INTRODUCCIÓN

Colombia es un país diverso en cultura, fauna y flora; en particular, tiene una gran diversidad de orquídeas nativas. Se estima que existen alrededor de 9.000 especies entre los bosques húmedos de Colombia y Ecuador; sin embargo, se reportan aproximadamente 3.000 especies en peligro de extinción (Pérez, Sánchez & Ortiz, 2009). En Colombia, las orquídeas ocupan el deshonroso primer lugar como la familia de plantas con el mayor número de especies amenazadas (Cal­derón-Sáenz, 2007). Las especies de los bosques nu­blados del país tienen doble riesgo debido a sus nive­les altos de endemismo y a las tasas elevadas de con­versión de sus ecosistemas para actividades como la agricultura y la ganadería; además, se prevé que esta situación se agravará como consecuencia del calenta­miento global (Jarvis, 2009).

Prosthechea sp. es una orquídea muy apetecida entre las personas por el color y forma de sus flores, lo cual ha afectado su población debido a la colecta ilegal e indiscriminada y a la paulatina deforestación por parte de los habitantes de las zonas rurales del municipio de Fusagasugá (departamento de Cundinamarca, Colombia). Ante esta situación, es necesario establecer un programa de conservación de orquídeas. En el caso del género Prosthechea, sería pertinente usar la propagación in vitro, teniendo en cuenta que es importante conocer las diferentes concentraciones ade­cuadas de reguladores de crecimiento para producir más plántulas en el menor tiempo posible y disminuir los costos de producción.

Entre las medidas que se han implementado para contrarrestar esta problemática y velar por la conservación de las orquídeas, se encuentran los programas de propagación artificial de especies en peligro de extinción (Arditti & Ernst, 1993). Por lo tanto, la tecnología de cultivos de tejidos vegetales ofrece una alternativa adecuada para facilitar los trabajos de multiplicación a gran escala y suplir los requerimientos necesarios para los planes de conservación (Gil, Contreras, & Gutiérrez, 2016).

Knudson (1922) descubrió que las semillas podían ser germinadas en un medio simple con azúcar, lo que revolucionó la propagación y el cultivo de orquídeas. Su trabajo demostró que la germinación de semillas de orquídeas en condiciones in vitro era posible sin la asociación con hongos. Posteriormente, propuso una nueva solución con la adición de nutrientes para la germinación de semillas de orquídeas en 1946 (Martin, 2003). Las aplicaciones del cultivo in vitro de orquídeas son muchas: propagación masiva de plantas –especialmente de difícil propagación o en vías de extinción–, clonación de individuos de característi­cas agronómicas muy deseables durante todo el año, obtención de plantas libres de virus, conservación de germoplasmas, producción de nuevos híbridos, mejo­ra genética de plantas y germinación de semillas (So­to-Arenas, Solano-Gómez, & Hágsater, 2007).

Los reguladores de crecimiento vegetal se emplean para promover la división y diferenciación celular. En este sentido, dentro del cultivo in vitro de orquídeas los más utilizados son la citoquinina bencilaminopurina (bap) y la auxina ácido naftalenacético (ana). Su uso específico en las etapas de germinación y desarrollo de las semillas en medio in vitro permite aumentar la tasa de germinación y reducir el tiempo de desarrollo de los protocormos, cualidades necesarias para un eficiente método de propagación a gran escala (Rodrigues, Gomes, Pasqual, Almendagna, & De Assis, 2009). Además, el uso adecuado de nutrientes complejos favorece un mayor crecimiento y desarrollo de algunas especies de orquídeas (Kitsaki, Zygouraki, Ziobora, & Kintzios, 2004; Yam & Arditti, 2009; Yong, Ge, Ng & Tan, 2009).

El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la citoquinina bap, la auxina ana y el almidón sobre la germinación de las semillas de la orquídea Prosthechea sp., con el fin de ayudar a mitigar la disminución de las poblaciones silvestres de dicha especie.

PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

A nivel mundial, las orquídeas son conocidas como las flores más raras del reino vegetal debido a su complejidad morfológica y a la taxonomía de cada especie. Esto resulta en su admiración y fascinación, lo que ocasiona su sobrexplotación, afectando la conservación y preservación de estas plantas, ya que se convierte en un negocio muy lucrativo para los recolectores por su valor comercial. La propagación de la familia Orquida-ceae es muy compleja y limitada porque posee semillas diminutas con un embrión simple carente de endospermo, lo cual dificulta su germinación ex vitro. Esto impide su comercialización a gran escala, por lo que se extrae abruptamente del hábitat de desarrollo, generando así un desequilibrio en el ecosistema (De la Nova, Oria, Casadesus, & Gómez, 1998).

Solamente del 2 al 5 % de las semillas de orquídeas germinan de forma natural (Rao, 1997) y, si lo hacen, se toman un largo tiempo. Además, cualquier distur­bio en el hábitat o ambiente físico puede destruir la totalidad de la población (Pant & Thapa, 2012). Las orquídeas se caracterizan por tener semillas muy pequeñas y numerosas, comúnmente llamadas semillas polvo, de considerable variación, que poseen una escasa reserva de nutrientes para germinar. El número de semillas puede variar de 13.000 a 4.000.000 por cápsula. Una semilla de orquídea mide de 0,25 a 1,2 mm de largo y de 0,009 a 0,27 mm de ancho, y su rango de peso varía de 0,3 a 14 µg (Arditti & Ghani, 2000). Estas semillas están formadas por un embrión de pocas células (entre 100 y 200) cubiertas por una testa muy dura (Mitchell, 1989).

En condiciones naturales, las semillas requieren la presencia e infección de un hongo simbionte que les proporcione una fuente de carbohidratos y los nu­trientes necesarios para el proceso de germinación (Barba, Luna & Romero, 2001). Este hongo ayuda a las plántulas jóvenes de orquídeas a sobrevivir en campo con reservas alimenticias limitadas y actúa a manera de endospermo exógeno, puesto que aporta los nu­trientes necesarios en los primeros estadios de la ger­minación (Rasmussen, 1995).

La interacción micorriza-orquídea es un tema que ha sido ampliamente estudiado a nivel mundial (Cle­ments, 1987). Diversos estudios han demostrado que, en general, las orquídeas epífitas son específi­cas en la interacción con las micorrizas (Lee, Taylor y Bruns, 1997) y que su especificidad, especialmente en las especies tropicales, puede ser variable (Otero & Bayman, 2009).

La germinación de las semillas de Prosthechea sp. es variable en el tiempo, iniciando con la imbibición y posterior protrusión radicular. Posteriormente se for­ma una esfera de células fotosintéticamente activas denominadas protocormo, que permitirá el desarro­llo de pelos radicales y la aparición de hojas (Roy, Pa­tel, Patel, Sajeev, & Deka, 2011). Los tiempos estima­dos para cada fase de desarrollo de las orquídeas bajo condiciones in vitro son inciertos, porque varían de acuerdo con el medio de cultivo, la especie y las condiciones ambientales (Pierik, 1990).

Según Pierik (1990), la germinación de las semillas de orquídea inicia cuando el embrión absorbe agua a través de la testa, aumentando su volumen. Des­pués, empieza la división celular y el embrión rom­pe la cubierta seminal. A continuación, se forma una estructura de tipo protocormo a partir del agrega­do de células, y sobre aquel puede distinguirse un meristemo del vástago. Tan pronto como inicia la diferenciación de órganos (meristemo del vástago en un lado y rizoides en el otro), comienza un periodo de crecimiento intenso. Si el protocormo está a la luz, adquiere un color verde y, al mismo tiempo, se desa­rrollan las hojas. Como resultado de la producción de clorofila, la planta se vuelve autótrofa. Más tarde, las primeras raíces auténticas se forman endógenamen­te, el protocormo y los rizoides (pelos radicales) pier­den su función nutritiva y desaparecen. Los tiempos estimados para cada fase bajo condiciones in vitro son inciertos porque varían de acuerdo con el medio de cultivo, la especie y las condiciones ambientales.

Las orquídeas fueron las primeras plantas que se pro­pagaron in vitro a partir de la siembra de semillas, de manera simbiótica y asimbiótica o clonalmente al in­troducirse la técnica de cultivo de meristemos para la propagación vegetativa. Dada la importancia hortíco­la y comercial de las orquídeas, se han desarrollado diversos métodos de propagación, tanto sexual, a tra­vés de semillas, como asexual, mediante el cultivo de segmentos vegetativos (Ávila-Díaz, & Salgado, 2006). Para que la germinación se lleve a cabo se deben cum­plir tres condiciones: primero, la semilla debe ser via­ble; segundo, la semilla debe estar bajo condiciones ambientales adecuadas; y tercero, se debe superar cualquier condición de dormancia, causada por regu­ladores de crecimiento que inhiben la germinación, o contar con embriones inmaduros (Pedroza-Manrique, Fernandez-Lizarazo, & Suarez-Silva, 2005).

La propagación natural de las orquídeas se dificulta porque sus semillas son diminutas y carecen de en­dospermo. Por esta razón, requieren de la interacción con hongos micorrízicos que permiten la germinación de las semillas (Arditti, 1984). Experimentos desarro­llados por Knudson (1922) en especies de Cattleya, llevaron a afirmar que las semillas pueden germinar sin la acción del hongo, utilizando azúcares simples y nutrientes en el medio de cultivo. Se han desarrollado metodologías de germinación asimbiótica bajo con­diciones in vitro (Arditti & Ernst, 1993; Steele, 2007). La germinación de semillas de orquídeas de manera asimbiótica permite conservarlas de manera senci­lla mediante diversos métodos de micropropagación (Shimasaki & Uemoto, 1991). Una de las cuestiones básicas de la siembra asimbiótica es la desinfección adecuada de frutos y semillas para lograr cultivos li­bres de contaminación (Billard, Dalzotto, & Lallana, 2014). Una de las cuestiones básicas en la siembra asimbiótica es la desinfección adecuada de frutos y semillas para lograr cultivos libres de contaminación (Billard, Dalzotto & Lallana, 2014).

En el cultivo de orquídeas es muy común la utilización del medio nutritivo Murashige y Skoog (ms), formula­do por los científicos Toshio Murashige y Folke Skoog en 1962. Este medio de cultivo proporciona a las semi­llas los 17 nutrientes esenciales –tanto micronutrientes como macronutrientes– para la mayoría de las plantas, a fin de desplazar el papel del hongo en la simbiosis (Roca, Nolt, Mafla, Roa, & Reyes, 1991; Taiz & Zeiger, 1998). Por esta razón se eligió el medio Murashige y Skoog (1962), ya que contiene una formulación básica que sirve de fuente de nutrientes a una gran variedad de plantas (Hurtado & Merino, 1987; Pierik, 1990).

En el crecimiento de los tejidos existe un efecto indi­recto entre el pH y el tipo de fuente de nitrógeno, pues los medios con un pH por debajo de 5 toman nitratos, y en aquellos con un pH de 5 a 5,5 los callos prefieren amonio o nitratos. Por otro lado, el potasio es necesario para la división celular, la síntesis de proteínas, la producción de clorofila y la reducción de nitratos. Los niveles de K⁺in vitro difícilmente representan un pro­blema, pero hay ciertas especies que son sensibles a sus altos niveles (Bhojwani & Razdan, 1996).

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

En la reserva natural de San Rafael (Fusagasugá, Cun­dinamarca), ubicada a 4º23´32” LN (latitud norte) y 74º18´48” LW (longitud oeste), a una altitud de 1.909 m s. n. m., con temperatura media de 17 ºC, hume­dad relativa media de 85 % y precipitación anual de 1.250 mm, se situó una población de plantas del gé­nero Prosthechea sobre forofitos de caucho (Ficus sp.). De esta población se obtuvieron 8 cápsulas con una madurez avanzada y un diámetro entre 2 y 3 cm (figura 1).

Protocolo de esterilización

Las cápsulas se llevaron al laboratorio de cultivo de teji­dos vegetales de la Universidad de Cundinamarca para su procesamiento en condiciones asépticas. Estas se la­varon superficialmente con abundante agua corriente y jabón antibacterial (Protex ®). Después, en la cámara de flujo laminar horizontal (Flow 85 H ®), se sumergie­ron las cápsulas durante 10 minutos en una solución de hipoclorito de sodio al 5 %, se lavaron dos veces con agua destilada estéril y luego se colocaron en inmer­sión en alcohol al 70 % por 1 minuto. Posteriormente, se escurrieron sobre servilletas estériles y, finalmente, se flamearon con el mechero Bunsen. Para extraer la semilla, se hizo un corte longitudinal en la cápsula con la ayuda de unas pinzas y un bisturí previamente esteri­lizados. La semilla de tipo polvoso fue esparcida sobre la superficie de medio de cultivo ms en frascos de vi­drio (dimensiones) con un volumen de 250 mL.

Metodología

Se utilizó el medio salino básico ms desarrollado por Murashige y Skoog, suplementado con diferen­tes concentraciones de almidón –fécula de maíz– (0, 10 g×L^-1), bap (0, 0,5, 1 y 2 mg×L^-1) y ana (0, 0,5, 1 y 2 mg×L^-1) según un diseño al azar–dca– con un arre­glo factorial de 2×4×4, con 32 tratamientos y 5 repeticiones (tabla 1). La unidad experimental correspondió a cada frasco de vidrio de 250 mL, con el fin de eva­luar su efecto sobre la germinación. El cultivo se reali­zó bajo condiciones in vitro durante 12 semanas bajo un régimen lumínico de 12 horas de luz–luz blanca fría– y 12 horas de oscuridad, con una temperatura promedio de 25 °C.

Cada 7 días se observaron tres unidades experimen­tales con el estereoscopio; en cada una se evaluó la mitad del área de la base del frasco y se examinó el número de semillas germinadas como variable para luego proceder a llevarlas a porcentaje de germina­ción, de acuerdo con la fórmula:

% germinación = número de semillas germinadas/nú­mero total de semillas evaluadas

Los datos obtenidos se sometieron a un análisis de va­rianza (anova) y a la prueba de Fisher lsd (P ≤ 0,05 ), utilizando el programa Info Stat –versión libre–.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La fase de germinación se evaluó desde la primera se­mana después de la siembra de las semillas de Pros­thechea sp. hasta la séptima semana, calculando el porcentaje de germinación de semillas de acuerdo con las observaciones del material vegetal en el laboratorio (figura 2).

En el tratamiento 22, con el medio enriquecido con almidón (10 g×L-1)+bap (2 mg×L^-1)+ana (0,5 mg×L^{- 1}), y el tratamiento 30, con el medio suplementado con almidón (10 g×L^-1) +bap (2 mg×L^-1)+ana (2 mg×L^{- 1}), se obtuvieron los mayores valores de porcenta­je de germinación: 52,67 y 50,67%, respectivamen­te (figura 3); estos tratamientos estaban suplemen­tados adicionalmente con almidón como fuente de carbono. Por otro lado, la germinación más baja se evidenció en los tratamientos con ausencia de este componente, como los tratamientos 8, 1 y 12, cuyos porcentajes de germinación de semillas fueron: 8, 7 y 5 %, respectivamente.

El medio ms se utiliza con frecuencia en diversas es­pecies de orquídeas y, al suplementarse con distintas concentraciones de reguladores de crecimiento como bap y ana en interacción con almidón, presenta efec­tos favorables sobre la germinación de las semillas. En este sentido, Arditti y Ernst (1993) concluyen que los porcentajes de germinación alcanzados en orquí­deas epífitas tropicales sobre un medio asimbiótico son superiores a 50 %; mientras que Kalimuthu, Sen­thilkumar y Vijayakumar (2007) describen una rege­neración in vitro satisfactoria de Oncidium sp. al adi­cionar 2 mg×L^-1 de bap al medio ms. También se han obtenido resultados favorables con otros medios de cultivo enriquecidos con reguladores de crecimiento, lo cual se evidencia en estudios como el de Hossain, Sharma, Teixeira da Silva y Pathak (2010), donde obtu­vieron aproximadamente un 100 % de germinación de las semillas de orquídea Cymbidium giganteum Wall. ex Lindl con los medios Mitra y Phytamax suplemen­tados con 1 mg×L^-1 de bap.

Algunos autores han reportado que el uso de ácido naftalenacético (ana) sobre la germinación de or­quídeas no es favorable, porque este se utiliza para estimular la formación de raíces adventicias (Derkx & Karssen, 1993; Hilhorst & Karssen, 1989; Ikuma & Thimann, 1963; Perry & Metzger, 1980; Yang et al., 1999); por lo tanto, es posible que no afecte la germi­nación de Prosthechea sp. Para este caso, cabe citar el estudio realizado por Paudel, Pradhan y Pant (2012) con semillas de la orquídea Esmeralda clarkei Rchb.f., donde obtuvieron una mayor germinación al enrique­cer el medio básico ms con 0.5 mg×L-1 de bap y sin la adición de ana.

Los resultados obtenidos en esta investigación coinci­den con los de Parmar y Pant (2016), quienes en estu­dios desarrollados con la orquídea Coelogyne stricta (D. Don) Schltr. encontraron que al adicionar 1 mg×L^-1 de bap y 1 mg×L^-1 de ana al medio básico ms, la germi­nación de semillas incrementó, inició a las 7 semanas de cultivo y se formaron plántulas después de 23 se­manas de cultivo, de manera que ambos fitorregula­dores indujeron la formación de raíces. En otro estu­dio con la orquídea Coelogyne flaccida Lindl., Parmar y Pant (2015) encontraron que al suplementar el me­dio ms con 0.5 mg×L^-1 de bap y 0.5 mg×L^-1 de ana, la germinación inició 6 semanas después de la siembra en el medio.

Estos resultados también concuerdan con los que obtuvieron Bazand, Otroshy, Fazilati, Piri y Mokhta­ri (2014) con la orquídea Phalaenopsis amabilis (L.) Blume, donde el mayor porcentaje de germinación (83,75 %) se presentó al adicionar una concentra­ción de 1,5 mg×L^-1 de ana o una combinación de bap (0,5 mg×L^-1)+ana (0,5 mg×L^-1) al medio básico ms, así como con los que obtuvieron Seeja, Sreekumar, Biju y Arya (2018), quienes encontraron que la germinación de semillas de Spathoglottis albida Kraenzl. fue ma­yor (93 %) al utilizar el medio ms enriquecido con 1,5 mg×L^-1 de bap y 0,5 mg×L^-1 de ana.

Por último, tras observar que la ausencia de almidón no favoreció la germinación de semillas de Prosthe­chea sp. bajo condiciones in vitro, se puede afirmar que su uso genera un mayor porcentaje de germina­ción por cuanto la fécula de maíz aporta vitaminas a la semilla además de glutamina, un aminoácido esencial para el crecimiento de embriones inmaduros por ser una importante fuente de nitrógeno (Pierik, 1990), que probablemente supla los requerimientos de car­bohidratos externos necesarios para la germinación de las semillas de orquídeas.

CONCLUSIÓN

El medio de cultivo Murashige y Skoog (ms) su­plementado con 10 g×L^-1 de almidón favorece una mayor germinación de las semillas de la orquídea Pros­thechea sp., de igual manera, el uso de 2 mg×L^-1 de bencilaminopurina (bap) y 0,5 mg×L^-1 de ácido nafta­lenacético (ana) potencia su germinación, por lo tan­to, se recomienda su uso combinado en esta especie vegetal.

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