La evaluación bioquímica de la proteinuria de caninos en el laboratorio de análisis clínicos veterinarios

The biochemical evaluation of canine proteinuria in the veterinary clinical analysis laboratory

La proteinuria (PU) como parámetro bioquímico aplicado al diagnóstico es la presencia de una cantidad anormal de proteínas en la orina. Es sabido que la orina de perros sanos contiene pequeñas cantidades de proteínas. La PU persistente se asocia a enfermedad renal (Lees et al., 2005) y la determinación de los valores de la misma debe ser considerada en la formulación de un pronóstico (International Renal Interest Society guidelines, 2019). Existe una controversia acerca de los valores de la PU que pueden observarse en perros clínicamente sanos (Tvedten, 2016). Por lo tanto es de especial interés establecer los límites de las concentraciones de las proteínas urinarias que pueden presentarse en caninos sanos, mediante la metodología analítica disponible en el laboratorio de análisis clínicos veterinarios. En este contexto, sabemos que la concentración de metabolitos urinarios está fuertemente influenciada por el estado de hidratación del paciente y que, particularmente en el caso de caninos, es difícil de controlar en el paciente ambulatorio. La determinación de la creatinina urinaria es de particular interés en la estimación de la concentración de metabolitos urinarios, ya que la misma puede ser utilizada como una medida de la concentración de la orina (Waldrop, 2008). Por ello es necesario introducir, en el análisis de datos, un factor de corrección. Esto se realiza normalizando la concentración del metabolito, en este caso la concentración de proteínas totales urinarias (P) a la concentración de la creatinina urinaria (C). La relación P/C indica entonces la concentración de proteínas totales urinarias normalizada al estado de hidratación del paciente. El objetivo de este estudio fue establecer los límites de las concentraciones de las proteínas urinarias que pueden presentarse en caninos clínicamente sanos utilizando métodos analíticos disponibles en el laboratorio de análisis clínicos veterinarios.

Se analizaron 74 muestras de orina provenientes de un universo de pacientes caninos comprendidos en alguno de los siguientes criterios de inclusión: 1- perros de distintas edades (1 a 10 años), sexo, raza y peso corporal.2- animales clínicamente sanos cuyos análisis urinarios fueron realizados durante controles de salud.3- perros con diferentes enfermedades, con y sin compromiso renal metabólico e inflamatorio, potencialmente asociadas a PU.

Las muestras fueron obtenidas por micción espontánea en su mayoría o por cistocentesis y fueron recibidas y procesadas en el laboratorio. En todas las muestras se determinaron los siguientes parámetros: 1- Densidad urinaria (DU) mediante refractometría (Refractómetro clínico Alla France mod. 95000-017). 2- Osmolalidad urinaria (OSM) mediante la técnica de descenso crioscópico (Osmomat 030, Gonotec). Para calibrar el instrumento se utilizaron stándares de 300, 850 y 2.000 mOsm/KgH₂O. 3- Parámetros bioquímicos urinarios obtenidos utilizando tiras reactivas (TR) Siemens Multistix 1056. Los mismos fueron estimados por un solo operador, por comparación colorimétrica visual con la escala provista en el kit. 4- Proteínas totales urinarias (P) mediante el método espectrofotométrico del rojo de pirogalol (Proti U/LCR, Wiener Lab, Argentina). 5- Creatinina urinaria (C) mediante el método de Jaffé (Biggs & Cooper, 1961) después de la dilución de las muestras con agua destilada (1/10 o 1/50 en relación a la DU) (Rossi et al., 2012). El procedimiento analítico realizado en todas las muestras fue el descripto por Rodríguez et al. (2018): en primer lugar se determinaron los parámetros bioquímicos urinarios mediante TR y luego la DU; posteriormente las muestras fueron conservadas a -20 °C hasta la determinación de OSM, P y C. Para todas las muestras se calculó la relación P/C. En las orinas que contenían concentraciones considerables de proteínas se realizó la siguiente corrección de la DU (Rodríguez et al., 2018): por cada g/L de proteína urinaria, se sustrajeron 0,003 unidades a la DU medida mediante RF. En los casos en que la DU excedió los límites establecidos en el refractómetro (DU > 1,050), las muestras fueron diluidas al medio (1/2) con agua destilada y luego analizadas. Para determinar la DU de la dilución se multiplicó la porción decimal de la nueva lectura por la dilución realizada (Sink & Weinstein, 2012), por ejemplo: DU determinada en la dilución 1/2 =1,020, luego 0,020 x 2 = 0,040 obteniéndose entonces la DU corregida que fue de 1,040. Si bien no se incluyen en este trabajo los resultados de los sedimentos urinarios, estos fueron utilizados para confirmar diagnósticos clínicos. Así, por ejemplo, fueron excluidos del grupo de animales clasificados como clínicamente sanos, aquellos que presentaron piuria o hematuria en los estudios del sedimento urinario.

Para facilitar el análisis de los datos, se decidió agruparlos de la siguiente manera: grupo 1: orinas que presentaron concentraciones de P < 300 mg/l (45 muestras) y grupo 2: orinas que presentaron P > 300 mg/l (29 muestras) (en este grupo se incluyeron dos muestras cuyas P estuvieron en el rango de 276 a 300 mg/l y sus P/C eran > a 0,300).

Para el grupo 1, las DU presentaron un intervalo de valores de 1,004 a 1,058 (media 1,028) y OSM de 118 a 2116 mOsm/KgH₂O (media 1063). En algunas muestras, las determinaciones de bioquímica urinaria realizadas mediante TR indicaron valores de P que variaron desde trazas a 1+ (100-300 mg/l de acuerdo a las instrucciones del fabricante). En las figuras 1A y 1B se muestran las concentraciones de P ordenadas de menor a mayor con sus correspondientes relaciones P/C. En la figura 1A pueden observarse las concentraciones de P cuyos valores oscilaron desde 14 a 288 mg/l (media 127). La relación P/C en este grupo fue variable y se distribuyó en un rango de valores < 0,3 (mínima 0,019 - máxima 0,29). Se destaca que el aumento de las concentraciones de P no se asoció con un aumento de la relación P/C. Para el grupo 2, las DU, corregidas por la concentración de P, presentaron un intervalo de valores de 1,002 a 1,040 y una OSM de 108 a 1474 mOsm/KgH₂O (media 805). En todas estas muestras las TR mostraron concentraciones de P desde 1 a 3 +. En la figura 1B se presentan las concentraciones de P correspondientes al grupo 2, cuyos valores oscilaron desde 276 a 7350 mg/l (media 1365). Es importante considerar la diferencia de escalas presentadas en la figura 1B respecto de la figura 1A (6 veces mayor para P/C y hasta 8000 mg/l para P). Puede entonces determinarse un comportamiento diferente y disperso de la relación P/C que se incrementa hasta valores mayores a 5,5 (mínima 0,216 - máxima 5,66). En este grupo, la relación P/C de algunas orinas manifestó un incremento asociado al aumento de las concentraciones de P. Este grupo de caninos se correspondió al de animales con varias enfermedades.

Figura 1.

A Concentración de proteína total urinaria y relación proteína/creatinina en orinas cuya concentración de proteínas es < 300 mg/l (n = 45 muestras).

B Concentración de proteína total urinaria y relación proteína/creatinina en orinas cuya concentración de proteínas es > 300 mg/l (n = 29 muestras).

Considerando los posibles efectos de la hidratación del paciente sobre los valores de la C nos pareció importante estudiar la relación existente entre la C y la osmolalidad urinaria en ambos grupos de caninos.

En la figura 2 se presentan las relaciones entre la osmolalidad y la concentración urinaria de creatinina de las muestras de orina analizadas, a las que se aplicó el análisis de regresión y correlación de ambas variables. La figura 2A muestra los datos correspondientes a animales sanos cuya relación P/C fue < 0,3. Podemos observar una fuerte asociación entre ambas variables en este grupo. En cambio, en la figura 2B (animales con varias enfermedades y relación P/C > 0,3) la asociación entre variables fue muy pobre, lo cual indica que el aumento de P en estos casos no está relacionado con el estado de hidratación del paciente.

Figura 2.

A Concentración de creatinina en orina de caninos sanos en función de la osmolalidad urinaria (n = 45 muestras).

B Concentración de creatinina en orina de caninos con proteinuria en función de la osmolalidad urinaria (n = 29 muestras)

Consideramos que el análisis de 45 muestras provenientes de caninos clínicamente sanos, constituye una cantidad adecuada para establecer la estimación de un nuevo intervalo de referencia en el análisis de la P en nuestro ámbito. Las concentraciones de P deben ser interpretadas considerando la concentración de la orina; por ello es importante asociarla a la concentración de creatinina urinaria, ya que la relación P/C normaliza el valor de la PU a la concentración o dilución de la orina (Trumel et al., 2004). Tvedten (2016) ha informado, en perros sanos, valores de P que oscilaron desde 30 a 390 mg/l y relaciones P/C ligeramente menores a las obtenidas por nosotros (0,02 - 0,21) vs (0,019 - 0,29). En ambos parámetros no existen diferencias substanciales con las observadas en nuestro laboratorio. Por otra parte (Rossi et al., 2016) han señalado la importancia del método de determinación de P y su posible efecto en los intervalos de referencia sobre proteinuria (International Renal Interest Society guidelines, 2019). En este trabajo, la relación P/C se incluye en el límite inferior del grupo borderline (0,2-0,5) de las guías IRIS (2019), las cuales establecen una proteinuria < 0,2 como no proteinúrica. El intervalo (0,019 - 0,29) es mayor y podría estar asociado a alguna diferencia metodológica, tanto en el método usado para la determinación de proteínas como en la determinación de creatinina. Respecto del método utilizado para la determinación de proteínas en estudios similares, no estamos de acuerdo con la utilización de otras técnicas que utilizan colorantes como el azul brillante de Comassie, por sus desventajas analíticas, por ejemplo su adsorción sobre tubos plásticos, etc. (Goren et al., 1985; Iijima et al., 2003; Shahangian et al., 1986;). El método del rojo de pirogalol, con las modificaciones sugeridas por otros autores debidas a posibles interferencias (Marshall & Williams, 2003;Marshall & Williams, 2004) y realizadas por los fabricantes de los kits disponibles en nuestro medio, constituye, en nuestra apreciación, un método simple, económico y bastante exacto, considerando la complejidad de estimar la concentración de proteínas totales en un líquido biológico como la orina. Por lo expuesto, podemos concluir que, en orinas de caninos de nuestro medio, la presencia de trazas de P (1+), detectadas mediante TR, o concentraciones < 300 mg/l, determinadas mediante la reacción del rojo de pirogalol, asociada a una relación P/C < 0,3, no indican necesariamente una proteinuria patológica.

Agradecemos a Wiener Lab., por la generosa donación del Kit Proti U/LCR. Los instrumentos utilizados fueron provistos por el subsidio del Servicio de Relaciones Internacionales y Partenariado Territorial de la Región Friuli-Venezia-Giulia de Italia para la ejecución del proyecto Creación del Centro Binacional (Argentina – Italia) de Investigación en Criobiología Clínica y Aplicada. Protocollo: n. 19096/PT

Todos los autores declaran que no existe conflicto de intereses, relaciones financieras, personales o de otro tipo con personas u organizaciones que pudieran afectar al presente trabajo.