INTRODUCCIÓN

Las bacterias usan una amplia variedad de compuestos orgánicos como fuentes de energía y/o carbono. A parte de compuestos biogénicos, muchas especies bacterianas son capaces de atacar xenobióticos, compuestos sintetizados por los humanos, que presentan una estructura más o menos diferente a los compuestos naturales o sintetizados por los seres vivos. Sin embargo, su papel en los procesos de biorremediación está a menudo limitado por las bajas tasas de conversión, las cuales pueden estar afectadas por condiciones ambientales desfavorables como temperaturas adversas, deficiencias nutricionales, falta de aceptores de electrones y los efectos tóxicos de los xenobióticos. Diferentes compuestos de este tipo, tienen efectos deletéreos en numerosos sitios dentro de las células. Dependiendo de sus propiedades físicas y químicas, diferentes xenobióticos provocan un incremento en la fluidez de la membrana (Isken y de Bont, 1998), disminución de la síntesis de ATP (Loffhagen et al., 1997) y modificación o desnaturalización de biomoléculas en bacterias (Tamarit et al., 1998). Diversos tipos de respuestas, como cambios en la composición de los lípidos de la membrana (Loffhagen et al., 1995), modificación de la hidrofobicidad de la célula (Isken y de Bont, 1998), e incremento en los niveles de proteínas específicas, manifestándose una en la inestabilidad de las células.

El análisis de las respuestas bacterianas a diversos hidrocarburos aromáticos por proteómica, ha demostrado como observación general, la regulación completa de proteínas específicas de rutas metabólicas, junto con varias proteínas de estrés asociadas con calor, adaptación al frío, estrés oxidativo, choque osmótico y falta de nutrientes (Methe et al., 2005). Se sugiere que un número de elementos están involucrados en la respuesta a estos químicos tóxicos:

(i) enzimas implicadas en el metabolismo de hidrocarburos tóxicos, las cuales pueden contribuir a su transformación en compuestos no tóxicos.; (ii) rigidez de la membrana celular por alteración de la composición de los fosfolípidos; (iii) alteraciones en la superficie celular que hacen que las células pierdan permeabilidad; (iv) flujo de un compuesto tóxico en los procesos dependientes de energía y (v) formación de vesículas que remueven solventes de la superficie celular (Ramos et al., 1998). Se ha reportado la identificación de diversas proteínas inducidas por hidrocarburos poliaromáticos en Mycobacterium vanbaalenii PYR-1, incluyendo una catalasa-peroxidasa, una monoxigenasa, una dioxigenasa, una pequeña subunidad de dioxigenasa inducible por naftaleno y una aldehído deshidrogenasa. Así como proteínas relacionadas con el metabolismo de carbohidratos, transcripción del ADN, proteínas de choque térmico y de producción de energía (Kim et al., 2004).

El análisis del proteoma de bacterias involucradas en biorremediación, nos permite comprender cómo las bacterias reaccionan ante la presencia de sustratos hidrocarbonados aromáticos tóxicos. La degradación aromática en bacterias es un complejo fenómeno que engloba no sólo enzimas catabólicas, sino también proteínas de choque térmico y proteínas de membrana. El análisis proteómico de la respuesta de los microorganismos a los hidrocarburos aromáticos, lo cuales inducen estrés, puede proveer una visión más global de los mecanismos involucrados en la respuesta adaptativa a químicos con una toxicidad establecida. La identificación de las proteínas implicadas puede ayudar a elucidar mecanismos de defensa, destoxificación y adaptación. El papel de σ⁵⁴ en la respuesta fisiológica de Pseudomonas alcaligenes P25X a la inducción por gentisato (2,5- dihidroxibenzoato) fue estimado por comparación de los perfiles de expresión proteica de la cepa silvestre P25X con el mutante rpoN de la cepa G54 (Zhao et al., 2005). La identificación de las proteínas por MALDI-TOF/TOF revela que una amplia diversidad de las mismas fue afectada por la mutación de σ⁵⁴, el grupo más grande de proteínas que están involucradas en el metabolismo del carbono. Esto incluye la estrictamente inducible gentisato 1,2- dioxigenasa, una de las dos enzimas isofuncionales claves en la vía del gentisato y enzimas del ciclo de Krebs, del metabolismo del piruvato y de la gluconeogénesis. Otras proteínas que son parte del regulón σ⁵⁴ incluyen enzimas implicadas en el metabolismo del nitrógeno, transporte de proteínas, proteínas de respuesta a estrés y otras involucradas en la motilidad celular. Los resultados de este estudio muestran que σ⁵⁴ tiene un papel regulador global en la expresión de una amplia variedad de genes de diversas funciones en Pseudomonas pseudoalcaligenes (Zhao y Poh, 2008).

Además, la electroforesis bidimensional es una poderosa herramienta para investigar los mecanismos empleados por las bacterias para degradar hidrocarburos aromáticos y las respuestas fisiológicas asociadas. Desde que se desarrolló la electroforesis bidimensional, mostrándose todas las proteínas bacterianas solubles expresadas bajo condiciones específicas de cultivo, se ha logrado un mejor entendimiento de las proteínas de transporte involucradas y de las enzimas empleadas por los microorganismos para degradar hidrocarburos aromáticos. Las herramientas proteómicas han ido incrementando su uso en el estudio de la degradación de hidrocarburos aromáticos por especies bacterianas como Acinetobacter sp. KS-1(Kim et al., 2003), Mycobacterium vanbaalenii PYR-1(Kim et al., 2007), Pseudomonas putida KT2420/2442 (Lupi et al., 1995 y Kim et al., 2006), P. alcaligenes NCIMB 9867 (Zhao et al., 2004) y más recientemente la bacteria Gram- positiva Rhodococcus sp. Cepa TFB (Tomas-Gallardo et al., 2006).

En el caso de los organismos unicelulares, una variedad de cambios en el ambiente celular (choque térmico, baja temperatura, presencia de metales pesados) han sido usados para inducir cambios en el proteoma existente. El primer reconocimiento de la riqueza molecular, en cuanto a respuesta bacteriana mediante proteínas de estrés, tuvo lugar con la introducción en 1975, de la electroforesis en geles de acrilamida en dos dimensiones para resolver complejas mezclas de proteínas celulares (O’ Farrell, 1975). Esta tecnología introdujo una fase de cambios en el estudio de la fisiología bacteriana por ajuste de nuevas aproximaciones experimentales básicas.

Esta claro ahora, que además de la regulación de la expresión de genes específicos, hay sistemas de regulación global que controlan expresiones simultáneas de un gran número de genes en respuesta a una variedad de estreses ambientales. El primero de estos sistemas de control global, y de sustancial importancia, es la respuesta al estrés por calor. El primer estudio de la respuesta de una bacteria a estrés por calor con análisis de electroforesis en dos dimensiones, comparó el proteoma de E. coli creciendo a 28ºC o 37ºC con su crecimiento a temperaturas altas de 42ºC a 50ºC (Neidhardt et al., 1981 y Van Bogelen et al., 1987). Estudios similares han sido desarrollados en otras bacterias (ejemplo, Bacillus subtilis, Bradyrhizobium japonicum, Brucella melitensis, Agrobacterium tumefaciens y cepas de Vibrio sp S14), determinando las proteínas involucradas en la respuesta al estrés por calor, y cuántas de ellas estaban inducidas cuando las células estuvieron sujetas a más de una condición de estrés (Richter y Hecker, 1986 y Bernhardt et al., 1997). Solamente un reducido número de proteomas bacterianos en respuesta al estrés por calor han sido definidos con la electroforesis en dos dimensiones.

La respuesta al estrés por calor se caracteriza por la inducción de un conjunto grande de proteínas (llamadas proteínas de respuesta al calor o Hsp), bajo exposición a altas temperaturas y a condiciones en que normalmente las proteínas se desnaturalizan, por ejemplo en presencia de alcoholes y metales pesados (Schumann, 2003 y Chhabra et al., 2006). Perturbaciones como la exposición de las células a hidrocarburos aromáticos tóxicos y condiciones de estrés, fácilmente producen respuestas celulares in vivo que pueden ser sujeto de análisis proteómicos y que consideramos son los primeros ejemplos de proteómica funcional. El resultado del análisis del proteoma funcional es la identificación de muchas Hsp que son inducidas en respuesta a varios estímulos (Chen et al., 2000; Monahan et al., 2001 y Giard et al., 2002).

Los compuestos nitroaromáticos se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente y han sido detectados en efluentes líquidos, ríos y suelos tratados con pesticidas. Son liberados al ambiente principalmente a través de actividades antropogénicas. Los nitrofenoles son utilizados como intermediarios en la producción de fármacos, colorantes, pesticidas, conservantes de la madera y explosivos (Spain, 1995; Zablotowicz et al., 1999; She et al., 2005). Estos compuestos son altamente tóxicos para el ser humano y mamíferos dado que son sustancias que pueden llevar a la formación de metahemoglobina y son potentes desacoplantes de la fosforilación oxidativa (Karim y Gupta, 2002). El 2,4- dinitrofenol (2,4-DNP) es un compuesto persistente en el ambiente considerado contaminante prioritario por la Agencia de protección ambiental de los Estados Unidos (US EPA), que recomienda un nivel guía en aguas naturales menor de 10 ng/L (Korol et al., 2008). Dentro de las bacterias fotosintéticas (clase Fotobacterias) se encuentra una subclase que contiene a las bacterias fotosintéticas oxigénicas (las cianobacterias), y otra subclase en que se encuentran las bacterias fotosintéticas anoxigénicas. Estas últimas se clasifican en tres grupos: bacterias verdes (azufradas y no azufradas), bacterias rojas (azufradas y no azufradas) y heliobacterias. Las bacterias rojas (Rhodospirillales) poseen unas membranas intracitoplasmáticas características, producidas por invaginaciones de la membrana plasmática. En estas membranas se encuentra el aparato fotosintético con los pigmentos, la bacterioclorofila a y b y los carotenoides.

Las Rodospiriláceas asimilan el nitrógeno orgánico fundamentalmente a través de la glutamato deshidrogenasa, mientras que el amonio se incorpora a los esqueletos carbonados mediante la ruta glutamina sintetasa/glutamato sintasa (GS/GOGAT). También poseen nitrogenasa, y algunas especies, nitrato y nitrito reductasas. Rhodobacter capsulatus E1F1 utiliza como fuente de carbono para el crecimiento diversos compuestos aromáticos como benzoato, catecol, 1,2,3-trihidroxibenceno y 3,4-dihidroxibenzoato, tanto en luz y anaerobiosis como en luz y microaerobiosis, coincidiendo con lo descrito para otras Rodospiriláceas. Por otro lado, R. capsulatus E1F1 utiliza escasamente diversos nitrofenoles como fuente de carbono, aunque sí como fuente de nitrógeno, en presencia de una fuente de carbono adecuada, tanto en condiciones de luz/anaerobiosis como en luz/microaerobiosis, ya que es capaz de fotoasimilar nitrato y nitrito.

R. capsulatus E1F1 fotorreduce el 2,4-dinitrofenol a 2-amino-4-nitrofenol (ANP) en anaerobiosis, mediante una actividad nitrofenol reductasa que se induce en presencia de nitrofenoles y se reprime en células cultivadas con amonio. Mientras que en anaerobiosis el 2,4- dinitrofenol se reduce casi estequiométricamente a 2-amino-4-nitrofenol, en condiciones microaeróbicas éste último desaparece del medio de cultivo, dando lugar a nitrito y a otros metabolitos prácticamente indetectables por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

El 2,4-DNP es un desacoplante energético que inhibe fuertemente la fijación de nitrógeno en R. capsulatus. De hecho, esta bacteria sólo puede crecer diazotróficamente cuando el 2,4-DNP se ha transformado casi en su totalidad en ANP, de ahí que la fotorreducción de 2,4-DNP sea un proceso cometabólico. Por otro lado, cuando se estudia la inducción de la nitrogenasa se observa que se induce a medida que el 2,4-DNP va desapareciendo del medio de cultivo. En presencia de amonio, el metabolismo del 2,4-DNP se inhibe fuertemente.

Por otra parte, la estirpe B10 es fácil de estudiar genéticamente y además se conoce la secuencia completa del genoma de la estirpe SB1003, muy similar a B10, que se ha publicado recientemente (Haselkorn et al., 2001). Por todo ello, se caracterizó la utilización de 2,4-DNP por R. capsulatus B10. Esta bacteria fotorreduce el 2,4-dinitrofenol (2,4-DNP) a 2-amino-4- nitrofenol, que es liberado al medio de cultivo casi estequiométricamente en condiciones anaeróbicas, igual que en la estirpe E1F1 (Pérez Reinado, 2005).

El presente estudio, tiene el propósito de determinar la expresión diferencial de proteínas en R. capsulatus B10S frente a la presencia de 2,4-DNP, en células cultivadas en amonio y bajo condiciones diazotróficas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Microorganismos

Para llevar a cabo el presente estudio se empleó la cepa de Rhodobacter capsulatus B10S, mutante espontáneo de R. capsulatus B10, resistente a estreptomicina (Pérez-Reinado, 2005 ).

Compuestos químicos

Se empleó 2,4- dinitrofenol (DNP) de grado analítico provisto por Fluka (Riedel de Haën). Todos los reactivos químicos fueron de grado analítico provistos por Sigma Chemical Company (St. Louis, USA), Merck (Darmstadt, Alemania) y Panreac (Barcelona, España). La solución de 2,4-DNP 200 mM, se preparó asépticamente disolviendo la cantidad necesaria en 50 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).

Medios de Cultivo

Los medios de cultivo utilizados se esterilizaron en autoclave durante 20 min a 126 ºC, se suplementaron con el antibiótico sulfato de estreptomicina con una concentración en el medio de 200 mg/mL. Como medio mínimo para el cultivo rutinario de la estirpe de R. capsulatus B10S se empleó RCV (cuadro 1) (Pérez-Reinado, 2005).

Cuadro 1.

Composición medio RCV

La solución de trazas (cuadro 2) se preparó disolviendo en 250 mL de agua los siguientes componentes:

Cuadro 2.

Solución de trazas

Como fuente de carbono se utilizó D,L-malato (30 mM) añadiéndose 20 mL/L a partir de una solución preparada al 20% ajustada a pH 6,8. Como fuente de nitrógeno se empleó glutamato sódico (1 g/L) y cloruro amónico (10 mM) o el dinitrógeno molecular disuelto en el medio (16 mg/L).

En cuanto a las condiciones de cultivo, R. capsulatus se cultivó a 30 ºC en condiciones de luz y anaerobiosis (condición fototrófica), utilizando frascos de cristal Pyrex® del volumen adecuado (entre 8 mL y 1.5 L), cerrados herméticamente. Los frascos se llenaron completamente con medio de cultivo para crear las condiciones anaérobicas. Los cultivos se iluminaron de forma continua con lámparas de wolframio para obtener condiciones saturantes de luz (240 W·m^-2).

Análisis Proteómico

• Fraccionamiento subcelular: Para la realización de geles 2D se partió aproximadamente de 1150 mL de cultivos de R. capsulatus que se recogieron en fase de crecimiento exponencial, el crecimiento de las estirpes se siguió mediante turbidimetría a 680 nm (densidad óptica 0.5-0.6), utilizando para ello un espectrofotómetro UV-Vis ThermoSpectronic, Helios Epsilon. Las células de R. capsulatus se recogieron por centrifugación a 10.000 g durante 10 min a 4 ºC, en una centrífuga Beckman J2-21. Se desechó el sobrenadante y las células se resuspendieron en tampón Tris-HCl 50 mM pH 8,0 para volverlas a centrifugar, eliminar nuevamente el sobrenadante y guardar a -80ºC. Una vez descongeladas las células, las mismas fueron resuspendidas en tampón de solubilización (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS 4% (p/v), se les añadió DNAsa 65 μg/mL y RNAsa 40 μg/mL. Posteriormente se rompieron mediante 3 ciclos de 5 s a 90 W, con un sonicador Vibra Cell de Sonics & Materials, manteniendo las células en todo momento a 4 ºC. A los extractos obtenidos se les añadió además, una mezcla de inhibidores de proteínas (PMSF 7 μg/mL, Leupepstina 2 μg/mL, y Pepstatina 2.8 μg/mL), incubándose posteriormente 1 h a temperatura ambiente. Seguidamente se centrifugaron a 11000 g (centrífuga Sigma 6k 15) por 1 h, guardándose el sobrenadante para el análisis proteómico.

• Determinación de la concentración de proteínas: Para la determinación de proteínas se utilizó el método de Bradford (1976). A 0,8 mL de muestra se le añadieron 0,2 mL de reactivo “Bio-Rad Dye reagent concentrate”, referencia (500-0006 Bio-Rad). Transcurridos 5 min se determinó la absorbancia a 595 nm y el valor obtenido se interpoló en una recta patrón obtenida con seroalbúmina bovina (BSA).

• Isoelectroenfoque: La primera dimensión se llevó a cabo usando el sistema IEF Cell de Bio-Rad. Las tiras de isoelectroenfoque fueron de 7 y 17 cm (Bio-Rad), con intervalos de pH de 3-10 y 5-8. Las muestras previamente centrifugadas a 12000 g durante 1 h, se aplicaron a los sarcófagos y encima de cada una se colocó, hacia abajo, un gel de isoelectroenfoque, luego los geles se cubrieron con aceite mineral. Para una completa absorción de las proteínas y rehidratación de los geles se realizó una rehidratación pasiva (sin voltaje) durante 12 h para los geles de 7 cm; para los de 17 cm, se realizó una rehidratación pasiva durante 1 h y seguido una rehidratación activa (30 V) durante 12 h. En ambos casos tanto la rehidratación como el isoelectroenfoque se llevaron a cabo a 20ºC y una corriente de 50 µA por gel.

• Preparación de la muestra: de la fracción soluble se tomaron volúmenes con cantidades comprendidas entre 100 a 125 µg de proteínas, se completaron hasta 125 µL (para los geles de 7 cm) y 300 µL (para los geles de 17 cm) con tampón de solubilización, que contenía urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS 4% (p/v), DTT 50 mM, tampón IPG (anfolitos 0.8% (p/v) y trazas de azul de bromofenol.

• Equilibrado de tiras de isoelectroenfoque: antes del inicio de la segunda dimensión, los geles de isoelectroenfoque se equilibraron durante 15 min en tampón de equilibrado (urea 6 M, glicerol 30% (v/v), azul de bromofenol, todo esto preparado en tampón Tris-HCl 50 mM (pH 8,8), conteniendo DTT (10 mg/mL) y seguidamente otros 15 min en tampón de equilibrado conteniendo yodoacetamida 25 mg/mL.

• Segunda dimensión: la electroforesis bidimensional (segunda dimensión), se llevó a cabo usando el sistema Protean® Plus Mini Dodeca® Cell de Bio-Rad para los geles de 7 cm y Proten® Plus Dodeca® Cell para los de 17 cm ambos de Bio-Rad. Todo el material se lavó cuidadosamente con agua destilada y etanol. Los geles de isoelectroenfoque equilibrados se colocaron posteriormente sobre geles de poliacrilamida al 12% para la segunda dimensión. Los marcadores de peso molecular se aplicaron en trozo de papel Whatmann, el cual se colocó al lado del gel de isoelectroenfoque y sobre el gel de poliacrilamida. Por último, tanto el gel de isoelectroenfoque como el papel con los marcadores se sellaron con agarosa al 0.5%. Las condiciones de electroforesis fueron de 200 V para los geles de 7 cm por 2 h y 60 V por 22 h para los de 17 cm, a 10ºC.

• Tinción de geles: el revelado de los geles bidimensionales se realizó únicamente mediante la tinción de Sypro® Ruby (Bio-Rad). Los geles se lavaron con agua destilada, y se colocaron 30 min en solución de fijación (10% metanol y 7% ácido acético glacial), seguidamente se incubaron toda la noche con Sypro® Ruby, agitando suavemente. El tiempo de incubación fue de aproximadamente 20 h. A continuación se retiró la tinción fluorescente, se colocaron en solución de fijación por 30 min y finalmente en agua destilada por otros 30 min. Los geles de electroforesis se escanearon con el ImageScanner de Amersham-Pharmacia y posteriormente se analizaron utilizando el programa ImageMaster 2D v3.1 de Amersham-Pharmacia. En dicho análisis se identificaron aquellas manchas (proteínas resueltas en la electroforesis bidimensional) cuyos cambios, tanto cualitativos como cuantitativos, se consideraron más significativos.

• Aislamiento de proteínas y análisis mediante espectrometría de masas: las proteínas (manchas) de interés se enviaron al SCAI-Universidad de Córdoba para ser recortados, digeridos con tripsina e identificados mediante huella peptídica (MALDI-TOF/TOF).

• Identificación de proteínas a partir de los resultados de espectrometría de masas: las huellas de mapas de péptidos generadas por MALDI-TOF/TOF se utilizaron para identificar las proteínas mediante diversas herramientas bioinformáticas o motores búsqueda disponibles en Internet como Mascot y Sequest.

RESULTADOS

Metabolismo de 2,4-Dinitrofenol en Rhodobacter capsulatus B10S:

La bacteria Rhodobacter capsulatus B10S se cultivó en anaerobiosis en medios RCV con malato 30 mM como fuente de carbono, utilizando glutamato sódico(1 g/L), cloruro amónico (10 mM) o el dinitrógeno molecular disuelto en el medio (16 mg/L) como fuente de nitrógeno y en presencia de 2,4-dinitrofenol (DNP) 200 µM. Como puede verse en la figura 1, la bacteria transformó rápidamente todo el 2,4-DNP en Aminonitrofenol (ANP). Mientras que en condiciones diazotróficas (condiciones de fijación de nitrógeno) como se observa en la figura 2, la degradación del 2,4-DNP fue más lenta.

Figura 1.
Degradación anaerobia de 2,4-DNP (puntos rojos) por Rhodobacter capsulatus B10S en medios con glutamato. Cinética de crecimiento (puntos negros).

Figura 2.
Degradación anaerobia de 2,4-DNP (puntos rojos) por Rhodobacter capsulatus B10S en condiciones diazotróficas. Cinética de crecimiento (puntos negros).

Obtención de los extractos proteicos:

Para la obtención de la fracción soluble de proteínas se partió de cultivos en tubos de 8 mL, pasando por 125 mL y finalmente en frascos de aproximadamente 1150 mL (figura 3). La densidad óptica inicial de crecimiento (a 680 nm) fue de 0.129 para estos últimos y cuando alcanzaron 0.500, se le añadió el 2,4-DNP, tanto a los medios con cloruro de amonio (fuente de nitrógeno) como a los de condiciones diazotróficas. Las células que estaban creciendo en medio RCVNH₄DNP se recogieron antes de que se formara el ANP, mientras que las de los medios RCVDNP (condición diazotrófica) cuando se hubiera transformado al menos un 25% de 2,4-DNP a ANP. Estas condiciones se determinaron mediante HPLC (cromatografía líquida de alta resolución) utilizando un cromatógrafo Beckman System Gold Diode Array Detector Module 168 (figura 4).

Figura 3.
Condiciones de cultivo con glutamato, NH4 y diazotrófica más 2,4-DNP.

Figura 4.
Cromatograma de ANP y DNP obtenido mediante HPLC.

Optimización de la fracción proteica para la electroforesis bidimensional:

Al llevarse a cabo los geles de 7 cm la resolución de las proteínas no fue la esperada, sugiriéndose la presencia de impurezas (sales o pigmentos propios de la bacteria) en los extractos proteicos obtenidos figura 5. Para mejorar estos resultados se le añadió a los extractos proteicos 4 volúmenes de metanol, luego 1 volumen de cloroformo, seguidamente se le añadió 3 volúmenes de agua miliQ (luego de cada paso se agitó la muestra), en este punto la muestra debe tener aspecto lechoso. Se centrifugó a 12000 g durante 5 min y se eliminó la fase superior (las proteínas se quedan en la interfase formando un anillo blanco), luego se añadieron 3 volúmenes de metanol y se agitó, se centrifugó a 12000 g durante 5 min y se eliminó el sobrenadante, finalmente se dejó secar por 10-15 min y se resuspendió en el tampón de solubilización. Se llevó a cabo nuevamente la electroforesis bidimensional en los geles de 7 cm obteniéndose una mejor resolución y enfoque de las manchas (proteínas) como se aprecia en la figura 6.

Figura 5.
RCV

Figura 6.
RCV

Una vez se optimizaron los geles de 7 cm en cuanto al enfoque de las proteínas y resolución de los mismos, se procedió con geles de 17 cm. En este punto se realizaron geles por duplicado para las condiciones RCVNH₄ (geles control), RCVNH₄DNP 3h (exposición de la bacteria a 2,4-DNP por 3 h) y RCVNH₄DNP 6h (exposición de la bacteria a 2,4-DNP por 6 h), como se muestra en las figuras 7,8 y 9. No fue posible realizar geles de 17 cm para las condiciones diazotróficas, pues no se contaba con la cantidad de proteína requerida.

Figura 7.
RCV NH4.

Figura 8.
RCV NH4DNP 3 h.

Figura 9.
RCV NH4DNP 6 h.

En la Tabla 1 se presentan las manchas (proteínas), que se inducen, reprimen o sobreexpresan en las distintas condiciones experimentales, así como su punto isoeléctrico y peso molecular en kDa.

Tabla 1.

Inducción y represión de manchas (proteínas).

Los puntos negros indican la presencia de las manchas en los distintos geles.

Figura 10.
Comparación de las manchas (proteínas) sugeridas como posibles diferencias entre las distintas condiciones experimentales.

Los geles 1-2 corresponden a RCV NH₄, los geles 3-4 a RCV NH₄ DNP 3 h y los 5-6 a RCVNH₄DNP 6 h.

DISCUSIÓN

Cuando las células de R. capsulatus se cultivan en condiciones fototróficas y de anaerobiosis, utilizando L-glutamato como fuente de nitrógeno carecen de actividad nitroreductasa (enzima capaz de transformar el 2,4-DNP en ANP). Sin embargo, cuando se le transfiere a medios con 2,4-DNP, se comienza a inducir la actividad de la enzima. Esta respuesta metabólica no ocurre en presencia de amonio, pues éste bloquea instantánea y reversiblemente el consumo de 2,4-DNP en R. capsulatus B10S. Experimentos previos demuestran que la fotorreducción de 2,4-DNP depende de la presencia de fuentes alternativas de carbono o nitrógeno. En cuanto a su cultivo en condiciones diazotróficas, en presencia de 2,4-DNP, la fijación de nitrógeno está fuertemente inhibida y no se produce la liberación de amonio al medio. La fijación de nitrógeno es un proceso que requiere gran cantidad de energía, y dado que el 2,4-DNP es un desacoplante energético, la bacteria sólo puede crecer diazotróficamente cuando el 2,4-DNP se ha transformado prácticamente en su totalidad en ANP (Pérez-Reinado, 2005).

Estos datos experimentales explican porque las células de R. capsulatus B10S, que se cultivaron en glutamato más DNP crecían más rápidamente que cultivadas con amonio más DNP y en condiciones diazotróficas más DNP, y también porque la degradación del DNP es mucho más rápida en medios con glutamato que en cultivos que se encuentran en condiciones diazotróficas (ver figuras 1 y 2).

En cuanto a la obtención de los extractos proteicos para la electroforesis bidimensional, las células cultivadas en amonio más DNP, se recogen antes de que se inicie la reducción de DNP a ANP, para detectar mediante el análisis proteómico posterior, aquellas proteínas que se reprimen, inducen o sobreexpresan ante la presencia de DNP, para ello se toman muestras del cultivo y se verifica mediante HPLC, si se ha comenzado a formar el ANP. Por esta razón, a partir de que se añade el DNP se toman muestras hasta que se inicia la actividad nitroreductasa y el proceso reductivo del DNP, lo que indica que se ha iniciado el consumo del mismo. En R. capsulatus E1F1, la inhibición causada por el amonio no afecta in vitro la actividad nitroreductasa, e in vivo sólo a largo plazo, lo que indica que muy probablemente debe actuar a nivel de expresión génica (Pérez- Reinado, 2005).En relación a la obtención del extracto proteico de R. capsulatus B10S cultivada en condiciones diazotróficas a las que se le añadió DNP, las mismas se recogen cuando al menos un 25% del DNP se ha reducido a ANP (verificación mediante HPLC), pues el DNP ejerce un fuerte inhibición sobre la fijación de nitrógeno como ya se mencionó, lo que pudiera explicar su lento crecimiento. En este caso se intenta detectar inducción, represión o sobreexpresión de proteínas cuando la bacteria se encuentra nuevamente fijando nitrógeno, condición que se presenta cuando el DNP se ha transformado en ANP. Es por ello que se requiere partir de una densidad óptica apropiada de células en condiciones diazotróficas, para obtener suficiente cantidad de proteínas una vez añadido el DNP, lo que permite hacer los geles de mayor tamaño (17 cm).Para la optimización de la fracción proteica a emplearse en la electroforesis bidimensional, una vez obtenido el extracto proteico de las diferentes condiciones de cultivo, las muestras se someten a una eliminación de posibles contaminantes basada en un protocolo de metanol-cloroformo, que interfieren en la obtención de una fracción proteica soluble, que permita obtener una buena resolución de los geles y enfoque de las proteínas.

Finalmente para las células cultivadas en amonio (control) y en amonio más DNP, se identificaron en total trece manchas (proteínas) de expresión diferencial (inducción, represión y sobreexpresión) basándose en el programa informático ImageMaster 2D v3.1 de Amersham- Pharmacia, a partir de los geles de 17 cm, con sus correspondientes pesos moleculares y puntos isoeléctricos, en donde se espera observar en el proteoma el efecto del amonio sobre el consumo de 2,4-DNP y sobre la regulación de procesos de transporte de 2,4-DNP al interior celular; expresión del (los) gen (es) de la (s) nitroreductasa (s), actividad nitroreductasa y los donadores de electrones a la (s) nitroreductasa (s).

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Notas de autor