Artículos

Relevamiento sanitario de brucelosis en cabras de sistemas productivos del noreste chaqueño: primer registro microbiológico regional del aislamiento de B. Melitensis de abortos caprinos

Sanitary survey of brucellosis in goats from productive systems of the northeast of chaco: first regional microbiological record of the isolation of B. Melitensis from goat abortions

Monzón, Nolly; Espasandin, Ana; Martínez, Diana; Cipolini, Fabiana; Sandobal, Rocío; Lozina, Josefina; Giraudo, José; Sticotti, Erika; Salinas, Aldana; Escobar, Gabriela; Celestino, Celina Celestino; Hasan, Deborah; Robles, Carlos

Nolly Monzón

nolly.monzon@comunidad.unne.edu.ar

Universidad Nacional del Nordeste Argentina

Ana Espasandin

Universidad Nacional del Nordeste Argentina

Diana Martínez

Universidad Nacional del Nordeste Argentina

Fabiana Cipolini

Universidad Nacional del Nordeste Argentina

Rocío Sandobal

Universidad Nacional del Nordeste Argentina

Josefina Lozina

Ministerio de Producción, Industria y Empleo del Chaco Argentina

José Giraudo

Universidad Nacional de Río Cuarto Argentina

Erika Sticotti

Universidad Nacional de Río Cuarto Argentina

Aldana Salinas

Universidad Nacional de Río Cuarto Argentina

Gabriela Escobar

Laboratorio Nacional de Referencia INEIA-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán Argentina

Celina Celestino Celestino

Laboratorio Nacional de Referencia INEIA-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán Argentina

Deborah Hasan

Laboratorio Nacional de Referencia INEIA-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán Argentina

Carlos Robles

INTA EEA Bariloche Argentina

Ab intus FAV-UNRC

Universidad Nacional de Río Cuarto, Argentina

ISSN-e: 2618-2734

Periodicidad: Semestral

vol. 6, núm. 12, 2023

abintus@ayv.unrc.edu.ar

Recepción: 10 Julio 2023

Aprobación: 16 Diciembre 2023

URL: http://portal.amelica.org/ameli/journal/820/82045488204548011/

DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.10405682

Autor de correspondencia: nolly.monzon@comunidad.unne.edu.ar

Modelo de publicación sin fines de lucro para conservar la naturaleza académica y abierta de la comunicación científica

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Resumen: El estudio se llevó a cabo en la localidad de Miraflores del Departamento General Güemes Chaco, Argentina. Se seleccionaron 7 establecimientos caprinos de pequeños productores con alta prevalencia serológica de brucelosis caprina. Se trabajó con un total de 436 cabras, de las cuales se tomaron muestras de sangre entera con y sin anticoagulante para seleccionar aquellas con serología positiva a Brucella spp. determinada mediante las técnicas de cribado de Antígeno Tamponado en Placa (BPA) y como técnica confirmatoria se utilizó el ensayo de Fluorescencia Polarizada (FPA). De las hembras en lactancia se tomaron muestras de leche de ambas glándulas y de aquellas parturientas que habían abortado en los 15 días previos al muestreo, se tomaron además muestras de hisopados vaginales para cultivos bacteriológicos dentro de las 48 hs. de obtenidas. Luego del cribado serológico se seleccionaron para cultivo 98 muestras de sangre, 20 muestras de leche y 7 hisopados vaginales, de los que se obtuvieron 8 cultivos positivos (3 vaginales y 5 cultivos a partir de la fracción leucocitaria) en 3 establecimientos. Posteriormente, los aislamientos logrados fueron identificados mediante tipificación tradicional. Se determinó la presencia de B. melitensis biovar 1 en los establecimientos visitados de la localidad de Miraflores, coincidente con reportes previos para la región. El aislamiento de B. melitensis y su relación con abortos en cabras confirma el alto impacto de esta enfermedad en la producción caprina y recuerda su peligro potencial para otras especies animales y el riesgo zoonótico para las familias rurales.

Palabras clave: cabras, Brucella melitensis, aislamiento, Argentina, bacteriología.

Abstract: The study was conducted in the village of Miraflores, county of General Güemes, Chaco, Argentina. Seven farms were selected due to their high prevalence to caprine brucellosis, previously determined by Buffered Plate Antigen (BPA) and Fluorescence Polarization immunoassay (FPA) serological tests. In each farm, blood samples without anticoagulants were collected from all the animals from the jugular vein. An additional sampling in females who had aborted in the past 15 days was carried out, consisting in vaginal swabs, blood and milk from the udder. From 98 blood samples, 20 milk samples and 7 vaginal swabs, 8 positive cultures, three from vaginal swabs and five from buffy coat cultures were obtained from 3 of the seven farms. The cultures obtained were submitted to traditional typification. Results showed that the isolated strains in Miraflores corresponded to Brucella melitensis biovar 1, being this in line with previous reports in the region and the country. The isolation of B. melitensis and its relationship with abortions in goats, confirms the high impact of the disease in goat production and reinforces the importance of this disease, not only in goats but also in rural families.

Keywords: goats, Brucella melitensis, isolation, Argentina, bacteriology.

INTRODUCCIÓN

La brucelosis caprina es una enfermedad infecciosa crónica producida por Brucella melitensis, un microorganismo patógeno con tres biotipos (1, 2 y 3) reconocidos hasta el momento (Dawood et al., 2023)

Si bien B. melitensis puede infectar a una gran variedad de animales domésticos y silvestres y al ser humano (OIE, 2022), los caprinos y los ovinos son sus principales huéspedes. En Argentina, la infección por B. melitensis, producida por el biovar 1, está prácticamente restringida a los caprinos (Robles et al., 2014).

Los principales signos clínicos de la enfermedad son el aborto en el último tercio de la gestación y retención plancentaria, nacimiento de cabritos débiles o mortinatos y alteraciones reproductivas como orquitis, epididimitis y consecuente producción de semen de mala calidad (Alton, 1990; Megid et al., 2010; OIE, 2022).

En el mundo, la distribución de la brucelosis caprina es amplia, pudiéndose encontrar en países de Asia central, Oriente Medio, África Subsahariana y región Mediterránea. En Latinoamérica, más específicamente, México, Perú y Argentina, la enfermedad es endémica (Rossetti et al., 2017).

En Argentina la distribución de la brucelosis caprina es heterogénea. Robles et al. (2014) establecieron tres áreas de alta prevalencia (prevalencia >2,5%) que comprenden: Área centro-norte (este de las provincias de Salta y oeste de Formosa); Área noroeste sur (provincias de La Rioja y Catamarca) y Área Cuyo (provincias de Mendoza y sur de San Juan). Sin embargo, mientras las áreas de nuestro país comprendidas por las provincias de Córdoba, Santiago del Estero, Tucumán y San Luis y oeste chaqueño, se asocian con niveles de baja y mediana prevalencia (prevalencia <2,5%); otras provincias como La Pampa, Buenos Aires, Corrientes, Entre Ríos no han registrado evidencias en los últimos años. El Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria (SENASA) en el año 2017, mediante la Resolución Nº857, declaró la región patagónica (Provincias de Neuquén, Rio Negro, Chubut, Santa Cruz y Tierra del Fuego) como libre de B. melitensis en ovinos y caprinos (Resolución 857/17-E, SENASA).

En los países en vías de desarrollo, donde se registran los mayores índices de prevalencia de la enfermedad, la producción caprina es el principal sustento económico de medianos y pequeños productores, que contienen alrededor del 90% del ganado caprino existente a nivel mundial. Sumado a esto, la existencia de animales enfermos implica pérdidas económicas elevadas (Coelho et al., 2014; Rossetti et al., 2017; Franc et al., 2018; Rossetti et al., 2022). Es, por esto, una enfermedad de denuncia obligatoria en medicina veterinaria y un problema de salud pública para la población humana (Resolución Nº372/17 - SENASA; Dawood et al., 2023).

En la región del noreste argentino, los registros oficiales sanitarios actuales respecto a brucelosis caprina son escasos. Se han realizado relevamientos serológicos en las provincias de Formosa y Chaco, detectándose prevalencias elevadas a Brucella melitensis que van de 36% y de 40,9% para la provincia de Formosa (Russo et al., 2016; Martínez et al., 2018) y de 10,14% para el Chaco (Monzón et al., 2021).

En la región del impenetrable chaqueño, donde se llevó adelante el trabajo que se reporta en este estudio, no se realizan relevamientos sanitarios abarcativos y rutinarios, siendo por el contrario, intervenciones aisladas y parciales, por lo que no queda claro, generalmente, el verdadero estatus sanitario de los hatos. Además de lo limitado de los trabajos en terreno, éstos se circunscriben a un diagnóstico serológico y sin diseño epidemiológico, que no llega a confirmarse con el aislamiento y tipificación del agente causal. El cultivo bacteriológico de Brucella melitensis constituye la prueba “Gold Standard” para la identificación definitiva del agente causal, razón por la cual, siempre que el trabajo en terreno lo permita, es conveniente realizar la toma de muestras biológicas para lograr el aislamiento de la bacteria (OIE, 2022).

Por todo lo anteriormente descrito, el objetivo de este estudio fue el de contribuir a la actualización de la situación de la brucelosis caprina en la región oeste de la provincia del Chaco, mediante un estudio serológico y la confirmación de la etiología mediante cultivo y tipificación de B. melitensis en hatos caprinos.

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Selección de animales susceptibles

Luego de un relevamiento serológico realizado previamente para brucelosis caprina en diferentes establecimientos de la localidad de Miraflores, se preseleccionaron siete rebaños de caprinos de acuerdo a los resultados de las pruebas de Antígeno Tamponado en Placa (BPA) de cribado positivo, y como prueba confirmatoria el Ensayo de Fluorescencia Polarizada (FPA) (Nicola et al., 2019), y donde la prevalencia media a nivel rebaño fue de 1,83% (rango 6,6-40%).

2. Toma de muestras y procesamiento

A partir de un total de 436 animales, se tomaron muestras de sangre sin anticoagulante para obtención de suero para seleccionar los animales con reacción positiva. En el caso de las hembras parturientas con abortos en los últimos 15 días retrospectivos desde el inicio del muestreo, se tomaron diferentes muestras que consistieron en: sangre con anticoagulante (citrato de sodio), hisopados vaginales y muestras de leche de ambas glándulas mamarias en recipientes estériles.

Procesamiento de las muestras: las muestras de sangre sin anticoagulante fueron centrifugadas a 3000 rpm durante 10 minutos para la obtención de suero.

Las muestras de sangre anticoagulada, hisopados vaginales y leche, fueron remitidas refrigeradas dentro de las 48 hs. de recolectadas para cultivo al Laboratorio de Bacteriología de la Facultad de Agronomía y Veterinaria de la Universidad Nacional de Río Cuarto (UNRC). Las muestras de sangre se centrifugaron para proceder a la extracción de alícuotas de 10 ul de la fracción leucocitaria para su siembra. Los hisopados vaginales fueron sembrados directamente sobre las placas con agar. Las muestras de leche fueron homogeneizadas con un agitador vorticial previo a la siembra (Alton et al., 1988; OIE, 2022).

3. Metodología de cribado indirecto para preselección de animales reactantes

La realización de las pruebas serológicas de aglutinación en placa con Antígeno Tamponado (BPA) y de Fluorescencia Polarizada (FPA) se llevaron a cabo en las instalaciones del Laboratorio de Sanidad Animal perteneciente a la cátedra de Enfermedades Infecciosas de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Nacional del Nordeste (UNNE). El ensayo de BPA es un análisis cualitativo que se basa en la observación de la aglutinación del suero problema en presencia de antígeno de Brucella y está reglamentada en Argentina como prueba tamiz. El ensayo de FPA se basa en la medición, en un equipo denominado polarizador, del cambio en el ángulo de difracción de un haz de luz polarizada que se hace incidir sobre una solución de antígeno y posteriormente a la adición de suero problema, una solución de complejos antígeno-anticuerpo. Este cambio es traducido en unidades milipolares (Ump), constituye una prueba cuantitativa y está reglamentada como confirmatoria en el país (Nicola et al., 2019). Para tal fin, se utilizaron los reactivos provistos por el Laboratorio Biológico Biotandil®. Los animales considerados positivos fueron aquellos que tuvieron reacción positiva a la prueba de cribado (BPA), seguido de FPA positivo (con valores iguales o mayores a 85 UmP) tal como lo establece el SENASA (Nicola et al., 2019).

4. Cultivo, aislamiento e identificación bacteriana

Las muestras fueron sembradas en placas de cultivo de Agar Brucella (Neogen® Culture Media) con la adición de 7% de suero fetal bovino en estrías por agotamiento sobre la superficie de cada placa. Las placas fueron incubadas a 37ºC en microaerofilia con la adición de 5% de dióxido de carbono y las lecturas realizadas a las 24, 36 y 48 hs subsiguientes; los controles continuaron hasta los 7 días. A partir de las colonias con características macroscópicas consistentes con las del género Brucella, se procedió a las tinciones de Köster y Gram (Alton et al., 1988; OIE, 2022).

Las colonias en fase lisa sospechosas fueron remitidas al Laboratorio de Referencia de Brucelosis (LRB61) INEI-ANLIS Dr. Carlos G. Malbrán de la ciudad de Buenos Aires para complementar su identificación a nivel de especie y biovar por tipificación fenotípica (OIE, 2022; Corbel & Banai 2005; Alton et al. , 1988;). Se observó morfología de las colonias, requerimientos de suero y CO2 para su desarrollo, prueba de ureasa por el método de Bauer, producción de H₂S, aglutinación con sueros policlonales monoespecíficos dirigidos contra determinantes antigénicos del LPS (Anti A, M y R). Las pruebas de susceptibilidad a lisis por fagos Tbilisi (TB) y R/C (propagado en R-Brucella) se emplearon en la dilución habitual de la prueba (Routine Test Dilution - RTD), que consiste en la menor concentración de fagos que produce lisis completa en su cepa de propagación (Corbel & Thomas, 1985). Otros criterios que se utilizaron para diferenciar las cepas de Brucella spp. fueron: crecimiento en presencia de bacteriostáticos en las siguientes concentraciones: Polialcoholes, eritritol (1mg/ml), antibióticos penicilina (5UI/ml) y estreptomicina (2.5ug/ml) y a diferentes colorantes tales como, fucsina básica, tionina (dilución 1:25000, 1:50000 y 1:00000), safranina (1:5000), verde de malaquita (1:500000), violeta de metilo (1:100000), azul de tionina (1:500000) y pironina (1:50000) (OIE, 2022; Garin-Bastuji, 2014; Corbel, 2006).

Se incluyeron como controles las cepas de referencia: B. abortus biovar 1, 544; B. melitensis biovar 1, 16M ; B. suis biovar 1, 1330 y B. canis RM6-66 (OIE, 2022; Garin-Bastuji, 2014; Corbel, 2006).

RESULTADOS

Se pudo aislar B. melitensis a partir de hisopados vaginales y/o sangre en el 42,8% (n=3) y en el 7,5% (n=6) de los 7 rebaños y 80 animales seleccionados por su seropositividad, respectivamente. No se lograron aislamientos a partir de las muestras de leche colectadas. Los resultados de los aislamientos obtenidos a partir de 125 muestras clínicas se muestran en el gráfico 1.

Grafico 1
Resultados de aislamiento de Brucella melitensis a partir de muestras biológicas tomadas en 80 caprinos seropositivos

El desarrollo de colonias pequeñas, translúcidas, de bordes lisos compatibles con Brucella spp. se observó en 8 placas de cultivo. Se aislaron cocobacilos inmóviles, de una longitud de entre 0,6 a 1,5 u, acapsulares y no esporulados, negativos a las coloraciones de Gram y de Köster.

De las 7 cabras a partir de cuyas muestras clínicas se aisló B. melitensis, 6 fueron serológicamente positivas y la restante no evidenció un título de anticuerpos suficiente para ser detectado por las pruebas de BPA y FPA.

Los resultados obtenidos a partir del cultivo de muestras de cabras seropositivas y/o sintomáticas a brucelosis se muestran en la tabla 1.

Tabla 1

Cantidad de rodeos animales muestreados reactores serológicos positivos y cultivos bacteriológicos resultantes a partir de muestras clínicas de caprinos seropositivos yo sintomáticos de la localidad de MirafloresDpto Gral Güemes Chaco

Establecimiento | Total de animales muestreados (n) | Animales serológicamente positivos (n y %) | Tipo de muestra y cantidad de cultivos bacteriológicos obtenidos compatibles con Brucella spp. |
1 | 70 | 37 (52,8%) | 1 Hisopado vaginal (+) |
3 muestras de sangre (+) |
2 | 42 | 5 (11,9%) | 2 Hisopados vaginales (+) |
3 | 84 | 6 (7,1%) |  |
2 muestras de sangre (+) |
4 | 69 | 8 (11,5%) | - |
5 | 25 | 2 (8%) | - |
6 | 46 | 8 (17,3%) | - |
7 | 100 | 14 (14%) | - |
Totales | 436 | 80 (18,3%) | 8 (10%) |

Durante la caracterización fenotípica del crecimiento de las colonias, se demostró que los aislamientos bacterianos no requirieron CO., ni el enriquecimiento con suero equino para potenciar su desarrollo in vitro. Los resultados de la tipificación tradicional de los aislamientos se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

Resultados de tipificación tradicional de cultivos bacteriológicos de colonias obtenidas de cabras seropositivas yo sintomáticas de brucelosis pertenecientes a tres establecimientos de la localidad de MirafloresDpto Gral Güemes Chaco A Características de crecimiento frente a CO2 H₂S y en medios de cultivo enriquecidos B Características de Aglutinación y Fagotifipicación

*A: suero monoespecífico anti-B. abortus; M: suero monoespecíficoanti-B. melitensis; suero anti Brucella R

** Fagos Tbilisi (TB), Weybridge (Wb) y R/C (propagado en R-Brucella)

De lo anteriormente descrito se pudo concluir que se trataba de B. melitensis biovar 1 (OIE, 2022).

DISCUSIÓN

El cultivo bacteriológico es la prueba “Gold Standard” para el diagnóstico de especies de Brucella. En este estudio, para la obtención de los cultivos, fueron determinantes: la correcta toma de muestras, remisión (dentro de las 48 hs), y posterior procesamiento, en consonancia con lo recomendado por otros autores (OIE, 2022; Saavedra et al., 2019). Teckle et al. (2019), realizando cultivos a partir de 64 muestras biológicas caprinas, obtuvieron 12,5% de aislamientos, un resultado similar a lo obtenido en este trabajo.

En las condiciones evaluadas, se pudo lograr el aislamiento y tipificación de Brucella melitensis biovar 1 a partir de sangre e hisopados vaginales, muestras que, por otra parte, son más simples de manipular y menos riesgosas que el procesamiento de productos del aborto, que sin embargo, son muestras recomendadas como preferentes (OIE, 2022; Saavedra et al., 2019). Por otra parte no fue posible acceder a estas últimas en este trabajo, debido a las condiciones medioambientales y geográficas del Impenetrable chaqueño.

El agar comercial utilizado en este ensayo (Neogen® Culture Media), que permitió el aislamiento de Brucella spp. y de otros microorganismos fastidiosos, no fue adicionado con mezclas antibióticas para inhibir el crecimiento de otros microorganismos que pudieran desarrollarse por encima de las especies de Brucella (Alton et. al., 1988). Esto podría ser una de las razones por la cual la cantidad de aislamientos fue limitada. Por otra parte, si bien se recomienda la utilización de medios de cultivo selectivos para muestras de campo como ser CITA o Farrell (De Miguel et al., 2011; Martínez Herrera et al., 2009), en algunos casos, éstos pueden resultar inhibitorios para algunas cepas de Brucella (Mena-Bueno et al., 2022), por lo tanto es recomendable sembrar en medios de cultivo con y sin mezclas antibióticas.

La ausencia de crecimiento bacteriano en las muestras de leche puede deberse a la utilización de un medio (Brucella Agar - Neogen® Culture Media) no específico para la obtención de la bacteria a partir de dicha muestra. Martínez Herrera et al. (2009), realizaron una evaluación comparativa entre diferentes métodos de aislamiento de B. melitensis a partir de muestras de leche caprina, demostrando que los medios de cultivo de Farrell y TSA enriquecidos con suero bovino son los ideales para el desarrollo de colonias a partir de este tipo de muestras. Cabe destacar que a pesar de existir medios de cultivo más indicados para el aislamiento de Brucella a partir de las muestras obtenidas, su acceso no estuvo dentro de las posibilidades de este trabajo. Por otra parte la rapidez de la siembra luego de recolectada la muestra (menos de 48 horas) y los muestreos seriados de leche, favorecen el crecimiento bacteriano (Martínez Herrera et al., 2009), requerimientos de obtención que asimismo no fueron posibles de cumplir en las condiciones del presente trabajo.

El aislamiento de B. melitensis a partir de un hisopado vaginal proveniente de una cabra que había abortado y cuya serología fue negativa para las pruebas de BPA y FPA, podría deberse a una falla en los test serológicos concretamente relacionado con la sensibilidad propia de cada técnica que es de 92.3% para BPA (Nielsen et al., 2005a) y del 98.5% para FPA (Nielsen et al., 2005b). Las infecciones recientes, escasa circulación de Brucella en sangre y la presencia de animales portadores silentes en los que la bacteria persiste en el organismo, localizada en algún órgano, sin desarrollar una respuesta inmune detectable (El-Diasty et al., 2018; Díaz-Aparicio, 2013; Herrera et al., 2011), son posibilidades que podrían explicar también este hallazgo. Si bien, por su practicidad, se recurre al uso del diagnóstico serológico para lograr el saneamiento de los hatos, se podría considerar recolectar, además, muestras para la realización de cultivos y/o de técnicas moleculares como PCR u otras (Saavedra et al., 2019) en hatos con elevada circulación bacteriana. Debe considerarse que, si bien el cultivo bacteriológico y el aislamiento del agente fue alcanzado, este diagnóstico inequívoco de la presencia de la enfermedad no es accesible en la región, razón por la cual se recurrió a laboratorios de las provincias de Córdoba y Buenos Aires para lograr el objetivo primordial de este trabajo.

La identificación de hatos serológicamente positivos, algunos de ellos con altas prevalencias (Monzón et al., 2021), en la localidad de Miraflores sumado a los aislamientos de B. melitensis biovar 1 a partir de muestras de sangre e hisopados vaginales, ratifican la importancia de esta zoonosis en la región.

Si bien otros autores reportaron hallazgos de B. melitensis biovar 1 en regiones cercanas, tal fue el caso de Russo et al. (2016) para la provincia de Formosa, Lucero et al. (2007) para las regiones del NOA, Cuyo y Pampa Húmeda y Gaido et al. (2015) para el este de Salta, este es el primer reporte actualizado del hallazgo y tipificación del agente en la región noroeste de la provincia del Chaco.

A partir de los presentes resultados, se propone sumar el noroeste de la provincia del Chaco a la región de alta prevalencia previamente descrito por Robles, et al. (2014), compuesta por el este de Salta (Gaido et al., 2015) y oeste de Formosa (Russo et al., 2016) a fin de generar futuras estrategias de control comunes a todo el conglomerado.

CONCLUSIONES

Los aislamientos de Brucella melitensis biovar 1 logrados en el presente estudio, confirman la presencia de brucelosis caprina en la provincia del Chaco, Argentina, lo cual refuerza los resultados serológicos previos.

El uso de medios de cultivo enriquecidos para el aislamiento de Brucella spp., con mezclas de antibióticos adecuados, podría aumentar la cantidad de aislamientos en este tipo de estudios.

La identificación de Brucella melitensis biovar 1, sumado a la situación de alta prevalencia en las tres provincias (Salta, Formosa y Chaco), debería promover el establecimiento de una estrategia común de control de la enfermedad en los animales, e involucrar a las autoridades de Salud Pública para conocer la situación de la brucelosis en las familias criadoras de caprinos de la región.

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Notas de autor

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