pruebas diag­nósticas. Una de estas pruebas se basa en la RT-qPCR, técnica que permite hacer una copia de DNA comple­mentario a partir del RNA viral utilizando una enzima denominada transcriptasa inversa, la cual convierte el RNA de cadena sencilla en DNA de doble cadena. Con esta enzima es posible amplificar diferentes regiones del virus para posibilitar su caracterización. Para ello, se usan primers, o cadenas sencillas cortas de ADN (20 nucleótidos), y sondas de DNA marcadas con fluo­rocromos para identificar en tiempo real la amplifica­ción de los fragmentos.

La PCR en tiempo real (o cuantitativa) permite medir la cantidad de copias del DNA viral en la muestra. Esta técnica es bastante confiable para identificar los virus. Sin embargo, cuenta con algunas limitaciones. Una de ellas es el tiempo necesario para su ejecución (4-6 h), lo que limita el número de pruebas que se pueden realizar al día. Otra limitante son los reactivos o kits para desarrollar las pruebas, puesto que en este mo­mento se reporta escasez de estos elementos debido a la gran demanda a escala global. Además, la con­taminación es un problema limitante, puesto que se requieren laboratorios con suficiente bioseguridad a fin de evitar que se presenten falsos positivos y falsos negativos, como ocurre en algunas ocasiones.

Por otra parte, estas pruebas permiten detectar pa­cientes asintomáticos, configurando un diagnóstico de gran importancia debido a que estos son transmisores activos de la infección (Costa, 2004; Salazar, Sandoval, & Armendáriz, 2013).

A partir de lo anterior, este trabajo tuvo como objeti­vo diseñar una prueba diagnóstica con los estudiantes del curso de biología molecular 2020-1 de la Universi­dad Jorge Tadeo Lozano, quienes trabajaron muy se­riamente y propusieron las bases para desarrollar una prueba que podría convertirse en kit para identificar el COVID-19.

MÉTODOS

Revisión de literatura

Los estudiantes consultaron literatura relacionada con las técnicas moleculares actualmente utilizadas para la identificación de virus de rna en las bases de datos ScienceDirect, Scopus, GenBank y Elsevier. Con base en la información recopilada, se planteó una me­todología alternativa para la detección del SARS-COV2. La figura 1 presenta la propuesta metodológica para el desarrollo de este estudio.

Identificación de genes

Se recuperaron de la base de datos de GenBank (NCBI, 2020) los genomas completos de tres cepas de coronavirus correspondientes a Wuhan ncov-19 (NC_045512.2), Human SARS (NC_004718.3) y Bat SARS (DQ412043.1). Las secuencias de cada uno de los 11 genes que componen al virus Wuhan ncov-19 fueron alineadas al genoma de las otras dos especies con ClustalW. Adicionalmente, se seleccionaron los genes que presentaron menor puntaje contra regio­nes del genoma del Human SARS y Bat SARS como po­sibles candidatos para la identificación molecular de COVID-19.

Diseño de primers

Utilizando la secuencia de los genes candidatos iden­tificados previamente mediante ClustalW que presen­taron un score inferior a 70 %, se diseñaron primers con el programa Primer3 versión 4.1.0, empleando los parámetros %GC (40 < %GC < 60) y la probabilidad de hair pins (horquillas).

Diseño de sondas

Se diseñaron sondas tipo TagMan a partir de unas regiones de 20 y 24 pb al interior de cada uno de losgenes predichos como posibles marcadores moleculares.Se utilizó el programa MegaX para extraer la secuencia reverse complement de las regiones de cada uno de los genes, las cuales, por complementariedad, se hibridarán a los genes que se quiere identificar. Alas sondas creadas se les incorporará dos fluorocromos (un aceptor y un donador).

RT-qPCR

Para el diagnóstico del virus COVID-19 se realizará una RT-qPCR, la cual, inicialmente, sintetizará una cadena de CDNA a partir del RNA viral, para posteriormente amplificar y cuantificar en tiempo real la expresión de genes que permitirán su identificación de forma dife­rencial (Pinilla, 2019).

RESULTADOS

El SARS-CoV-2 es un betacoronavirus responsable de la pandemia de COVID-19. Este posee un transcripto­ma altamente complejo debido a numerosos eventos de recombinación, tanto canónicos como no canó­nicos. Su genoma está compuesto por 11 genes con longitudes entre 114 y 3.822 pb y comprende cerca de 30.000 pb, distribuido de la siguiente manera: en el extremo 3” una cápside, en el extremo 5” una cola poliA, en su interior dos orfs 1a y 1b, los cuales se traducen en 46 proteínas una vez colonizan la célu­la, 3 regiones de arn que codifican para proteínas es­tructurales (“S” proteína espiga “spike protein”, “M” proteína de membrana, “N” proteína de la cápside) y 6 proteínas accesorias (3a, 6, 7a, 7b, 8 y 10), como se muestra en la figura 2 (Kim et al., 2020).

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-qPCR) es una metodología sensible que se utiliza ampliamente en diagnóstico e investigación biológica. Su mayor virtud es poder amplificar frag­mentos pequeños a partir de mínimas cantidades de DNA del cual se quiere identificar presencia en una muestra. En diagnóstico clínico, la RT-qPCR es utiliza­da para medir las cargas virales o bacterianas. Por esta razón, los autores consideran que este méto­do es el mejor, más rápido y económico para hacer diagnóstico del coronavirus COVID-19. Sin embargo, se requiere tener alguna experiencia en el manejo de las herramientas bioinformáticas para reconocer los genes o regiones a amplificar, el diseño de pri­mers y el diseño de sondas. La RT-qPCR es utiliza­da para mejorar la eficiencia diagnóstica como mé­todo rápido y temprano para identificar el agente etiológico (en este caso, el coronavirus COVID-19) y de esta manera tomar las medidas de prevención y control del contagio y la enfermedad en fases tem­pranas con el objetivo de evitar su dispersión (Cor­man et al., 2020).

El COVID-19 es un virus cuyo material genético es RNA de cadena sencilla. Por ello, se presenta un in­conveniente, pues la PCR amplifica únicamente frag­mentos de cadena doble, es decir, DNA. Sin embar­go, métodos como la RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa con trasncriptasa inversa o reversa) representan una solución para estos casos debido a que permiten convertir una cadena sencilla de RNA en una doble cadena de DNA complementaria (CDNA) con una alta fidelidad (Costa, 2004). En la figura 3 se presenta el proceso mediante el cual, empleando un kit de aislamiento para RNA total, se obtiene el ma­terial genético del virus. Posteriormente, utilizando un primer de TTTTs, se origina la primera cadena de CDNA y luego, por PCR, se obtienen cadenas dobles del CDNA del virus (figura 3).

Al tener la cadena de CADN se prosigue con la ampli­ficación de uno o varios fragmentos de esta molécu­la. El COVID-19 tiene un RNA de 29,903 pb (figura 1). La qPCR es un método que amplifica regiones o frag­mentos de ADN y los detecta de manera paralela den­tro del mismo microtubo utilizado. Por ello, se utili­zan sondas, que son fragmentos marcados de ADN de cadena sencilla complementarios a las zonas que se van a amplificar, de manera que al unirse a los frag­mentos amplificados permite identificarlos y cuanti­ficarlos. Los autores del presente trabajo selecciona­ron sondas de hidrólisis (Taqman) que corresponden a fragmentos de ADN de cadena sencilla marcados en el extremo 3’ con un fluorocromo donador que repor­ta la fluorescencia, emitiendo luz al ser chocado por la ADN polimerasa, y un aceptor en el extremo 5’, lla­mado quencher, el cual atrapa la fluorescencia que li­bera el donador. Las moléculas donadora y aceptora deben estar cercanas, de manera que cuando la son­da está intacta, la fluorescencia emitida por el dona­dor no es observable, al ser absorbida por el aceptor (figura 4A). Durante la amplificación, la Taq polime­rasa de ADN rompe o libera el extremo libre 5’ de la sonda que contiene al donador al iniciar la síntesis, permitiéndole emitir la florescencia (figura 4B), que es captada por el lector (figura 4C) (Costa, 2004).

Identificación de genes candidatos para detección del virus COVID-19

Las secuencias de los genomas de Wuhan nCOV-19, Human SARS y Bat SARS descargados de GenBank presentaron longitudes de 29.903, 29.751 y 29.749 pb, respectivamente. El virus Wuhan- nCOVID-19, estructuralmente está compuesto por 11 genes distri­buidos como se presenta en la tabla 1, con longitudes entre 114 y 3.822 pb. A diferencia del SARS humano, el SARS aislado en murciélagos es 0,5 % más largo y su composición está bien definida a nivel de UTRs, CDs y proteínas.

Las secuencias de los once genes presentados por el Wuhan COVID-19 coronavirus (NC_045512.2) fue­ron alineados con los genomas de las cepas de Hu­man-SARS y Bat-SARS mediante ClustalW. Los pun­tajes obtenidos por el alineamiento de cada una de las secuencias con cada uno de los 11 genes coincidió con que los genes 2 y 9 presentes en COVID-19 po­drían ser utilizados para su identificación por RT-qP­CR, considerando que los dos alineamientos presen­taron puntajes menores a 70 % contra regiones de los dos coronavirus (figuras 5 y 6). Los alineamientos de estos dos genes al genoma del virus Human-SARS se pueden apreciar en las figuras 7 y 8.

Diseño de primers-oligonucleótidos

Utilizando el programa Primer3 versión 4.1.0 y la se­cuencia completa de los dos genes candidatos (genes 2 y 9) como posibles marcadores moleculares para la identificación de covid-19, se diseñaron dos pares de primers con una longitud de 20 pb cada uno, los cua­les amplifican en su totalidad cada uno de los genes. Sus características se presentan en la tabla 2.

A pesar de que el gen número 8 también produjo una puntuación baja, se descartó su uso debido a que este correspondía a una secuencia muy corta dentro del genoma del Wuhan nCOV-19 (figura 1) y por tanto no cumple con las características para el diseño de primers.

Diseño de sondas

Para el diseño de las sondas se seleccionaron 2 regio­nes dentro de los genes 2 y 9, de 20 y 24 pb, respec­tivamente. Con ayuda del programa MegaX, se obtu­vieron las cadenas complementarias a esas regiones utilizando la opción reverse complement. Las regiones seleccionadas se hibridarán por complementariedad a los genes que se requiere identificar. Además, a es­tas sondas se les incorporará dos tipos de fluorocro­mos (un aceptor y un donador). Las sondas diseñadas se presentan a continuación:

Sonda COVID-19- Gen2 (Size = 20pb)

Sonda COVID-19- Gen9 (Size = 24pb)

Una vez tenemos los primers y las sondas diseñadas para amplificar un fragmento de los genes S y ORF8, es posible afirmar que contamos con los componentes necesarios para realizar la identificación del COVID-19; los demás reactivos, como enzimas, tampones y cofac­tores, se consiguen fácilmente en el mercado.

DISCUSIÓN

Se propuso un diseño para el desarrollo de la reac­ción de RT-qPCR y de esta forma identificar el virus covid-19 responsable de la pandemia que actualmen­te se desarrolla en todo el planeta. Para ello, se uti­lizaron métodos moleculares (RT-qPCR) y programas bioinformáticos que permitieron analizar las secuen­cias del virus y a partir de ellas diseñar los primers y sondas para su amplificación y cuantificación. Por medio de este ejercicio, los estudiantes lograron com­prender las variables de las dos reacciones: RT-PCR y la PCR Tiempo Real.

Aunque, en general, se utilizaron de forma adecua­da las herramientas bioinformáticas para encontrar los genes, diseñar los primers y las sondas, se pre­sentó un error conceptual, puesto que al inicio se realizaron las comparaciones entre genes y geno­mas. No obstante, se hizo necesario comparar gen con gen para detectar la identidad de cada uno de ellos y así detectar zonas de homología y zonas va­riables, con el fin de diseñar los primers de tal ma­nera que se aseguraran de amplificar fragmentos únicos del COVID-19. Finalmente, esto se consiguió gracias a que los estudiantes aprendieron del error, lo corrigieron y lograron identificar los genes más variables.

ClustalW es una herramienta sencilla que permite ex­plicar conceptos básicos de biología molecular y ha­cer comparaciones entre secuencias equidistantes y de una longitud similar (Thompson, Plewniak, & Poch, 1999). Al realizar comparaciones entre secuencias de diferente longitud, y con base en la plataforma que se utilice, el resultado de los alineamientos difiere, ya que cada plataforma maneja sus propios parámetros por defecto. Por ende, cuando se realizan alineamien­tos múltiples se asignan diferentes puntuaciones a los gaps e inserciones para optimizarlos (Gaskell, 2000).

La realización de este tipo de ejercicios académicos por parte de los estudiantes de biología molecular permite afianzar los conocimientos adquiridos, in­centivar la creatividad y gusto por las ciencias ómi­cas y despertar su curiosidad por comprender nue­vas herramientas como la bioinformática, lo cual nos permite adentrarnos y comprender nuevos con­ceptos y procesos relacionados con la vida, contri­buyendo a descubrir los misterios ocultos de la na­turaleza.

CONCLUSIONES

Se logró el objetivo planteado para esta investiga­ción al analizar las secuencias de los virus y dise­ñar primers y sondas, los cuales son los insumos más importantes para realizar el diagnóstico de COVID-19.

El trabajo presentado consistió en la aplicación de la metodología de aprendizaje basado en problemas (ABP) a manera de un ejercicio de aprendizaje en con­texto, el cual fue llevado al plano actual de la pande­mia de COVID-19 con un enfoque interdisciplinar en el que se debían aplicar conocimientos teóricos de mé­todos en biología molecular y emplear diferentes he­rramientas bioinformáticas.

ClustalW y primers 3 son dos herramientas bioinfor­máticas fáciles de usar que resultan muy valiosas, ya que permiten a los estudiantes afianzar los conoci­mientos adquiridos en clase y desarrollar su capaci­dad de análisis.

Ejercicios académicos como estos ayudan a los es­tudiantes a comprender la importancia de la biolo­gía molecular, la bioinformática y las ciencias ómicas para el desarrollo de estrategias que permitan de­tectar virus emergentes y contribuir al desarrollo de la ciencia.

Referencias

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