Artículos

Resistencia de cepas de Staphylococcus aureus aislados en ambientes nosocomiales

Vallejo Pazmiño, Gysella Imelda; Andrande Tacuri, Carlos Fernando; Orellana Bravo, Paola Patricia; Ortiz, Jonnathan Gerardo

Gysella Imelda Vallejo Pazmiño

gyssvallejo8@gmail.com

Universidad Católica de Cuenca Ecuador

Carlos Fernando Andrande Tacuri

candradet@ucacue.edu.ec

Universidad Católica de Cuenca Ecuador

Paola Patricia Orellana Bravo

porellana@ucacue.edu.ec

Universidad Católica de Cuenca Ecuador

Jonnathan Gerardo Ortiz

jonnathan.ortiz@ucacue.edu.ec

Universidad Católica de Cuenca Ecuador

Revista de Investigación en Salud VIVE

Centro de Estudios Transdisciplinarios, Bolivia

ISSN: 2664-3243

ISSN-e: 2664-3243

Periodicidad: Cuatrimestral

vol. 5, núm. 13, 2022

editor@revistavive.org

Recepción: 24 Agosto 2021

Aprobación: 14 Septiembre 2021

Publicación: 19 Febrero 2022

URL: http://portal.amelica.org/ameli/journal/541/54131585413158025/

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Resumen: Staphylococcus aureus es un microorganismo que posee características particulares de virulencia y resistencia a los antibióticos. Las infecciones que produce, ocurren mayormente en personas inmunodeprimidas que podrían presentar severas consecuencias, a pesar de la terapia antimicrobiana. Objetivo. Determinar la resistencia de Staphylococcus aureus aislados en ambientes nosocomiales mediante métodos convencionales y moleculares. Materiales y métodos. el estudio presenta un enfoque cuantitativo, investigación de campo, observacional de corte transversal. Se analizó 200 muestras de aislados de ambientes nosocomiales mediante métodos fenotípicos (antibiograma por la técnica de Kirby Bauer) y genotípicos (genes de resistencia blaZ, mecA, y vanA por PCR punto final). Resultados. Los resultados de las pruebas de susceptibilidad antibiótica mostraron que el 100% de las cepas de S. aureus aisladas, fueron resistentes a oxacilina y penicilina g; y sensibles a vancomicina. Conclusiones. los resultados obtenidos en este estudio evidenciaron la presencia de SARM en las diferentes áreas hospitalarias, constituyéndose en un factor de riesgo de transmisión horizontal entre el personal sanitario y los pacientes, razón por la cual es de gran importancia evaluar su prevalencia y establecer medidas rigurosas de prevención y control de su diseminación, para disminuir el riesgo de nuevas infecciones.

Palabras clave: Resistencia a Antibióticos, Staphylococcus aureus, blaZ, mecA, vanA.

Abstract: Staphylococcus aureus is a microorganism with particular characteristics of virulence and resistance to antibiotics. The infections it produces occur mostly in immunocompromised individuals who may present severe consequences, despite antimicrobial therapy. Objective. To determine the resistance of Staphylococcus aureus isolated in nosocomial environments by conventional and molecular methods. Materials and methods. The study presents a quantitative, field research, observational, cross-sectional approach. Two hundred samples of isolates from nosocomial environments were analyzed by phenotypic (antibiogram by Kirby Bauer technique) and genotypic (resistance genes blaZ, mecA, and vanA by endpoint PCR) methods. Results. The results of the antibiotic susceptibility tests showed that 100% of the S. aureus strains isolated were resistant to oxacillin and penicillin g; and sensitive to vancomycin. Conclusions. the results obtained in this study showed the presence of MRSA in the different hospital areas, constituting a risk factor for horizontal transmission between health personnel and patients, which is why it is of great importance to evaluate its prevalence and establish rigorous measures for the prevention and control of its dissemination, in order to reduce the risk of new infections.

Keywords: Antibiotic Resistance, Staphylococcus aureus, blaZ, mecA, vanA.

Resumo: O Staphylococcus aureus é um microorganismo com características particulares de virulência e resistência a antibióticos. As infecções ocorrem principalmente em indivíduos imunocomprometidos que podem ter conseqüências graves, apesar da terapia antimicrobiana. Objetivo. Para determinar a resistência de Staphylococcus aureus isolado em ambientes nosocomiais usando métodos convencionais e moleculares. Materiais e métodos. O estudo apresenta uma abordagem quantitativa, pesquisa de campo, observacional, transversal. Duzentas amostras de isolados de ambientes nosocomiais foram analisadas pelos métodos fenotípico (antibiograma pela técnica de Kirby Bauer) e genotípico (genes de resistência blaZ, mecA, e vanA pelo método de PCR de ponto final). Resultados. Os resultados dos testes de suscetibilidade aos antibióticos mostraram que 100% das cepas de S. aureus isoladas eram resistentes à oxacilina e penicilina g; e sensíveis à vancomicina. Conclusões. Os resultados obtidos neste estudo mostraram a presença de MRSA nas diferentes áreas hospitalares, constituindo um fator de risco para a transmissão horizontal entre o pessoal de saúde e os pacientes, razão pela qual é de grande importância avaliar sua prevalência e estabelecer medidas rigorosas para a prevenção e controle de sua disseminação, a fim de reduzir o risco de novas infecções.

Palavras-chave: Resistência antibiótica, Staphylococcus aureus, blaZ, mecA, vanA.

INTRODUCCIÓN

Staphylococcus aureus (S. aureus) es un microorganismo causante de infecciones hospitalarias y comunitarias, que posee características particulares de virulencia y resistencia a los antibióticos. Las infecciones que produce, ocurren regularmente en pacientes hospitalizados y en personas sanas que podrían presentar severas consecuencias, a pesar de la terapia antimicrobiana en especial S. aureus resistente a la meticilina (SARM) (1,2). S. aureus es uno de los patógenos ubicuos más importantes y adaptables, pues es muy resistente a los ambientes desfavorables como las superficies nosocomiales (3).

Un alto porcentaje de S. aureus es multirresistente a fármacos inhibidores de la pared celular, como los betalactámicos y glucopéptidos. in embargo, se ha observado que la acumulación y la diseminación de su resistencia es producto del intercambio de determinantes de resistencia preexistentes portados por elementos genéticos móviles como plásmidos, transposones (Tn) y cassette cromosómico estafilocócico (SCCmec)(4,5).

La resistencia a la penicilina, meticilina y vancomicina están codificadas por los genes blaZ (betalactamasa), mecA (PBP2a) y vanA (dipéptido D-alanina- D-alanina) respectivamente (6–10) .Según la OMS la resistencia a los antimicrobianos ha sido declarada como una amenaza en salud pública que enfrenta la humanidad (11).

El Stahpylococcus aureus forma parte de nuestro microbiota, y es causa de infecciones tanto comunitarias como hospitalarias. Los pacientes con infecciones por SARM tienen una probabilidad de 64% mayor de morir que los pacientes tratados con fármacos sensibles (12).

En el 2019, la ODS (Objetivos de Desarrollo Sostenible de las Naciones Unidas) realizó el seguimiento de la frecuencia de septicemias en 25 países, en la cual uno de los patógenos farmacorresistentes más reportado fue Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM) representado el 12.11% (12). Las cepas de S Staphylococcus aureus vancomicina-intermedio (VISA) tienen una susceptibilidad a la vancomicina de (CIMs >16µg/mL), El mecanismo de resistencia se debe en la mayoría de los casos al engrosamiento de la pared celular que contiene los precursores. La mayoría de cepas VISA son SARM, contienen el gen mecA. S. aureus con resistencia completa a la vancomicina (VRSA) con una (CIMs ≥32 µg/ mL), son muy raras y solo se ha descrito esta resistencia hasta a mediados del 2004 (13).

Dentro de las bacterias del grupo ESKAPE se encuentran los siguientes patógenos: Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa y Enterobacter species. Estos patógenos son de gran importancia clínica, puesto que causan la mayor parte de infecciones en el ámbito hospitalario, debido a que son organismos multidrogorresistentes (14).

En un estudio realizado en el Hospital de la ciudad de Cali – Colombia por Chávez, Martínez, y Mantilla (2017), en el personal de la salud y superficies hospitalarias, el microorganismo que se aisló en mayor porcentaje fue el Staphylococcus aureus con 21. 3%, en el personal de salud se detectó el 9.1 % y en el ambiente hospitalario en un 12.2% (15).

A nivel nacional en un estudio realizado por Cimera, Pérez año (2010) en el Hospital General de las Fuerzas Armadas, encontraron que la prevalencia de Staphylococcus aureus a nivel del personal de salud fue del 12% y SARM 1%. Además se identificaron factores de riesgo como: edad mayor a 60 años, diabetes mellitus, cambiarse de mandil una vez por semana e inadecuado lavado de manos (16).

El entorno hospitalario contribuye a la diseminación de patógenos, especialmente en el ambiente ocupado por pacientes previamente colonizados. La presencia de bacterias se puede encontrar en equipos médicos y colonizando superficies en un mayor porcentaje. Esta diseminación se debe en gran medida a la contaminación cruzada a través de las manos del personal de salud y los pacientes (17).

A nivel local en el Hospital José Carrasco Arteaga - Cuenca, realizado por Argudo, Piña, y Neira (2018) en el servicio de pediatría encontraron que el 16,67 % de las infecciones nosocomiales registradas corresponden a Staphylococcus aureus (18).

La resistencia a los antibióticos es considerada un desafío mundial para los sistemas de salud, por dos motivos: a) la capacidad de las bacterias de transmitir información genética mediante mecanismos de transferencia horizontal y b) la globalización que facilita enormemente la posibilidad de difundir esa resistencia en cortos períodos (19). La diseminación de la resistencia antimicrobiana entre cepas de S. aureus es de gran importancia en salud pública, puesto que este microorganismo ha desarrollado rápidamente resistencia a todos los antibióticos introducidos para uso clínico, esto lo convierte en uno de los patógenos más importantes, causantes de infecciones a nivel comunitario y nosocomial (4,5).

El objetivo de esta investigación fue determinar la resistencia de Staphylococcus aureus aislado en ambientes nosocomiales mediante la evaluación de la resistencia a penicilina, meticilina y vancomicina, a partir de métodos convencionales y moleculares

MATERIALES Y MÉTODOS

El estudio se llevó a cabo mediante el enfoque cuantitativo, bajo la modalidad de una investigación de campo, observacional, de corte transversal. Con relación a la muestra se aisló cepas de Staphylococcus aureus de 200 muestras de ambientes nosocomiales, entre ellos equipos médicos y superficies hospitalarias. En la segunda fase se buscó identificar los genes blaZ, mecA y vanA. El muestreo empleado fue de tipo no probabilístico por cobertura total, el cual se realizó con todas las normas de bioseguridad en una institución de salud de la provincia del Azuay-Ecuador

Criterios de Inclusión:

aislados que producen viraje de manitol y fueron verificados como Staphylococcus aureus por amplificación de los genes nucA y femB

Criterios de Exclusión:

Aislados que no viran el manitol y no amplifican los genes nucA y femB. Medios de cultivo sin crecimiento bacteriano o contaminado

Recolección de las muestras

Las muestras se tomaron mediante la técnica de hisopado de equipos médicos y superficies hospitalarias, las cuales fueron transportadas en caldo triptona soja.

Posteriormente las muestras fueron incubadas a 37°C por 24 horas en ambiente de aerobiosis para su crecimiento y proliferación

Aislamiento e identificación de S. aureus

El procesamiento de las muestras, se llevó a cabo en el Laboratorio de Genética y Biología Molecular del Centro de Investigación, Innovación y Transferencia de Tecnología (CIITT), donde se realizó el aislamiento en agar manitol salado y se confirmó mediante la identificación de los genes nucA y femB

Determinación fenotípica de susceptibilidad antibiótica para penicilina, meticilina y vancomicina

Se empleó el inoculo ajustando a la escala

0.5 Mcfarland para llevar a cabo el método de Kirby Bauer, con la utilización de sensidicos de Oxacilina (5ug), penicilina G (10 unidades) y vancomicina (30 µg), cumpliendo a cabalidad los lineamientos establecidos por el Clinical and Laboratory Standard Institute(CLSI, 2021) (20)

Extracción de ADN bacteriano

Para la extracción de ADN de las cepas de

S. aureus se utilizó el método de lisis alcalina descrito por los autores Andrade Carlos y Orellana Paola (2019) (21)

Identificación genotípica para la determinación de los genes de resistencia de S. aureus

Tabla 1
Tamaño de amplicones, secuencia de cebadores y perfil térmico de la PCR

Se empleó la técnica de PCR punto final para la detección molecular de los genes blaZ, mecA y vanA que codifican para resistencia penicilina, meticilina y vancomicina respectivamente (22–24). La amplificación de los genes se realizó de acuerdo a los protocolos indicados en la Tabla 1

Tabla 2
Controles positivos y negativos utilizados para la amplificación de los genes descritos

El volumen final de amplificación fue de 20 µL obtenidos de la siguiente manera: 10 µL de master mix Green GoTaq 2x (Promega), 5,5 µL de agua libre de nucleasas, 1.5 µL de ADN muestra y 1.5 µL de cada cebador. Los tubos de reacción se llevaron a un termociclador Bioneer (21).

La separación de los amplicones se realizó mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1,5% p/v, con 2µl Sybr safe en 50 ml de gel, en una cámara horizontal Thermo Electron Corporation Midicell® PrimoTM, Modelo EC330, USA a 70V, 32A y 50 W con fuente de poder programable Bio-Rad, Modelo Power-Pac Basic, USA durante 50 minutos. El resultado se revelo, en un transiluminador UV y se documentó con una cámara digital.

Para el análisis estadístico se generó una base de datos en el programa SPSS 21.0, se llevó a cabo mediante estadística descriptiva, análisis de frecuencia y medidas de asociación. Además, utilizamos el programa de Excel para la presentación de los resultados

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De las 200 muestras iniciales se aislaron 6 cepas que resultaron positivas para S. aureus, correspondiente al 3%. La identificación de las cepas se realizó mediante la amplificación de los genes nucA y femB.

Los resultados de las pruebas de susceptibilidad antibiótica mostraron que el 100% de las cepas de S. aureus aisladas, fueron resistentes a oxacilina y penicilina g; y sensibles a vancomicina, lo cual coincide con los resultados de PCR punto final, de la identificación de los genes blaZ, (Figura 1) mecA (Figura 2) y vanA (Figura 3) que codifican la resistencia a penicilina, meticilina y vancomicina respectivamente, como se aprecia en la Tabla 3. La distribución de las frecuencias de resistencias según el lugar de procedencia de la muestra, se puede apreciar en la Tabla 4

Tabla 3
Patrón de susceptibilidad antibiótica y genes de resistencia de Stahpylococcus aureus

Leyenda: ATB(antibiograma)

Tabla 4
Patrón de susceptibilidad antibiótica y genes de resistencia de Stahpylococcus aureus

Leyenda: N/A(no aplica debido a la ausencia de resistencia

Figura 1
Productos de PCR del gen blaZ con un amplicón de 674 pb. Carriles: 1 escalera alélica, 2 control positivo, 3 control negativo 4, 5, 6, 7,8 y 9 cepas positiva

Figura 2
Productos de PCR del gen mecA con un amplicón de 310 pb. Carriles: 1 escalera alélica, 2 control positivo, 3 control negativo 4, 5, 6, 7,8 y 9 cepas positivas

Figura 3
Productos de PCR del gen vanA con un amplicón de 732 pb. Carriles: 1 escalera alélica, 2 control positivo, 3 control negativo 4, 5, 6, 7,8 y 9 cepas negativas

Discusión

S. aureus es un patógeno oportunista que ocasiona enfermedades en individuos con el sistema inmunológico deprimido, y se asocia a elevadas tasas de morbilidad y mortalidad dentro de las áreas hospitalarias, comprometiendo así la vida de pacientes y personal sanitario. La aparición y diseminación de cepas SARM es uno de los problemas más importantes en salud pública, debido a que éstas son causantes de un alto porcentaje de infecciones nosocomiales difíciles de tratar, pues a menudo son multirresistentes (27,28).

En el presente estudio los resultados de fenotipificación y genotipificación mostraron que el 100%(6) de los aislamientos identificados como S aureus, fueron resistentes a la penicilina g y oxacilina, en comparación con la investigación realizada por A. Navascués (2004) en el hospital de Navarra, donde se determinó que los aislamientos de S aureus tenían un resistencia a la penicilina del 72.3% y oxacilina del 45.5% (29). De igual manera, la investigación desarrollada por Andrade, y Orellana P (2019) en superficies de un hospital de Cuenca, reportaron una resistencia a la penicilina y meticilina correspondiente al 66.6% (21).

Velázquez-Meza (2005) observó en los hospitales de tercer nivel un incremento muy importante de la prevalencia de SARM, desde1980 donde se reportó un 4%, hasta el 2001 en el que se identificó un 55%. Algunas de las cepas SARM no solo son resistentes a betalactámicos sino también a glucopéptidos como la vancomicina (30).

En otro estudio realizado por Sserwadda Lukenge (2018) sobre las superficies de trabajo de un hospital de Uganda, encontraron una frecuencia del 75.4% de S. aureus constituyéndose en el microorganismo de mayor prevalencia; además, se identificó un 52% de SARM (31). Esto podría atribuirse a la capacidad de adaptación de este patógeno a las superficies inertes por largos periodos.

En un estudio realizado por Armas Fernández (2015), en las superficies de un hospital de Cuba, la prevalencia de SARM fue del 50.6%. En otro estudio Lliya, y Mwangi (2020) reportaron una prevalencia de SARM de 47.0% en los centros de salud de Kenia (32). Estos porcentajes podrían deberse a la colonización previa de este patógeno, las medidas de asepsia y antisepsia del personal sanitario, y las condiciones higiénico- sanitarias de esos ambientes hospitalarios (33).

En este sentido, en muchas instituciones hospitalarias se puede encontrar SARM, el cual es causante de alrededor del 50% de infecciones nosocomiales, y de enfermedades como neumonía, bacteriemias etc., que requieren de elevados costos de tratamiento e incrementan los índices de mortalidad (33).

Según la guía de enfermedades infecciosas y clínicas de Stanford del año 2000, entre los factores de riesgo de infecciones nosocomiales causadasporcepasSARM,sepuedenmencionar: la estancia prolongada del paciente en la casa de salud, el uso indiscriminado de antibióticos en pacientes previamente colonizados por este patógeno, además de infecciones por intervenciones quirúrgicas. Debido a su alto impacto y prevalencia es importante establecer programas de vigilancia y control en los centros hospitalarios (34).

El Ministerio de salud pública (MSP) en el 2014 reportó que en los aislados hospitalarios provenientes de UCI, se encontró una resistencia de S. aureus a la penicilina del 87%, un 46% de resistencia a la meticilina, y 12% de resistencia a la vancomicina. Para el año 2017 el porcentaje de resistencia de la penicilina disminuyó al 80%, así como también de la meticilina al 35% y la vancomicina al 2% (35). Es posible que el conocimiento del perfil de susceptibilidad, apoye el uso racional de los antimicrobianos y dé como resultado la disminución de las resistencias.

Bajo este contexto, los glucopéptidos como la vancomicina y teicoplanina constituían la única opción de tratamiento para pacientes con infecciones por cepas SARM, pero en 1990 se presentaron los primeros reportes de cepas con sensibilidad disminuida a vancomicina, y el uso inadecuado ha generado cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la vancomicina (VRSA) y cepas de Staphylococcus aureus de resistencia intermedia (VISA) (33)

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en este estudio evidenciaron la presencia de SARM en las diferentes áreas hospitalarias, constituyéndose en un factor de riesgo de transmisión horizontal entre el personal sanitario y los pacientes, por lo cual es de gran importancia evaluar y establecer medidas rigurosas de prevención, control y diseminación de SARM para disminuir el riesgo de infecciones futuras. Además, sería importante realizar estudios epidemiológicos que permitan conocer más acerca del comportamiento de las cepas SARM.

Importancia y Limitaciones: De 200 muestras tomadas en superficies hospitalarias se aislaron 6 cepas de S. aureus, de las cuales el 100% fueron resistentes a la meticilina. Si bien la prevalencia de S. aureus en este estudio es muy baja (3%), posiblemente debido a que el trabajo se realizó durante la pandemia de Covid-19, cuando se extremaban las medidas de prevención, es importante resaltar el elevado porcentaje de cepas SARM

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