INTRODUCCIÓN

El desarrollo económico de Panamá ha permitido mejorar la esperanza de vida de la población (Figura 1). Esto a su vez a permitido que se manifiesten algunas enfermedades propias de los países más desarrollados como por ejemplo enfermedades crónicas (Figura 2). Un ejemplo es la osteoporosis. Contraloría General De La República, 2010; Gittens, RA, 2017.

Figura 1
Pirámide de la población del país, por sexo y grupos de edad para los años 1950, 2015 y 2050. Contraloría General de la República. (2010).
Contraloría General de la República

Figura 2
Tasa de mortalidad general en Panamá

Las diez primeras causas. 2010 y 2016. Ministerio de Salud.

Datos de DIPLAN - MINSA

La osteoporosis es una enfermedad musculo esquelética caracterizada por la baja densidad de los huesos y causa un incremento del riesgo de deterioro de su estructura aumentado la posibilidad de fracturas (Figura 3). En Panamá se cuenta con poca información epidemiológica sobre la osteoporosis. Zanchetta (2012).

Los componentes estructurales del hueso son los osteoblastos, osteoclastos y osteocitos (Figura 4). Los osteoblastos ayudan a la formación y mineralización del hueso. Los osteoclastos ayudan a la re-absorción de los minerales del hueso. Los osteocitos son osteoblastos maduros y son formados a partir de éstos, Redlich, Smole (2012)

Figura 3.
Diferencias estructurales
Gittens et al. 2012.

Figura 4.
Componentes estructurales del hueso.
Redlich et al. 2012.

El titanio es un metal que tiene una relación favorable entre peso, fuerza y buen rendimiento biológico en huesos en cuanto a su rugosidad y química (Figura 5).

Figura 5
Propiedades del titanio que lo llevan a ser bio-compatibles para los implantes.
Gittens (2012)

En algunos estudios se ha comprobado que existen células como las células MG63 (osteoblastos inmaduros) (Figura 6) que responden a nano-estructuras en micro-rugosidades de titanio (Ti) indicando que las células inmaduras tienen la propiedad de diferenciarse a células óseas en los implantes de titanio que contienen esta combinación jerárquica de rugosidad Gittens (2012)(Figura 7).

Para crear estas nano estructuras existen diferentes métodos: a) acidificación (acid etching), b) chorreado abrasivo (grit blasting) y c) tratamiento de calor. (Figura 8).

Figura 6

Las células MG63 provienen del osteo-sarcoma humano. Expresan características fenotípicas similares a los osteoblastos inmaduros. Responden a nano-estructuras en la superficie de Ti.

Figura 7
Interacciones entre hueso y la superficie del implante a diferentes escalas.
Gittens et al. 2012

Figura 8
Esquema de métodos y resultados (con imágenes SEM) en superficies de titanio en estudios como los Gittens et al. 2012.

Las modificaciones incluyen proceso de acidificación (acid etching), chorreado abrasivo (grit blasting) y tratamiento de calor. En nuestro estudio se realizó el proceso de acidificación.

PARTE EXPERIMENTAL

Filtración de partículas de titanio

- Suspender partículas en agua y pasar por filtro para separar partículas grandes (> 40 µm) de las más pequeñas (< 40 µm). (Figura 9).

Figura 9
Filtración de las partículas/microtransportadores de titanio.

Nano modificación de partículas con ácidos

- Pre-lavado (tratamiento con el sonicador) de muestras. Este tratamiento es para separar las partículas entre sí y que sea más fácil filtrarlas más adelante. (Figura 10).

- Tratamiento ácido a diferentes temperaturas para crear nano estructuras (Figura 11). Se escogieron los ácidos oxálico y fórmico. (Figura 12).

Figura 10
Sonicador

Figura 11
Plato caliente para hacer el tratamiento térmico en las partículas

Figura 12
Ácidos utilizados para modificar la superficie de las partículas.

Muestras:

1. Partículas de Titanio sin tratamiento

2. Partículas de Titanio + 10% ácido fórmico y oxálico por 45 min

3. Partículas de Titanio + 10% ácido fórmico y oxálico por 90 min

4. Partículas de Titanio + 20% ácido fórmico y oxálico por 45 min

5. Partículas de Titanio + 20% ácido fórmico y oxálico por 90 min

Protocolo:

 Sonicar muestras por 30 minutos en Liquinox soap (Alconox)

 Sonicar muestras (2 x) 5 minutos en agua destilada a 25°C.

 Sumergir las partículas en NaOH (20 g/L) y peróxido de hidrógeno (20 g/L) a 80°C por 30 minutos.

 Sonicar muestras por 5 minutos en agua destilada a 25°C.

 Sumergir las partículas en 65% ácido nítrico líquido a 100 ◦C por 30 min.

 Sonicar muestras por 5 minutos en agua destilada a 25°C.

 Dejar las muestras secando al menos 24 horas para asegurar la estabilidad de la capa de óxido.

 El bañando en ácido es realizado en diferentes concentraciones y por diferentes tiempos a 80°C:

o Ácido Fórmico y Ácido oxálico a un rango de 50% cada una por 45 minutes a concentraciones de 10% y 20% w/v.

o Ácido Fórmico y Ácido oxálico a un rango de 50% cada una por 90 minutes a concentraciones de 10% y 20% w/v.

 Sonicar muestras por 5 minutos en agua destilada a 25°C.

 Sumergir las partículas en 65% ácido nítrico líquido a 100 ◦C por 30 min.

 Sonicar muestras por 5 minutos en agua destilada a 25°C.

 Dejar las muestras secando al menos 24 horas para asegurar la estabilidad de la capa de óxido.

Repetimos este experimento esta vez con los tiempos cambiados en la etapa de la aplicación de los ácidos oxálicos y fórmico: 75 y 120 minutos.

Observación y medición de partículas de titanio

- Microscopio Electrónico Evo 40 (STRI, Panama)(Figura 13).

- Fiji (ImageJ) para análisis de imágenes. (Figura 14).

Figura 13
Fiji (ImageJ) para análisis de imágenes.

Figura 14
Menú del programa Image J.

Estadísticas

- Histograma de tamaño de partículas:

Utilizando el programa Image J (figura 14) nosotros pudimos medir el diámetro de las partículas de titanio. (Figura 15).

Gracias a estas mediciones pudimos crear un histograma del tamaño de las partículas (Figura 16) con lo cuál pudimos determinar si tenían el tamaño adecuado para el experimento.

Figura 15
Utilización del programa Image J para medir los diámetros de las partículas.

Figura 16
Histograma de diámetros de partículas.

Toda la parte experimental se realizó en el laboratorio CREA de INDICASAT AIP.

Solamente la parte de la observación de las imágenes en el microscopio electrónico (SEM) fue realizado en el departamento de microscopía del Instituto Smithsonian.

El experimento duró 6 meses, de julio a diciembre de 2018.

RESULTADOS

Caracterización del tamaño de las partículas de Titanio

Las partículas fueron filtradas con filtros de membranas de nylon de 40 micrómetros. Como se puede observar en el histograma, la mayor cantidad de partículas se encuentran en el rango entre 7.28 y 48.28 micrómetros de diámetro. Partículas de diámetros mayores de 130 micrómetros virtualmente fueron inexistentes. La presencia de partículas de menos de 40 micrómetros se puede deber a partículas pequeñas adheridas a otras mucho más grandes y por ello no pasaron el filtro. (Figuras 17 y 18)

Figuras 17 y 18
Partículas de titanio no modificadas, pero si filtradas con filtros de membrana de nylon.

Figuras 17 y 18
Partículas de titanio no modificadas, pero si filtradas con filtros de membrana de nylon.

Caracterización de la composición química de las partículas de titanio 99.9% puras

Utilizando la tecnología del microscopio electrónico de barrido pudimos determinar el porcentaje de pureza de las partículas filtradas y nanomodificadas. (Figura 19, 20, 21 y 22).

Figura 19
Muestra 1: Ácido fórmico y Ácido oxálico al 10%, 75 minutos

Figura 20.
Muestra 2: Ácido fórmico y Ácido oxálico al 20%, 120 minutos

Figura 21.
Muestra 3: Ácido fórmico y ácido oxálico al 10%, 75 minutos

Figura 22.
Muestra 4: Ácido fórmico y ácido oxálico al 20%, 120 minutos

El paso siguiente es el de demostrar si es posible crear nanomodificaciones a las partículas de titanio con semejante pureza.

Nanomodificación de partículas de Titanio 99.9% puras

Los resultados sugieren que es posible modificar la superficie de las partículas de titanio a base de calor y de ácidos (nítrico, fórmico y oxálico).

Cierto tipo de marcas o surcos fueron halladas en las partículas con los ácidos al 10% por 90 minutos (figura 23, 24) que no fueron halladas en partículas con otros tiempos y concentraciones de ácidos sugiriendo que quizá la nanomodificación trabaja mejor en concentraciones más bajas (10%) que en concentraciones más altas de ácidos (20%).

Figura 23
Partículas de titanio nanomodificadas a base de ácido fórmico y ácido oxálico al (A) 10% por 45 minutos, (B) 10% por 90 minutos (C) 20% por 45 minutos y (D) 20% por 90 minutos.

Figura 24
Partículas de titanio nanomodificadas a base de ácido fórmico y ácido oxálico al A) 10% por 75 minutos, (B) 10% por 120 minutos, (C) 20% por 75 minutos y (D) 20% por 120 minutos.

DISCUSIÓN

La microscopía electrónica, específicamente la microscopía electrónica de barrido, SEM, es una herramienta muy útil para caracterizar diferentes tipos de muestras, incluyendo las micro y nanomodificaciones en microtransportadores de titanio destinados a la medicina regenerativa

Investigando la literatura se ha podido evidenciar que el SEM es útil para observar tanto superficies de discos de titanio, superficies de discos de aleaciones de Titanio-Aluminio-Vanadio (Ti6Al4V) y partículas de Titanio-Aluminio-Vanadio (Ti90Al6V4). En este estudio se ha podido evidenciar que el SEM también funciona para partículas de Titanio 99.9% puras (Figuras 8 y 9).

También ha sido muy útil a la hora de dilucidar la composición química tanto de las partículas de Ti90Al6V4 como las de titanio 99.9% gracias a la espectrometría de rayos x por energía dispersiva (EDX) para determinar la composición atómica cercana a la superficie. (Figuras 4, 5, 6, 7).

Salvo en estudios mencionados en la sección Antecedentes, como los de Gittens, donde el titanio es utilizado en discos como superficies donde son sembrados las células madres, prácticamente en ningún otro estudio se utiliza ácidos con el objetivo de nanomodificar partículas de titanio. (tabla 1).

Tabla 1


NOTA Incremento:↑, Disminución:↓

	Uso de técnica de microscopía	Características de las partículas	Ácidos utilizados	Concentra-ción de los ácidos	tiempo	Reacción entre Células y partículas
Wang et al., 2002	SEM	Titanio comercialmente puro (cp Ti) < 1 µm ZrO2 < 1 µm	Ácido nítrico para asepsia	Ácido nítrico 25% a 70° C.	1 hora	-↓Células viables -↓BSP -CpTi tiene toxicidad para hMSC (human mesenquimal stem cells)
Jiang Wu et al., 2011	No mencionado	Partículas de Ti 0.9µm, 2.7µm, 6.9µm.	No utilizados	No aplica	No aplica	↓marcadores iniciales, medios y finales del linaje osteogénico
Lee et al, 2011	Observación de células teñidas	Diámetro < 10 µm	No utilizados	No aplica	No aplica	Ti provoca que macrófagos y SOSTs supriman formación de hueso.
Hou et al., 2013	MET para caracterizar partículas	TiO2 Sintetizados hidrotermal-mente	No utilizados	No aplica	No aplica	TiO2: ↓viabilidad celular ↓proliferación ↓ciclo de vida de MSC
Jiang et al.,2013	SEM	Ti-6Al-4V 0.6 µm	No utilizados para nanomodificar	No aplica	No aplica	TiO2: ↓crecimiento ↓maduración ↓ciclo de vida de osteoblastos
Ping et al.,2017	No mencionado	95% fueron < de 4μm	No utilizados para nanomodificar	No aplica	No aplica	Ti produce osteólisis ↑osteoclastos
Gu et al.,2017	Para ver células teñidas de solución ARS	No mencionan dimensiones de las partículas	No utilizados para nanomodifica	No aplica	No aplica	Ti produce inhibición osteogénica. Ti induce perdida de huesos via regulación de señales de GSK-3β y β-catenin. ↓GSK-3β la inhibición de la diferenciación osteogénica producida por Ti
Zhu et al.,2018	Microscopio invertido para ver el crecimiento y la morfología de las células osteoblásticas de ratones MC3T3-E1.	Las partículas de titanio ≤5 µm, 0.1 wt%	No utilizados para nanomodificar	No aplica	No aplica	Inhibición de MSCs, BSP, proliferación celular, mineralización de la matriz, producción de colágeno tipo I.

Prácticamente en todos los artículos el titanio era visto como un debris (tabla 1), incluso en artículos más recientes, dando fe del carácter innovador de nuestra investigación al querer utilizar las partículas de titanio como superficies no planas y por lo tanto, más bio compatibles con las formas del hueso, para el crecimiento de células osteoblásticas.

El tamaño de las partículas fue tomado en cuenta en varios artículos aquí analizados, la mayoría decía que partículas menores o similares al micrón eran las más peligrosas, mientas que otros estudios mencionaban lo citotóxicas de partículas mucho más grandes que el micrón. Nosotros deberemos comprobar si el tamaño de aproximadamente 40μm es adecuado para nuestros objetivos al utilizar células madres en futuros estudios.

Observando en artículos de otros investigadores hay moléculas que estimulan la osteo-diferenciación como la icariin o la aucubina, algunas veces estimulando las vías de señalización. Esta información debe tomarse en cuenta para etapas futuras de investigación en caso de que al utilizar partículas de titanio, las células madres se diferencien células óseas.

CONCLUSIÓN

1-Es necesario pre-tratar las micropartículas de titanio para eliminar los residuos de partículas que están por debajo del diámetro de 45 μm, ya que éstas pueden ser internalizadas por las células y esto pudiera comprometer su comportamiento y viabilidad.

2-Los parámetros del tratamiento de nanomodificación deben ser optimizados para obtener mayor nano-estructuración de la superficie.

3-El Microscopio electrónico de barrido es útil para la caracterización de posibles modificaciones en partículas de titanio.

4-El Microscopio electrónico de barrido es útil para la caracterización del porcentaje de pureza química de las partículas de titanio.

5-Las imágenes obtenidas por microscopía electrónica (figuras 8 y 9) sugieren que los ácidos nítrico, fórmicos y oxálico pueden crear modificaciones en superficies y en partículas de aleaciones de titanio y en titanio con una gran pureza.

6-También sugieren que es posible hacer modificaciones de titanio en partículas de 40 μm.

Agradecimientos

Dr. Rolando A. Gittens y el Instituto de Investigación INDICASAT AIP.

Instituto Smithsonian, especialmente al Sr. Jorge Ceballos, encargado del laboratorio del microscopía.

Vicerrectoría de la Universidad de Panamá. Especialmente a el Dr. Tomás Diez y el Dr. Janzel Villalaz.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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