Detección de anticuerpos contra Brucella abortus en perros en contacto con zona rural. Aspectos zoonóticos de la infección

Detection of antibodies against Brucella abortus in dogs in contact with rural areas. Zoonotic aspects of the infection

La brucelosis es una enfermedad infecto­contagiosa de curso crónico y de distribución mundial, que afecta tanto al hombre como a los animales domésticos, la fauna silvestre y los mamíferos marinos. Las bacterias del género Brucella incluyen 11 especies reconocidas (Whatmore, 2009; Whatmore et al., 2014). Las cepas lisas son:

B. melitensis, B. abortus, B. suis, B. neotomae, B. ceti, B. pinnipedialis, B. microti, B. inopinata y B. papionis y las cepas rugosas son: B. ovis y B. canis(Nicola & Elena, 2009). Las cepas de campo de B. canis son siempre rugosas y tienen crecimiento de tipo mucoide (M+) después de varios días de incubación, especialmente en medios con pH 7,2. Si la bacteria desarrolla en medios con pH menor a 6,5 se obtienen variantes M­. Las variantes M­ tienen una virulencia reducida, los animales se mantienen asintomáticos y la respuesta inmune evaluada mediante pruebas serodiagnósticas es más débil, especialmente si se utiliza B. ovis como antígeno (Carmichael et al., 1984a; 1984b).

Esta enfermedad es particularmente contagiosa y es posible la transmisión cruzada de especies de Brucella spp. (Olsen & Palmer, 2014). Todos los biovares de B. abortus y B. melitensis y los biovares 1, 3 y 4 de B. suis son patógenos para el ser humano (Godfroid et al., 2002; Maudlin et al., 2009). Por lo tanto, es considerada zoonosis, con carácter ocupacional, manifestándose en el hombre con fiebre, mialgias, cefalea, dermatitis, linfadenopatías y, ocasionalmente, poliartritis (Acha & Szyfres, 2001). Sin embargo, aunque es zoonótica, B. canis es menos reconocida como tal (Krueger et al., 2014).

La brucelosis en perros fue reportada en todo el mundo, siendo endémica en América, Asia y África, donde los estudios serológicos en numerosos países establecieron una gama de seropositividad del 1 al 28 % (McDermott et al., 2013). En perros, la enfermedad tiene como principal agente etiológico a B. canis(Carmichael & Greene, 1998), pero hay informes de contagio por B. abortus, B. suis y B. melitensis(Barr et al., 1986; Bicknell et al., 1976; Prior, 1976; Miranda et al., 2005; Sandoval et al., 1976).

La infección natural de perros por B. abortus es de ocurrencia esporádica y resulta del contacto estrecho del animal, generalmente de zona rural, con bovinos infectados. Esto ocurre habitualmente por ingestión de tejido animal, restos placentarios o fetos abortados contaminados con la bacteria (Azevedo et al., 2003; Carmichael & Greene, 1998; Miranda et al., 2005). Los caninos parecen ser más resistentes a Brucella spp. lisas, siendo raras las manifestaciones clínicas derivadas de la enfermedad, aunque, en asociación con bacteriemia transitoria, algunos animales pueden presentar linfadenopatías y otras manifestaciones de la infección (Azevedo et al., 2003). Luego del contacto con la Brucella, los anticuerpos se hacen detectables a partir de las dos semanas posinfección (Johnson et al., 1983). En forma similar a todas las afecciones por Brucella spp., en la primera fase de la respuesta humoral predomina la IgM, la que va siendo paulatinamente superada por la IgG; esta predomina en la respuesta crónica (Carmichael et al., 1984a, 1984b).

La identificación de los perros enfermos es de suma importancia porque constituyen fuentes de contaminación, ya que pueden eliminar el agente infeccioso por orina, semen, secreciones vaginales, fetos abortados o heces (Baek et al., 2003; Forbes, 1990). La presencia y persistencia de B. abortus en descargas vaginales de perras por un lapso superior a los 42 días después del parto o aborto fue descrita por Baek et al. (2003). Esta descarga, junto con restos de abortos de las perras enfermas, es el material de mayor riesgo en la transmisión del agente a los propios perros y animales de producción (Forbes, 1990).

El diagnóstico de laboratorio para B. canis rutinariamente incluye la prueba de aglutinación rápida en portaobjetos (RSAT) y la inmunodifusión en gel de agar (AGID) (Robles, 1998). Estas dos pruebas presentan disminución de la especificidad dado que los antígenos de superficie de Brucellas rugosas reaccionan en forma cruzada con los anticuerpos producidos por otras especies de bacterias no patógenas (Shin & Carmichael, 1999). Debido a esto, se han mejorado las técnicas diagnósticas, implementándose una RSAT que utiliza un antígeno M­, una AGID que utiliza antígenos proteínicos citoplasmáticos y pruebas de ELISA e inmunofluorescencia. El uso de un antígeno proveniente de una variante M­ de B. canis, en reemplazo del antígeno de B. ovis, reduce la tasa de falsos positivos. Para el diagnóstico de B. abortus, el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) establece, como oficiales, las siguientes técnicas: aglutinación con antígeno tamponado (BPA), seroaglutinación lenta en tubo (SAT) o prueba de Wright, de 2­mercapto­etanol (2­Me), fluorescencia polarizada (FPA), fijación de complemento (FC), ELISA­I (indirecto) y ELISA­C (competición) (Nielsen, 2002).

Si bien existe una comunicación que informa sobre la presencia de anticuerpos contra B. abortus en perros del conurbano sur bonaerense (Eiras et al., 2014), hasta la fecha no se conocen datos epidemiológicos sobre la infección humana por B. abortus a través de los mismos. El objetivo de este trabajo fue detectar, en sueros de perros del sudoeste de la Provincia de Buenos Aires, Argentina, la presencia de anticuerpos contra B. abortus, haciendo hincapié en el posible impacto zoonótico de esta enfermedad.

Se realizó un estudio descriptivo y observacional, empleando 67 muestras de sangre de caninos, con propietario, recolectados por el Laboratorio Coronel Suárez, de Coronel Suárez, en el sudoeste de la Provincia de Buenos Aires, durante los años 2017 y 2018. Los propietarios dieron su consentimiento para la toma de la muestra. La muestra estaba compuesta por 35 animales que habitaban en zona rural, 29 animales que habitaban en zona urbana, pero que concurrían asiduamente al campo transportados por sus dueños, y 3 animales que habitaban en zona urbana y convivían con perros que concurrían al campo.

Se obtuvieron entre 3 y 5 ml de sangre de la vena yugular externa o cefálica antebraquial, se separó el suero y se conservó congelado a ­20 °C hasta el momento de su procesamiento. La información de cada animal (sexo, edad y hábitos de vida) se registró en una planilla Excel® confeccionada para tal fin.

Para detectar anticuerpos anti B. canis se efectuó la prueba rápida, cualitativa de RSAT, de acuerdo con las recomendaciones de Carmichael & Joubert (1987), incluyendo en cada portaobjetos un suero control positivo. El antígeno fue producido por el SENASA utilizando la cepa B. canis M­, coloreado con Rosa de Bengala y sin 2­Me. La técnica se realizó utilizando 10 µl de suero y 10 µl de antígeno. La lectura se realizó a los 2 minutos, considerándose positiva cuando hubo presencia de grumos y negativa cuando la mezcla manifestó turbidez homogénea sin grumos.

Para detectar anticuerpos anti B. abortus se realizó, en primer término, la prueba de BPA (aglutinación rápida), de acuerdo con los procedimientos estandarizados (Alton et al., 1988) y con antígeno producido por SENASA, ya que es la prueba tamiz oficialmente aceptada en la Argentina para el diagnóstico de brucelosis bovina. Se utilizaron 80 µl de suero y 30 µl de antígeno y la lectura se realizó a los 8 minutos. En caso de resultados negativos (turbidez homogénea) no se realizó ninguna otra prueba y en caso de resultados positivos (aparición de grumos) se realizaron las pruebas confirmatorias de SAT, 2­Me y FPA, de acuerdo a las indicaciones del Manual de diagnóstico serológico de la brucelosis bovina del SENASA del año 2009 (Nicola & Elena, 2009).

Las pruebas de SAT y 2­Me son cuantitativas de aglutinación lenta en tubo. Para la prueba de SAT, con la que se determinó IgG e IgM, se utilizaron 4 diluciones de suero en solución salina fenolada (1/25, 1/50, 1/100 y 1/200). Para la prueba de 2­Me, se realizaron las mismas diluciones en solución salina con 2­Me y solo se determinó IgG, ya que el compuesto con radical tiol produce alteraciones en los enlaces disulfuros y genera un impedimento estérico sobre las IgM, quedando monómeros que no tienen capacidad de aglutinar. La lectura de la reacción para ambas técnicas se realizó a las 40­48 horas y el grado de aglutinación fue definido como: a) completo: unión antígeno/anticuerpo (mezcla) con líquido límpido y sin ruptura de grumos ante la agitación suave; b) incompleto: mezcla parcialmente turbia en la que la leve agitación no produjo ruptura de los grumos; c) negativo: mezcla turbia en la que ante la agitación no se observaron grumos.

Para la prueba de FPA, se utilizó un antígeno que consiste en un pequeño fragmento de peso molecular promedio de 22 kD, de O­polisacárido del lipopolisacárido de B. abortus 1119­3, conjugado con isotiocianato de fluoresceína. El mismo se incubó con una dilución 1/100 de suero (10 µl de suero en 990 µl de solución tamponada de fosfatos). A los dos minutos se realizó la lectura de los resultados en un analizador fluorescente (Sentry 100, Diachemix DLL, EE. UU.) y se expresaron en unidades de milipolarización (mP), siendo negativos los valores ≤ 94 mP, sospechosos aquellos entre 94­105 mP y positivos los ≥105 mP.

La población analizada consistió en 67 perros (31 hembras y 36 machos) con un promedio de edad de 4,5 años (rango 1 a 10) en las hembras y de 4,6 años (rango 1 a 11) en los machos.

En referencia a la prueba tamiz de BPA, 18 de los 67 sueros (26,8 %) fueron positivos y la reactividad fue de 36 % (13/36) entre los machos y de 16 % (5/31) entre las hembras. Utilizando los criterios de interpretación de resultados para bovinos no vacunados, los resultados obtenidos a partir de los animales positivos a la prueba tamiz y analizados por las pruebas confirmatorias se muestran en la Tabla 1.

Solo 2 de los animales resultaron positivos a la prueba de RSAT para B. canis y uno de ellos resultó también positivo a la prueba de BPA (Tabla 1).

Tabla 1.

Resultados obtenidos mediante pruebas diagnósticas de brucelosis, aplicadas a los sueros detectados positivos, utilizando la prueba de antígeno tamponado en placa (BPA). Se detallan los valores hallados mediante las técnicas confirmatorias.

P= positivo; N=negativo; S=sospechoso; U=urbano; U/ R=urbano y rural; R=rural.

Las cepas de Brucella lisas (B. abortus, B. suis o B. melitensis) expresan la cadena lateral O inmunodominante en el lipopolisacárido de su superficie. Esto hace que esta cadena lateral forme la base antigénica de las pruebas de diagnóstico BPA, SAT y 2­ME, pudiendo, de esta manera, detectarse especies lisas. Las pruebas para especies de Brucella rugosas, como B. canis, difieren de las pruebas para Brucella lisas, ya que B. canis no contiene la cadena lateral O en su superficie y la prueba RSAT es la que se emplea para su análisis serológico. Por lo tanto, no es posible que los perros infectados por B. canis resulten positivos para la prueba de B. abortus y viceversa (Mateu­de­Antonio et al., 1994).

Para realizar estudios en caninos, no se ha diseñado ni estandarizado, hasta el momento, ningún ensayo que permita el diagnóstico indirecto de la infección con especies de Brucella lisas. Los métodos serológicos empleados para la detección de la enfermedad son los mismos que se aplican en los bovinos, no existiendo criterios uniformes para su utilización en perros (McGiven et al.; 2003; Nicola & Elena, 2009; Nielsen et al., 2005; Vargas, 2002). Las pruebas serológicas oficiales en nuestro país para la especie bovina han sido establecidas por el SENASA en la Resolución 438/2006 (Nicola & Elena, 2009). La prueba de FPA es una prueba de referencia internacional y es utilizada en caso de ser necesario corroborar un resultado (Araoz et al., 2014). No existen antecedentes sobre el uso de FPA en perros. Los datos de este trabajo, podrían constituir, en un futuro, una herramienta útil de diagnóstico, si se establece el punto de corte y la concordancia con las pruebas clásicas de SAT y 2­Me en la especie canina.

En este estudio se halló que del 26,8% de las muestras positivas a la prueba tamiz de BPA, solo el 7,5% fue confirmado mediante SAT y 2­Me (con resultados mayores o iguales a 1/100) y reconfirmado mediante la prueba de FPA. La presencia de falsos positivos a la prueba de BPA puede deberse a reacciones cruzadas con otras bacterias gram negativas que comparten un lipopolisacárido superficial similar al que presenta Brucella(Gall et al., 2006; Godfroid et al., 2002). Estas interacciones han sido estudiadas minuciosamente en los bovinos (Mainar­Jaime et al., 2005), por lo que es factible que en los caninos también sean causa importante de interferencia en el diagnóstico de brucelosis.

El análisis de la información obtenida de cada animal mostró que los perros de zona rural seropositivos a B. abortus vivían próximos al ganado vacuno diagnosticado positivo de acuerdo a los procedimientos establecidos en la Resolución 438/2006 de SENASA, y podían tener acceso a fetos abortados y placentas de vacas infectadas. En el caso de los perros de zona urbana, estos convivían con perros que concurrían asiduamente al campo. Las descargas vaginales del ganado positivo a B. abortus persisten por más de 40 días después del aborto o parto y se convierten en una fuente de infección para perros (Moreno, 2014). La dosis infecciosa para perros es de aproximadamente 106 a 1010 organismos/g (Pidgeon, 1987). La seroconversión en perros infectados por B. abortus puede ocurrir entre 5 y 20 días después de la infección y ha sido reportada la diseminación de Brucella spp. en el medio ambiente a través de la orina o heces (Pidgeon, 1987). Esta vía podría explicar la infección de los perros de zona urbana que no han concurrido al campo y que podrían haberse infectado al ingerir o tomar contacto con fómites o materiales biológicos, tales como heces u orina contaminadas con Brucella spp. de los perros de zona urbana y que concurrieron al campo.

Según la legislación vigente en Argentina, el ganado seropositivo a brucelosis debe eliminarse bajo un programa de vigilancia para evitar la propagación de la enfermedad. Hasta el momento, no hay evidencias que reporten que los perros desempeñen un papel epidemiológico activo en la transmisión de B. abortus a humanos o al ganado. Si bien la brucelosis en caninos no es parte del programa de vigilancia, los perros podrían desempeñar el papel de hospedadores reservorios para B. abortus. Esta fuente de transmisión no debe ser subestimada, ya que la transmisión cruzada de especies de Brucella spp. es posible (Olsen & Palmer, 2014). Existen reportes de la transmisión esporádica de B. canis de los perros domésticos al ser humano (Hensel et al., 2018). Además, otro informe describe la detección de B. suis en perros, advirtiendo sobre la posible transmisión al humano (Ramamoorthy et al., 2011).

Debido a que B. abortus es más patógena para los seres humanos que B. canis, las personas con sospecha de brucelosis y en contacto con perros de zona rural o perros de zona urbana pero que concurren al campo, deberían someterse a análisis para descartar o confirmar la presencia de anticuerpos anti­Brucella. Pese a que el riesgo de transmisión parece ser leve, los perros infectados por B. abortus tienen el potencial de infectar el ganado vacuno y podrían ser una amenaza en la cadena de transmisión de esta enfermedad, lo cual podría tener consecuencias económicas desfavorables. La eliminación del ganado reactor no necesariamente puede erradicar la enfermedad, pero la eliminación de los perros que se hallan en contacto con rodeos infectados, podría ayudar al control de la misma. Durante los programas de erradicación, las pruebas serológicas de perros para B. abortus pueden ser un indicador valioso (centinela) de la presencia de brucelosis en el ganado bovino (Moreno, 2014).

La ingestión de productos lácteos contaminados es el mayor riesgo de infección por Brucella en áreas endémicas (Kose et al., 2014). Sin embargo, no se debe subestimar la transmisión potencial de B. abortus a humanos por perros que se han infectado por haber estado en contacto directo o indirecto con vacas infectadas.

Se estima que más del 60 % de los patógenos humanos están relacionados con animales, y la incidencia de una enfermedad se ve afectada por factores ambientales, por lo que diferentes enfoques son válidos para reducir la incidencia de enfermedades zoonóticas (Cutler et al., 2010). Uno de estos enfoques podría ser el concepto de “una salud”, aunque nunca antes se ha aplicado a la transmisión zoonótica de B. abortus a través de caninos (Day, 2011). Existe la necesidad de crear un marco conceptual para las enfermedades zoonóticas en caninos, aunque el concepto de “una salud” se ha discutido para las enfermedades emergentes con potencial pandémico (Godfroid et al., 2013; Uçan & Aras, 2015). En otras palabras, el potencial zoonótico de las infecciones de los perros, con la excepción de la rabia, ha sido ignorado en gran medida en todo el mundo. Por lo tanto, zoonosis como brucelosis (incluyendo el tipo canino), la equinococosis, la rabia y algunas otras, continúan afectando significativamente la salud humana (Moreno, 2014). Las principales razones para ello son el contacto cercano con los animales al compartir el mismo entorno y las deficiencias en los recursos financieros para controlarlos principalmente en países en vías de desarrollo.

Este trabajo fue financiado por el Laboratorio de Inmunología Veterinaria de la Facultad de Ciencias Veterinarias, UNLP, y es parte del Trabajo Final Integrador de la Carrera de Especialización en Diagnóstico Veterinario de Laboratorio del Med. Vet. Lautaro Pérez Meyer.

No existe conflicto de intereses que declarar.