Efecto de dos dilutores comerciales en la viabilidad espermática de llama (Lama glama L.) colectado mediante aspiración vaginal en dos edades

Effect of two commercial dilutors on sperm viability of flame (Lama glama L.) collected by vaginal aspiration at two ages

La colección de semen de los camélidos sudamericanos (CSA) en su inicio fue a través de fundas vaginales¹, que posteriormente se aplicó la electroeyaculación² y en la actualidad se emplea vagina artificial con una cérvix simulada, en un maniquí en posición copulatoria³, esta última tiene que ser mantenida a temperatura corporal, apoyada con frazadilla eléctrica para permitirle al macho no interrumpir la cópula⁴.

Las técnicas que permitieron evaluar el comportamiento sexual del macho, sus características seminales^5,6,7, en alpacas^4,8,10. Sin embargo hay reportes que señalan, que algunas características del semen como su carácter espumoso y altamente viscoso en diferentes grados obstaculizan su evaluación en calidad y cantidad^4,8, del mismo modo señalan que el semen colectado se convierte en un líquido mucoso espeso después de dos horas de conservación¹⁰.

La inseminación artificial (IA) en CSA, se ve restringida en su mayor parte por el semen fresco^4,11, dado que su criopreservación en estas especies aún está en pleno desarrollo, cuyos resultados a la fecha son poco alentadores, influyen diversos factores que la imposibilitan, los que se destacan, concentración espermática, porcentaje de espermatozoides (spz) anormales, escaso conocimiento sobre dilutores y crioprotectores del semen de CSA¹².

La poca información existente, sobre el uso de dilutores de semen de CSA, así como las técnicas de refrigeración y congelación, en estos últimos 20 años se trata de adaptar a otras especies como vacunos y ovinos¹³, con resultados bajos en preñez, obtenidos por IA con semen congelando^14,15,16, de ahí que se hace necesario realizar investigaciones sobre el comportamiento de los dilutores que ayuden a conservar el semen de estas especies.

El objetivo del estudio fue evaluar el efecto de dos dilutores comerciales (AndroMed y Triladyl) en la viabilidad espermática de llama (Lama glama L.) colectado mediante aspiración vaginal en dos edades.

Ubicación geográfica. La presente investigación se realizó en los predios de la Unidad Académica Campesina de Tiahuanacu (UAC-T) dependiente de la Universidad Católica Boliviana “San Pablo” (UCBSP), se encuentra en la provincia Ingavi del departamento de La Paz, a 72 km de la sede de gobierno, entre las coordenadas 17°35´ a 10°17´ de latitud sur y 68 °20´a 69°08´de longitud oeste, a una altura de 3854 msnm¹⁷.

Material biológico. Se utilizaron 6 llamas machos de 3 a 4 años de edad (donadores de semen) de la raza Q´ara y 12 llamas hembras de 4 a 5 años de edades (receptivas y vacías) de la raza Q´ara. Considerando sus características fenotípicas (talla, tamaño testicular y liberación del pene prepucial).

Procedimiento experimental . La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Biotecnología Reproductiva Animal de la Carrera de Ingeniera Zootécnica (LBRA-CIZ) de la UAC-T, de la UCBSP, del departamento de La Paz.

Desparasitación y acostumbramiento. Se desparasitó con PARAMEC 20 LA, por vía intramuscular a una dosis de 1 mL/50 Kg de peso vivo (PV), realizándose la repetición a los 15 días posteriores a la primera aplicación, para garantizar la eliminación de los parásitos, luego se administró FOSFOVIT como fuente de fosfato para coadyuvar a la espermatogénesis. La etapa de acostumbramiento fue por un lapso de 15 días antes del inicio de la investigación, en la Comunidad de Achaca, los animales se adaptaron al tipo de alimentación del sector, se adiestro en este periodo de 15 días para la colección del semen, pruebas de colección de semen con la ayuda del material de proctoscopio (proctoscopio humano) post-cópula .

Colección de semen. Se realizó por el método de aspiración vaginal, que consiste en aspirar parte del semen pos-eyaculado por el macho que deja en la cavidad cervical y uterina de la hembra. Teniendo las hembras vacías, se procedió a la estimulación visual de llamas machos acercando a las hembras, seguidamente se les acomodó en posición de empadre, el tiempo de cópula fue 25-30 min. Una vez culminada la cópula se procedió con la desinfección de la vulva con papel toalla. Predio a la colecta del semen para prevenir la contaminación externa hacia la muestra, se introdujo el especulo a la cavidad cervical, luego se retiró el guiador conectando el especulo con tubos falcón de 14 mL, por la fuerza de la gravedad el semen va filtrando por la pared del especulo hacia el tubo colector.

Preparado de dilutores comerciales. Se realizó el preparado de los dilutores comerciales de AndroMed y Triladyl + yema de huevo, por la cantidad de semen (mL) colectados de las llamas machos en el proceso de la investigación. AndroMed. Se utilizó un promedio de 100 mL de diluyente más 400 mL de agua a + 37 °C, el agua bidestilada a temperado a 37 °C. Triladyl. Se mezcló 100 mL en 300 mL de agua bidestilada, representativo como solución madre y luego se procedió a la refrigeración a 4 °C.

Evaluación macroscópica del semen. i) volumen, se valoró en la cantidad de semen en mL lecturado en tubos colectores, ii) color, fue lecturado en forma directa en tubos colectores, tomando en consideración las tonalidades básicas de rojo claro, rojo oscuro, blanco lechoso y blanco cristalino⁴, iii) pH, fue evaluado con la cinta pH metro, con tres repeticiones en cada colecta por muestra, iv) filancia, se extrajo 10 µL de semen con micropipeta directamente del tubo colector, posteriormente se puso sobre la base el filanciometro en una superficie horizontal, seguidamente se procedió la lectura con una jeringa N° 18, la ubicación de la altura dando la lectura en cm.

Evaluación microscópica del semeni) concentración espermática, se realizó extrayendo con un micropipeta de 10 µL de semen, colocando sobre la cámara de Neubauer, se dejó reposar 5 min, luego se realizó el conteo, calculando con la siguiente formula:

EPZc=Promedio de spz contados.

25= Número de cuadrantes.

1000 = Factor de dilución

Motilidad espermática. En el microscopio con platina térmica y los materiales de manipulación fueron regulados a una temperatura de 37 °C aproximadamente, se extrajo 10 µL de semen con una micropipeta se colocó en un porta objeto y se cubrió con su respectivo cubre objeto, la lectura se realizó con un microscopio a 40X contando los spz del campo visual, valorando subjetivamente los spz que se mueven de forma rectilínea. El porcentaje de motilidad espermática se obtuvo con la siguiente ecuación¹⁸.

n = Número de spz móviles.

N = Número de spz contados.

Vitalidad espermática. Se extrajo 10 μL de semen y 10 μL de la solución de eosina-nigrosina, se llevó al porta objeto, luego se homogenizó suavemente con la punta de la pipeta durante 15 s luego se realizó el frotis que solo quede una sola capa en el porta objeto, esperando 2 a 5 min para eliminar la humedad de la muestra realizando la lectura de spz teñidos y no teñidos. El número de spz vivos se determinó con la siguiente formula^11,19.

n = Número de spz sin teñir

N = Número de spz contados

Dilución del semen. i) dilución con dilutor, ya teniendo la solución madre se procedió a la dilución final de este diluyente, contiene de tres partes de solución madre de Triladyl y una unidad de yema de huevo, conociendo la concentración de spz por mL, del semen eyaculado de la llama todo a temperado a 35 °C. Dilución con dilutor AndroMed, Se utilizó 100 mL de AndroMed diluyente más 400 mL de agua bidestilada de solución madre, se procedió a la solución final, se mescló con el semen eyaculado de la llama macho todo a temperado a 35 °C.

Dilución del semen con los dilutores comerciales Triladyl y AndroMed: El semen valorado fue diluido con los dilutores comerciales Triladyl y AndroMed que previamente fueron preparados en los tubos falcón de 14 mL, se agregó una cantidad de semen, determinada mediante la siguiente fórmula.

mL semen/dilutor = Cantidad de mL de semen requerida por cada tubo falcón con 14 mL de dilutor.

14 = Factor de multiplicación por tomar 14 mL de dilución final.

30 = Factor de multiplicación por tomar 30x106 spz de concentración por cada mL de dilución final.

C.Epz = Concentración espermática del semen.

% Vit = Porcentaje de vitalidad espermática del semen.

% Mot = Porcentaje de motilidad espermática del semen.

Descenso de la temperatura. Los tubos falcón con las muestras de semen diluido, fueron colocados en un vaso precipitado con 400 mL de agua temperada a 35 °C. Luego el vaso precipitado con las muestras, fue colocado en el interior del refrigerador hasta que la temperatura descienda a 4 °C, con el propósito de reducir la actividad metabólica de los spz.

Factores de estudio.

Análisis macroscópico y microscópico del semen. Factor edad (3 y 4 años). Viabilidad espermática refrigerada a 4 ° C: Factor A: Edad (3 y 4 años), Factor B, dilutores (Triladyl y AndroMed), Factor C, Tiempos de refrigeración (0, 6, 12, 18 y 24 h).

Variables de respuesta. i) motilidad espermática, ii) (%), vialidad espermática (%)

Diseño experimental

Para análisis de macroscópico y microscópicos del semen de llama, los datos se han analizado en un diseño completamente al azar (DCA) cuyo modelo aditivo lineal es el siguiente.

Y_ij = Es la variable respuesta (volumen, pH, concentración, motilidad y vitalidad espermática).

u = Es la media general o constante común del modelo.

D_i = Es el efecto del factor edad (3 y 4 años).

e_ij= Es el error experimental o efectos ambientales no controlables sobre la variable respuesta.

Los datos se han procesado con el programa estadístico SAS versión 9.2 haciendo uso del procedimiento ANOVA. Para hacer las comparaciones posteriores se utilizó la prueba de comparación Duncan con un nivel de significación del 5% (p = 0.05).

Para la evaluación de la variabilidad espermática (motilidad y vitalidad), se utilizó el diseño completamente al azar con tres repeticiones con un arreglo factorial de 3Ax2Bx3C(3), los niveles de cada factor se combinaron con cada uno de los factores de estudio (factor cruzado). Cuyo modelo estadístico fue el siguiente.

Y_ijk = Variable de respuesta (motilidad y vitalidad)

μ = Media general del experimento o constante común del modelo

α_i = Efecto del i-ésimo dilutores comerciales

βj = Efecto del j-ésimo de edades (3 y 4 años)

_αβij = Efecto de la interacción i-ésimo de dilutor con el j-ésimo edad

δk = Efecto k-ésimo factor tiempos de refrigeración

αδik = Efecto de la interacción de i-ésimo de factor dilutores comerciales con el k-ésimo factor tiempos de refrigeración

βδjk = Efecto de la interacción de j-ésimo edades con el k-ésimo factor tiempos de refrigeración

αβδijk = Efecto de la interacción del i-ésimo factor dilutores comerciales, j-ésimo factor edades, factor k-ésimo factor tiempos de refrigeración

εijk = Es el error experimental o efectos ambientales no controlables sobre la variable respuesta.

Se han descrito una serie de investigaciones que reportan técnicas de obtención de spz de camélidos, que refieren fundas, esponjas vaginales, preservativos^20,21, fistula²², electroeyaculación^2,21,23, vagina artificial^4,8,24.

Figura 2
Comparación de medios Duncan entre tiempos (h) de refrigeración en la motilidad espermática

El volumen seminal fue diferente^25,26, en alpacas²⁷ al igual que lo reportado por Giuliano et al.²⁸ en llamas por el mismo método de colección, la concentración espermática fue inferior a la lo señalado por Ordoñez et al.^25,26 que se debería a que este estudio se realizó en época de secas y los otros en época reproductiva.

Tabla 2
Análisis de varianza de la motilidad espermática en los tiempos de refrigeración del semen fresco en llamas en dos edades (p=0.05)

C.V. = 7.15 %

Tabla 3
Análisis de varianza de la vitalidad espermática en los tiempos de refrigeración del semen fresco en llamas en dos edades (p=0.05)

C.V.= 7.14 %

Tabla 4
Análisis de varianza para efecto simple entre edades y dilutores en la vitalidad espermática (p=0.05)

Figura 3
Comparación de medias Duncan entre dilutores en la vitalidad espermática en los tiempos de refrigeración

Figura 4
Comparación de medios Duncan entre tiempos (h) de refrigeración en la motilidad espermática

Figura 5
Comparación de medias Duncan edad por dilutor en la vitalidad espermática en los tiempos de refrigeración

Las características macroscópicas de semen eyaculado de llama, volumen 3.4±1.9 mL, color de rojo claro 85%, rojo oscuro 10% y blanco lechoso 5%, pH de 8.4±0.4 (alcalinidad). Las características microscópicas, promedio de concentración espermática 38.8x10⁶ spz por mL, motilidad 74.3 % y vitalidad 80.9 %.

Según (Bravo et al.⁴, el volumen obtenidos en alpacas por aspiración vaginal fue de 3.6 mL, con vagina artificial es de 1.5 mL²⁹. Estudios realizados por (Alarcón et al.²⁹, el color de semen colectado por aspiración vaginal fue mayormente rojo claro (80%), y por vagina artificial fue viscoso (90%). Los datos reportados en la presente investigación fueron superiores en relación a estos autores, podría deberse por la especie y el clima, de otro lado con vagina artificial reporto pH de 7.58¹⁸, nuestros datos fueron 8.4±0.4 alcalino, podría deberse por el método de colección, filancia 90% semiviscosa, con vaginal artificial 90% viscoso, en nuestra investigación fue grado 0, estas diferencias pueden deberse a la presencia de fluidos de la hembra, vitalidad 75.3% y vagina artificial 70.8%²⁹.

El análisis de ANVA para la motilidad espermática, muestra diferencias altamente significativas entre dilutor y tiempos de refrigeración, la probabilidad es de (P<0.01), estas variables de estudio afectan en la motilidad espermática en llamas de dos edades (3 y 4 años).

Por otro lado, se observa diferencias no significancias (P>0.05) en la interacción edad por dilutor, edad por tiempo, dilutor por tiempo y edad por dilutor por tiempo, es decir que los tratamientos no dependen de otros factores en la variable de estudio, se observa diferencias no significancias (P > 0.05) para el factor edad, es decir que el tratamiento no dependen entre sí de los de más factores de estudio.

La coeficiente de variabilidad de 7.15% para la motilidad espermática en los tiempos de refrigeración de semen fresco, muestra la confiabilidad de los datos obtenidos en el presente trabajo de investigación.

La comparación de medias Duncan entre dilutores comerciales en la motilidad espermática en los tiempos de refrigeración, de un 68.97 % con Triladyl y un 62.76 % con AndroMed presentan diferencias significativas entre dilutores (p<0.01).

La colección por electroeyaculación, la criopreservación se evalúo mediante la motilidad y los parámetros de movilidad de refrigeración con AndroMed, Triladyl y base Tris, estáticos de 98.08, 53.05, 56.90 % del semen refrigerado siendo el Triladyl y base Tris superiores al dilutor AndroMed ^25,26.

La comparación de medios Duncan muestra diferencias significativas (p0<0.01) entre tiempos de refrigeración de 0, 6, 12, 18 y 24 h, en la motilidad espermática. El análisis de ANVA para la vitalidad espermática, existe una diferencia altamente significativa entre dilutores comerciales en los tiempos de refrigeración y la interacción de edad*dilutor, con una probabilidad del (P<0.01), estas variables de estudio afectan en la motilidad espermática en llamas de dos edades. Por otro lado, se observa diferencias no significancias (P >0.05) para el factor edad, en la interacciones edad por tiempo, dilutor por tiempo y edad por dilutor por tiempo, es decir que los tratamientos no dependen de otros factores en la variable de estudio.

El coeficiente de variabilidad de 7.14% para la vitalidad espermática en los tiempos de refrigeración de semen fresco, muestra la confiabilidad de los datos obtenidos en el presente trabajo de investigación.

En la comparación de medias Duncan entre dilutores en la vitalidad espermática en los tiempos de refrigeración, existe diferencias altamente significativas (p<0.01). Con un promedio de 73.85% para Triladyl y de 67.91% para AndroMed hasta las 24 h. Se evaluaron spz epididimarios de alpaca refrigerados a 0, 4, 8, 12, 24 y 48 h, en unos de sus tratamientos diluyeron los spz en TRIS de la misma forma que en el presente estudio, obtuvieron 84%, 76% y 68% para 0, 4 y 8 h en viabilidad³⁰. En la presente investigación los datos reportados están dentro de los rangos mencionados por los anteriores autores.

Los spz pueden ser recuperados y conservados por la aplicación de los dilutores, conservando sus características, calidad y cantidad de espermatozoide, que pueden ser utilizados en técnicas reproductivas.

http://www.scielo.org.bo/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S2311-25812020000100004&lng=es&nrm=iso (html)

Al personal del Laboratorio de Biotecnología Reproductiva Animal de la Carrera de Ingeniera Zootécnica (LBRA-CZ). (Universidad Católica Boliviana San Pablo, Bolivia) por su apoyo en el análisis de las muestras evaluadas en la presente investigación.