RESUMEN GRÁFICO

autores.

1. INTRODUCCIÓN

La morera Morus spp. es un árbol caducifolio, leñoso, perenne y de crecimiento rápido, perteneciente a la familia Moraceae, con variedades y especies cultivadas representativas como M. alba, M. inga y M. indica, que representan un componente vital de la sericultura por ser la única fuente de alimento para B. mori (Sohn, 2014). Actualmente se distribuye en más de 70 países y también se utiliza como forraje verde o en forma de ensilaje o deshidratada para la alimentación de animales de granja o para producción de frutos, usos ornamentales y medicinales (Vijayan et al., 2011). En la última década del siglo XX, los países de Centroamérica y el Caribe han trabajado en la introducción y multiplicación de las especies de morera oriundas de la zona asiática. Esta creciente importancia económica para el trópico, ha influido en los esfuerzos para colectar, estudiar y conservar el germoplasma del género Morus (Tikader y Vijayan, 2010; Mathithumilan at al., 2013), considerando que son fundamentales para desarrollar materiales con alta producción de forraje, resistentes a enfermedades y tolerantes a diferentes condiciones ambientales. China dispone de más de 2600 accesiones de morera, India con 1120, Japón con 1502, Corea con 615 y Bulgaria con 140 aproximadamente, además otros países cuentan con pequeñas colecciones (Tikader y Vijayan, 2010; Vijayan et al., 2011). Existen aproximadamente 68 especies dentro del género Morus, pero las accesiones en bancos de germoplasma pertenecen principalmente a las especies M. alba, M. bombycis, M. indica y M. latifolia; es decir, la mayor parte de los parientes silvestres no han sido colectados, estudiados y conservados, por lo tanto, estos materiales representan una fuente potencial de recursos para ampliar la diversidad genética disponible e incorporar características de interés a los bancos de germoplasma, especialmente M. serrata Roxb. y M. macroura Miq, que en los análisis de diversidad han demostrado una marcada diferenciación genética y presenta relaciones distantes con las especies más empleadas del género Morus (Tikader y Vijayan, 2010; Mathithumilan at al., 2013).

El proyecto de Sericultura Caucana en el año 2016, estableció un banco de germoplasma de Morus spp en el Centro de Estudios Vegetales (CEV) de la Universidad del Cauca (Vereda “La Rejoya”, Popayán), con accesiones donadas por sericultores de la región; no obstante, no contaban con información sobre el nombre, origen, descriptores o datos de pasaporte. En este contexto, el desconocimiento de los recursos genéticos representa un obstáculo para el aprovechamiento del potencial agronómico de estos materiales y sería evidente por la utilización, casi exclusiva, de la variedad Kanva 2 para la alimentación del gusano de seda en el Cauca. Por esta razón, la efectividad con la que se puede manejar y gestionar el germoplasma de morera dependerá de la información genética disponible. En este sentido, los marcadores moleculares son herramientas que proporcionan datos más exactos, amplios y detallados que los marcadores fenotípicos (morfológicos y bioquímicos), puesto que no están influenciados por el ambiente, por lo tanto, la naturaleza de la información que proporcionan es idónea para caracterizar y discriminar genéticamente los materiales de estudio (Cornejo et al., 2014; Angelo et al., 2013).

La investigación tuvo como objetivo caracterizar y analizar la variabilidad genética de la colección de morera Morus spp del proyecto de sericultura caucana empleando marcadores microsatélites.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

La colecta de las muestras se realizó en el Centro de Estudios Vegetales (CEV) adscrito a la Universidad del Cauca, ubicado en la vereda La Rejoya, a 7 km del nororiente de la cabecera municipal, en las coordenadas 2° 29’ 55,6” Latitud Norte, 76° 34’ 58,1” Longitud Oeste, a una altura de 1800 msnm, temperatura promedio de 18°C y precipitación promedio anual de 1750 mm (Vivas y Morales, 2005). Posteriormente, los métodos y protocolos de laboratorio fueron realizados en el Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira.

Material vegetal: se evaluaron 36 accesiones de Morus spp (Tabla 1). Para la extracción de ADN genómico se utilizó tejido foliar de hojas jóvenes, pulverizado con nitrógeno líquido, utilizando el Kit de extracción NucleoSpin® Plant II mini, siguiendo las instrucciones del fabricante (MACHEREY-NAGEL). Posteriormente, las muestras fueron almacenadas a -20 °C. La calidad del ADN obtenido (concentración, pureza e integridad) se verificó mediante espectrofotometría y electroforesis en gel de agarosa (0,8%) con tinción GelRed.

Tabla 1.

Accesiones que conforman la colección de Morus spp.

autores. *SN: sin nombre.

Genotipificación de los microsatélites: la investigación manejó ocho microsatélites (Tabla 2), diseñados específicamente para su utilización en Morus spp. El coctel de amplificación incluyó 1-4 ng/µl de ADN, 1,8 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs, 0,2 µM de cada oligonucleótido, 5 µl de tampón de PCR (5x) y 0,625 U de Taq polimerasa (OneTaq® DNA Polymerase, NEB), para un volumen final de 25 µl por muestra. La PCR se llevó a cabo en un termociclador Bio-Rad PTC-100 con oligonucleótidos marcados con fluorescencia, utilizando las siguientes condiciones de amplificación: desnaturalización inicial a 95 °C durante 5 min; seguida de 35 ciclos a 94 °C durante 30 s, temperatura de alineamiento para cada cebador (53-64 °C, Tabla 2) durante 30 s, extensión a 68 °C durante 30 s; y una extensión final a 68 °C durante 10 min. La longitud de los productos de la PCR (amplicones) se determinó mediante el análisis de los fragmentos marcados con fluorescencia en un secuenciador automático de electroforesis capilar (Applied Biosystems 3730XL, GeneScan 500 LIZ Size Standard, Macrogen, Corea). Las lecturas fueron procesadas y el tamaño de los alelos identificados se asignó utilizando el software Geneious v7.0 (Kearse et al., 2012).

Tabla 2.

Microsatélites (SSR) usados para evaluar la diversidad genética en la colección de Morus spp.

autores. * Tm: temperatura de alineamiento, € Diana fluorescente presente en los primeros para marcar las ampliaciones.

Análisis estadístico

La diversidad genética fue estimada mediante el número de alelos observados (Na), el número efectivo de alelos (Ne), la heterocigosidad observada y esperada (Ho y He) y el índice de fijación (Fis) utilizando el programa GenAlEx v. 6.5 (Peakall y Smouse, 2006; 2012). Para determinar el carácter informativo de los microsatélites y la población total, se calculó el contenido de información polimórfica (PIC) y el rango de tamaño (pb) utilizando el programa CERVUS v. 3.0 (Kalinowski et al., 2007). El equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) y el desequilibrio de ligamiento (LD) entre todos los pares de loci se evaluó utilizando Arlequin v. 3.5 (Excoffier y Lischer, 2010), mediante el método de Cadenas de Markov para 10.000 permutaciones y, así, determinar si las frecuencias alélicas y genotípicas obtenidas con cada microsatélite se ajustaban a diferentes modelos de la genética de poblaciones.

La estructura poblacional fue analizada con el método Bayesiano implementado en el programa STRUCTURE v. 2.3.4 (Pritchard et al., 2000; Falush et al., 2003, 2007; Hubisz et al., 2009). Teniendo en cuenta, que el origen de los cultivares modernos de morera incluyen hibridaciones intra e interespecíficas, se adoptó el modelo de mezcla y frecuencias alélicas correlacionadas para la identificación del número más probable de poblaciones (K) en que está dividida la colección de Morus y los valores de pertenencia de cada accesión a esas K poblaciones (Matriz Q). El programa fue ejecutado con un burn-in de 10.000, seguido de 50.000 Cadenas de Markov de Monte Carlo (MCMC), analizando de 1 a 10 como el número posible de K, con diez iteraciones o repeticiones por cada K. La elección del número más probable de K se realizó basándose en el mayor valor logarítmico de la verosimilitud (LnP(K)) utilizando el método desarrollado por Evanno et al. (2005), implementado en Structure Harvester (Earl y Vonholdt, 2012). Adicionalmente, se realizó un análisis de varianza molecular (AMOVA - Fst) para determinar el grado de diferenciación genética; la significancia estadística se estableció con los índices F: Coeficiente de diferenciación genética entre poblaciones (Fst), Coeficiente de endogamia entre poblaciones (Fis) y Coeficiente de endogamia total (Fit), a partir de un bootstrap de 1000 réplicas utilizando el software GenAlEx v. 6.5 (Peakall y Smouse, 2006; 2012).

El agrupamiento de las accesiones se observó mediante el dendograma construido a partir de una matriz de disimilaridad usando el algoritmo Neighbor-joining con las distancias de Sokal y Michener y valores de boopstrap de 1000 réplicas para evaluar la solidez del árbol, utilizando el programa DARwin v. 6.0 (Perrier y Jacquemoud, 2015); posteriormente, fue editado con el programa Figtree v. 1.4.2 (Rambaut, 2014) para obtener el árbol consenso. Paralelamente, se realizó un análisis de coordenadas principales (PCoA) en GenAlEx v. 6.5 (Peakall y Smouse, 2012), a partir de las distancias genéticas corregidas de Nei y de esta manera, obtener una representación gráfica de los resultados y visualizar la diferenciación de las accesiones.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Diversidad genética y Características de los microsatélites

Los ocho loci microsatélites amplificados, generaron 49 alelos en total, el mayor número lo presentó el marcador MulSTR3 seguido de Mul3SSR95. El rango se ubicó entre 4 y 11 con un promedio de 6,125 alelos por locus (Tabla 3). El número efectivo de alelos (Ne) fue inferior al número observado de alelos (Na) en todos los microsatélites, indicando que la distribución de las frecuencias alélicas no es del todo equitativa dentro de los mismos, es decir, existen alelos en cada marcador con una frecuencia superior, en mayor o menor grado, a la de los demás. Este tipo de distribución puede indicar la presencia de alelos raros o exclusivos y sugerir que un material o población se ha mantenido genéticamente aislado (Slatkin, 1985), y, en consecuencia, pueden ser importantes para discriminar o diferenciar materiales entre sí; igualmente, según los trabajos de Brown y Briggs (1991) y Frankel et al. (1995), los alelos exclusivos mostrarían la posible presencia de fenotipos adaptados a condiciones ambientales específicas o de interés productivo.

El PIC alcanzó un valor promedio de 0,57 con un rango entre 0,171 y 0,859 (Tabla 3), donde los marcadores MulSTR3 y Mul3SSR95 presentaron el mayor poder discriminatorio. De acuerdo con la escala propuesta por Botstein et al. (1980) y lo expresado por Laos (2022) y Guerra et al., (2018), los seis marcadores que presentaron valores de PIC >0,5 fueron altamente discriminantes e informativos; MulSTR1 fue moderadamente informativo (0,25 <PIC<0,5) al presentar el menor número de alelos efectivos y observados; por su parte, SS04 fue ligeramente informativo (PIC< 0,25), por ende, con locus de baja diversidad, aspecto que permite inferir la baja capacidad discriminante del marcador en la colección analizada.

Resultados similares fueron obtenidos en estudios que han analizado una cantidad semejante de materiales (entre 27 y 53 aproximadamente), en los cuales el número de alelos por locus y el PIC presentaron valores entre 5 a 7 y 0,4 a 0,7 respectivamente (García et al., 2019; Krishnan et al., 2014; Wangari et al., 2013; Wani et al., 2013; Zhao et al., 2005). Orhan et al. (2020) también lograron resultados similares, reportando un número de alelos y PIC promedio de 5.19 y 0.61 respectivamente; aunque, a diferencia del presente estudio, el marcador SS04 fue altamente informativo, posiblemente, porque incluyeron un mayor número de genotipos, 73 en total, que abarcaban 3 especies diferentes (M. nigra, M. rubra y M. alba). Aggarwal et al. (2004), por su parte, obtuvieron 18 alelos por locus, mientras que, Krishnan et al. (2014) reportaron 215 alelos en total; en este sentido, los valores individuales de cada locus SSR analizado en el presente estudio fueron inferiores al número de alelos y el PIC reportados previamente (Zhao et al., 2005; García et al., 2019), efecto ocasionado probablemente, por la presencia de un alto número de genotipos duplicados en la colección.

Tabla 3.

Características de los ocho microsatélites (SSR) en 36 accesiones de Morus spp.

autores. *Gran promedio ± Error estándar entre loci SSR, N: número de individuos muestreados, Na: número de alelos, Ne: número efectivo de alelos, PIC: contenido de información polimórfica, Ho: heterocigosidad observada, He: heterocigosidad esperada, Fis: índice de fijación.

Las frecuencias genotípicas de los microsatélites no se ajustaron significativamente (P <0,05) al equilibrio de Hardy-Weinberg (HW); en la mayoría de los casos, se observaron valores positivos del índice de fijación (Fis) indicando déficit de heterocigotos o eventos pasados de cruzas entre materiales cercanos, aumentando la endogamia y disminuyendo la heterocigosidad (Herrera et al., 2021; Suarez et al. 2016); al respecto, Ellegren y Galtier (2016), señalan que se aumentaría la probabilidad de perder alelos para la siguiente generación, llevando a la pérdida progresiva de diversidad genética. Además, en la prueba de desequilibrio de ligamiento (LD, Figura 1), la mayoría de los loci o microsatélites presentaron una asociación altamente significativa entre sí (P <0,05). En este contexto, los resultados de las pruebas de HW y LD comprobarían que los materiales analizados no se comportan como una población ideal con reproducción aleatoria; por el contrario, representan una población estructurada, producto posiblemente de los procesos de selección, que normalmente operan en el mejoramiento genético de cultivares para desarrollar características productivas y biológicas particulares (Dempewolf et al., 2017; Loo, 2011).

Figura 1.
Resultados de la prueba de desequilibrio de ligamiento para todos los pares de microsatélites (P=0,05). Los símbolos “+” indican parejas de loci SSR significativamente ligados, mientras el símbolo”- “indica lo contrario, no ligados de forma significativa. Codificación de loci en la prueba: Loci 0: MulSTR3, loci 1: Mul3SSR95, loci 2: MulSTR4, loci 3: SS04, loci 4: MulSTR5, loci 5: MulSTR6, loci 6: MulSTR2, loci 7: MulSTR1.
autores.

Estructura poblacional y relaciones genéticas

Con el fin de estimar el número aproximado de poblaciones en que se estructuran las accesiones se empleó inicialmente el valor máximo estimado del logaritmo de la probabilidad (LnP(K)). Sin embargo, no alcanzó un valor que se mantuviera estable, por el contrario siguió aumentando y en cierto punto presentó una variación inestable junto con un aumento considerable en las varianzas, especialmente después de K=6 (Figura 2a). Por esta razón, se proyectó que el número más probable de poblaciones debía ser inferior a K=6. Adicionalmente, el método de Evanno et al. (2005), que calcula el segundo orden de cambio de probabilidad (Δk), es más sensible que el anterior para detectar el número de poblaciones más probable bajo las circunstancias anteriormente descritas. Adoptando dicho enfoque, Δk alcanzó su máximo valor en K = 3 (Figura 2b), indicando que la colección completa de morera estaría estructurada en tres grupos poblacionales diferentes.

Figura 2.
Selección del número más probable de subpoblaciones (K) para las accesiones evaluadas. a) Valores medios de LnP(K) para las 10 iteraciones independientes de cada K. b) Gráfico de los valores de Δk (delta K) para cada K, basado en el cambio de segundo orden de la función de verosimilitud (Evanno et al., 2005).
autores.

El dendrograma (Figura 3a y 3b) y el PCoA (Figura 4) permitieron identificar tres agrupaciones, las cuales coinciden con los grupos poblacionales reconocidos anteriormente. Esto implicaría la presencia de grupos poblacionales discretos, es decir, representarían poblaciones o grupos aislados entre sí, con un germoplasma propio y único y escaso flujo genético con los demás, excepto por posibles eventos de introgresión o hibridación entre materiales contrastantes, como se puede observar en los genotipos B3, 34, 33, 28 y 18; los cuales presentan un valor de pertenencia menos dominante a determinada población y más distribuido entre dos o tres de los grupos.

En el clúster, para el código de color azul se destaca la agrupación de materiales provenientes de Bulgaria (etiquetados con una B inicial), denotando que su origen geográfico representaría una relación genética más estrecha. El código rojo concentra accesiones que en el análisis de estructura poblacional presentaron valores de pertenencia menos dominantes, y podrían catalogarse como materiales híbridos. La distribución de los códigos de color sugiere una relación cercana entre los grupos azul y rojo, e indicaría que el rojo está compuesto por materiales de origen chino o japonés y tendrían asociación directa con materiales que fueron introducidos en Europa desde el medio o lejano oriente por rutas marítimas o terrestres, según las vías de diseminación de la morera en el mundo propuestas por García et al. (2019). Finalmente, el clúster verde se destaca por incluir a Kanva 2, el cultivar más empleado en departamento del Cauca para la alimentación del gusano de seda Bombyx mori (Ruiz, 2022; Viteche, 2015), y estaría representando por materiales tropicales originados en el sur de la India, con alto número de posibles duplicados, como puede observarse en el dendrograma (Figura 3a) y en el PCoA (Figura 4). El cultivar Kanva 2 (K2) tendría como posibles duplicados, las accesiones 5, 14, 17 y 31; situación similar ocurriría entre las accesiones 19, 21, 27 y 32, que podrían representar un genotipo. Con relación al genotipo 15, podría representar dos materiales diferentes y distantes al estar incluido en diferentes grupos, por lo cual fueron etiquetados como a y b.

Krishnan et al. (2014) al analizar 36 genotipos, incluyendo materiales silvestres, encontraron que estos materiales se dividían en cuatro grupos poblacionales, contexto que no es posible encontrar en Colombia, por no ser el centro de origen del género Morus. Sin embargo, García et al. (2019) y Orhan et al. (2020) también indicaron la presencia de tres clústeres en su análisis de agrupamiento, señalando que las colecciones de germoplasma de morera muestran una tendencia a estar organizadas genéticamente en tres grupos poblacionales. En el caso de Krishnan et al. (2014), es relevante destacar la inclusión de Kanva 2, igual que en el presente estudio; según sus hallazgos, estaría agrupada con los cultivares y variedades desarrolladas en el sur de la India. Al respecto, Guruprasad (2011) indica que las variedades desarrolladas en la India en la década de los 70 y principios de los 80, procedían de un estrecho acervo genético de los cultivares Mysore Local, Kousen (variedad japonesa), Kanva-2 (cultivar tradicional) y Sujanpur-5.

Figura 3.
Análisis de agrupamiento y estructura genética. a) Dendrograma demostrando las relaciones genéticas entre 36 accesiones de la colección de Morus spp. con ocho loci SSR, empleando el método Neighbor-joining, las ramas presentan colores para diferenciar las tres agrupaciones identificadas. b) Estructura genética de las 36 accesiones de Morus spp. basado en ocho loci SSR generados por el programa Structure utilizando los modelos de mezcla y frecuencias alélicas correlacionadas. Los tres grupos poblacionales identificados (K) están representadas por colores distintos, que coinciden con las agrupaciones y orden descendente del dendrograma. Cada fila representa una accesión que puede fraccionarse en segmentos, cuyo tamaño es proporcional al porcentaje o valor de pertenencia estimado de cada accesión a cada uno de los tres grupos poblacionales (Q1, Q2 y Q3).
autores.

Figura 4.
Análisis de coordenadas principales (PCoA) de las 36 accesiones de la colección de Morus spp. La gráfica fue realizada a partir de la distancia genotípica implementada en GenAlEx v. 6.5 (Peakall y Smouse, 2012). Las accesiones están identificadas con un símbolo y color distintos, que coinciden con las agrupaciones observadas en el análisis de agrupamiento y estructura genética. Entre paréntesis se indica el porcentaje de la variabilidad (Var) de cada Eje de coordenadas.
autores.

El AMOVA (Tabla 4) indica que el 78% de la variación genética se presenta dentro de los individuos con un Fit (0,167) significativo; mientras que, el 22% de la variación se encuentra entre grupos poblacionales, con un coeficiente Fst (0,203) significativo (Tabla 5), resultados que sugieren un origen común, es decir, podrían derivarse de una o pocas variedades que se han sometido a procesos de domesticación temprana, como programas de selección artificial que les lleva a perder su diversidad genética (García et al., 2020; Rauf et al., 2010); no obstante, factores como el modo de cultivo, el flujo genético por agentes polinizadores o el intercambio de material podrían contribuir a la diferenciación genética (Chacón et al., 2016). También se destaca el sistema de reproducción, puesto que la morera es polinizada principalmente por el viento, siendo mayoritaria la polinización cruzada (Wangari et al., 2013; Datta et al., 2002), dando como resultado, materiales o cultivares híbridos con alta heterocigosidad a nivel de sus loci (Krishnan et al., 2014), que se mantendría estable en el tiempo debido a la propagación vegetativa. Resultados similares fueron reportados por Krishnan et al. (2014) del 83% y 17% respectivamente, aunque la variación entre poblaciones en el presente estudio fue ligeramente superior, posiblemente, por la presencia de los duplicados, que disminuyeron la variación entre individuos a cero, aumentando en proporción las otras fuentes de variación.

Tabla 4.

AMOVA-Fst entre las 36 accesiones de Morus spp. Los materiales fueron organizados en los tres grupos poblacionales identificados en el análisis de agrupamiento y estructura genética

autores. gl: grados de libertad, SC: suma de cuadrados, CM: cuadrados medios, Est. Var: varianza estimada.

Tabla 5.

Significancia estadística del AMOVA-Fst mediante índices F

autores. Significancia estadística establecida con 1000 permutaciones aleatorias.

4. CONCLUSIONES

Los resultados sugieren que los marcadores fueron polimórficos, insesgados e informativos sobre la diversidad, la estructura y las relaciones genéticas de las accesiones. Particularmente, destacan seis microsatélites altamente informativos (PIC>0,5). Los análisis indicarían la posible presencia de duplicados, dada la obtención de 19 accesiones diferentes en un total de 36 evaluadas. Por lo tanto, es necesario contrastar los resultados con una caracterización morfológica y productiva para identificar un comportamiento biológico o productivo de interés y determinar si deben eliminarse o conservarse como líneas o clones. También, se recomienda la introducción de nuevos genotipos para aumentar la variabilidad. El análisis de agrupamiento y estructura reveló que las 36 accesiones conforman tres grupos poblacionales discretos con diferenciación genética y aparentemente bajo flujo genético. Lo que sugiere presencia de materiales genéticamente contrastantes que podrían utilizarse en futuras evaluaciones para el desarrollo de programas de selección y generación de cultivares élite, que beneficien, tanto la actividad serícola como otras áreas agropecuarias que requieran fuentes de alimentación de alta calidad nutricional.

Agradecimientos

A la Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad del Cauca por la financiación del proyecto ID4972; al laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira por su apoyo técnico en el desarrollo de la investigación; al grupo de investigación SISINPRO por la asesoría y el apoyo científico; al Proyecto de Sericultura Caucana por permitir realizar los muestreos del material vegetal que con forman la colección de morera.

LITERATURA CITADA

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Información adicional

CÓMO CITAR: Trochez, J., Paz, I., Almanza, M. y Ruiz, X. (2023). Caracterización y análisis de la variabilidad genética de accesiones de morera (Morus spp.) empleando marcadores microsatélites. Revista de Investigación Agraria y Ambiental 15(1), 49 - 70. https://doi.org/10.22490/21456453.6555

CONTRIBUCIÓN DE LA AUTORÍA: Julián Trochez: metodología, investigación, análisis de datos, conceptualización, escritura, revisión y borrador original. Iván Paz: análisis de datos, revisión y edición. Martha Almanza: análisis de datos, revisión y edición. Ximena Ruiz: análisis de datos, escritura, revisión y edición.

CONFLICTO DE INTERESES: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Enlace alternativo

https://hemeroteca.unad.edu.co/index.php/riaa/article/view/6555 (html)

https://hemeroteca.unad.edu.co/index.php/riaa/article/view/6555/6479 (pdf)