ACTIVIDADES ANTIMICROBIANAS Y ANTIFÚNGICAS DE LOS EXTRACTOS ALCOHÓLICOS DE Passiflora edulis Y Citrus x sinensis

ANTIMICROBIAL AND ANTIFUNGAL ACTIVITIES OF ALCOHOLIC EXTRACTS FROM Passiflora edulis AND Citrus x sinensis

Aveiga Zambrano, Marcia Eduarda; Sánchez López, Liz Yanaina; Santacruz Terán, Stalin Gustavo

Marcia Eduarda Aveiga Zambrano

Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí Ecuador

Liz Yanaina Sánchez López

Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí Ecuador

Stalin Gustavo Santacruz Terán

stalin.santacruz@uleam.edu.ec

Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí Ecuador

Revista ESPAMCIENCIA

Escuela Superior Politécnica Agropecuaria de Manabí, Ecuador

ISSN: 1390-8103

Periodicidad: Semestral

vol. 13, núm. 2, 2022

revista@espam.edu.ec

Recepción: 30 Junio 2022

Aprobación: 21 Diciembre 2022

URL: http://portal.amelica.org/ameli/journal/527/52742045274204007/

DOI: https://doi.org/10.51260/revista_espamciencia.v13i2.349

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Resumen: En el presente trabajo se estudió el poder inhibitorio de los extractos alcohólicos de los subproductos agroindustriales de naranja y maracuyá frente a cuatro bacterias: Listeria monocytogenes, Streptococcus mutans, Salmonella spp., Escherichia coli y dos hongos: Penicillium sp, y Rhizopus spp. Para ello, los extractos alcohólicos del epicarpio-albedo de maracuyá y del exocarpo-mesocarpio de la naranja en concentraciones de 0,05 y 0,1% se aplicaron a cepas de los seis microorganismos y se determinó la zona de inhibición y la curva de crecimiento durante 24 h. Los resultados mostraron que la mayor concentración de los extractos (0,1%) de ambas frutas formó zonas de inhibición de mayor diámetro. Las bacterias fueron más resistentes a los extractos de la naranja en comparación con los de maracuyá, con inhibiciones completas a las 24 y 6 h, respectivamente. Por otro lado, se observó que la inhibición completa de los hongos fue a partir de las 4 horas por acción de extractos de las dos frutas en estudio.

Palabras clave: ompuestos fenólicos, inhibición, Passiflora edulis, Citrus sinensis, bacterias, hongos.

Abstract: In the present work, the inhibitory power of the alcoholic extracts of the agro-industrial by-products of orange and passion fruit was studied against four bacteria: Listeria monocytogenes, Streptococcus mutans, Salmonella spp., Escherichia coli and two fungi: Penicillium sp, and Rhizopus spp. The alcoholic extracts of orange and passion fruit peels in concentrations of 0,05 and 0,1% were applied to strains of the six microorganisms and the zone of inhibition and the growth curve along 24 h were determined. The results showed that the highest concentration of the extracts (0,1%) of both fruits formed inhibition zones of larger diameter. The bacteria were more resistant to orange extracts compared to passion fruit extracts, with complete inhibition at 24 and 6 h, respectively. On the other hand, the complete inhibition of the fungi was after 4 hours of action of extracts of the two fruits.

Keywords: Phenolic compounds, inhibition, Passiflora edulis, Citrus sinensis, bacteria, fungi.

INTRODUCCIÓN

Los desechos o subproductos agrícolas a nivel mundial son generados en grandes volúmenes, siendo sólo una mínima parte de ellos reutilizada (Ojeda y Cáceres, 2002), por lo que representan un problema ambiental (Londoño-Londoño et al., 2012).

A partir de los años 60, el mercado de los jugos y conservas de frutas empezó a desarrollarse en el Ecuador. Gracias al clima favorable del país, es posible el cultivo de varias frutas para la elaboración de bebidas y néctares; entre las que se encuentran maracuyá y naranja (Plaza, 2018).

El procesamiento del maracuyá genera alrededor del 75% de subproductos, respecto al peso de la fruta, mientras que el de la naranja produce entre 45 y 60% de subproductos. Los subproductos del maracuyá son utilizados como material coadyuvante a la fermentación de yogurt (Do Espírito Santo et al., 2012) o potenciador de aromas (Leão et al., 2014), mientras que los de naranja son utilizados para la alimentación de rumiantes, obtención de aceites esenciales (Gonzales, 2007) y pectina (Rentería, 2014).

Los compuestos fenólicos, que se presentan de forma natural en las frutas y vegetales, poseen actividad antioxidante (Pérez-Nájera et al., 2013), actividad bacteriostática, fungicida y viricida, siendo más efectivos sobre las bacterias gram-positivas que sobre las gram-negativas (Abud-Blanco et al., 2015).

El consumo frecuente de frutas y vegetales está asociado a la mayor ingesta de compuestos fenólicos de carácter antioxidante, que conducen al menor desarrollo de enfermedades crónicas como las enfermedades cardiovasculares (Tenea y Lara, 2019).

La actividad antimicrobiana de los compuestos fenólicos es de gran interés para aplicaciones en la industria de alimentos, debido a la mayor aceptación que tiene el consumidor hacia los productos naturales y al uso más restringido de los compuestos sintéticos, dada la toxicidad de estos últimos (Amensour et al., 2010). Las técnicas de extracción de compuestos fenólicos empleadas son las convencionales con solventes (Alara et al., 2018) y no convencionales como las asistidas con microondas (Alara and Abdurahman, 2019), asistidas con ultrasonido (Shirzad et al., 2017) y con fluidos supercríticos (De Zordi et al., 2014).

Con base en lo expuesto, el presente trabajo tuvo como objetivo investigar si los extractos alcohólicos del epicarpio-albedo de maracuyá (Passiflora edulis) y del exocarpo-mesocarpio de la naranja (Citrus sinensis), poseen propiedades inhibitorias in vitro frente a dos bacterias gram-positivas Listeria monocytogenes y Streptococcus mutans, dos bacterias gram-negativas Salmonella spp, Escherichia coli y dos hongos Penicillium sp. y Rhizopus spp.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las muestras de exocarpo-mesocarpio de naranja (EM naranja) se las obtuvo de un local de expendio de jugos de fruta, mientras que las de epicarpio-albedo de maracuyá (EA maracuyá) de frutas adquiridas en un mercado local, ambos de la ciudad de Manta, Ecuador.

Las muestras de EA maracuyá y de EM naranja se secaron en una estufa a una temperatura de 50°C. Una vez secos, los materiales se trituraron con ayuda de un molino casero (molino Corona, Colombia) y posteriormente se tamizaron, desechándose las partículas con tamaño superior a 1 mm.

Se utilizaron cepas de Escherichia coli (ATCC CECT-4076), Salmonella spp. (ATCC CECT-708), Listeria monocytogenes (ATCC CECT-5672) que fueron aisladas de queso perteneciente a una Colección Española de Cultivos Tipo (CECT). La cepa de Streptococcus mutans ATCC 35668, mientras que las cepas de Penicillium y Rhizopus fueron aisladas de mandarina y papaya respectivamente.

Extracción alcohólica

La extracción alcohólica se realizó de acuerdo con el método propuesto por Slinkard y Singleton (1977), 15 g del material molido se mezclaron con 150 mL de etanol (95% v/v) con agitación constante durante 24 h a 20°C. La mezcla obtenida se filtró y el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio hasta que se obtuvo un residuo seco (Espinosa y Santacruz, 2017).

Curva de crecimiento

Para la realización de la curva de crecimiento se empleó el método propuesto por Puupponen et al. (2001). Se inoculó 10 mL de agua de peptona con 1 o 5% del cultivo (dependiendo del microorganismo) y posteriormente el extracto alcohólico, previamente extraído, se agregó en concentraciones de 0,05 y 0,1%. La solución preparada se inoculó en medios de cultivo específicos, agar Salmonella-Shigella (Tm media, India) para las bacterias Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Escherichia coli, mientras que para Streptococcus mutans se usó el medio de cultivo agar sangre de cordero (Bioxon, México). Las muestras se diluyeron con agua de peptona para luego ser sembradas por triplicado en cajas Petri de 6 cm de diámetro, e incubadas a 37°C por 24 h. Se tomaron muestras del crecimiento bacteriano para los tiempos de 2, 4, 6, 8 y 24 h de incubación, para realizar un recuento de microorganismos haciendo uso de un contador de colonias (Suntex, Taiwan).

Inhibición in vitro de microorganismos

La actividad antimicrobiana de los extractos se determinó según CLSI (2009). Se inoculó el microorganismo a analizar en medio de cultivo agar y se incubó a 37°C durante 24 h. Se sumergieron discos de papel de filtro (Fisher Scientific Q2) de diámetro de 5 mm en una solución de los extractos con concentraciones de 0,05 y 0,1 %. Los discos se colocaron en el centro de una placa de Petri en donde se había sembrado previamente el microorganismo, para luego incubarla a 37°C durante 2 días. El diámetro de la zona de inhibición se midió después de 24 h por triplicado y se clasificó de la siguiente manera: no inhibición (6 mm), ligera inhibición (6 a 8 mm), inhibición moderada (8 a 10 mm), +++: inhibición fuerte (>10 mm).

Diseño experimental

Se utilizó un arreglo factorial 2x2 en un diseño completamente al azar correspondiente al uso de dos factores: residuo de la fruta, con dos niveles (epicarpio-albedo del maracuyá y exocarpo-mesocarpio de la naranja) y concentración del extracto alcohólico, con dos niveles (0,05 y 0,1 %).

Análisis estadístico

Se utilizó el paquete estadístico Infostat (Infostat versión 2014, Argentina) para el análisis de varianza y la prueba de medias con el test de Tukey (p≤0,05 %). Todas las medidas se realizaron por triplicado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Inhibición in vitro de bacterias gram-positivas (Listeria monocytogenes, Streptococcus mutans) frente a extractos alcohólicos

Los resultados (Cuadro 1) mostraron una relación directa entre la concentración del extracto alcohólico y el diámetro de la zona de inhibición, sin que existan diferencias (p≤0,05). La concentración al 0,1% del extracto de EM naranja tuvo el mayor efecto inhibitorio sobre Listeria monocytogenes y S. mutans, y fue diferente al producido por el extracto de EA maracuyá al 0,05% (Cuadro 1). La inhibición de EM naranja al 0,1% sobre L. monocytogenes fue fuerte, mientras que para EA maracuyá al 0,05% sobre S. mutans fue ligera. Las diferencias en inhibición podrían ser el resultado de diferentes compuestos fenólicos presentes en las frutas analizadas. En ambos casos, el poder inhibitorio de los compuestos fenólicos sobre las bacterias gram-positivas puede deberse a su capacidad de afectar la pared celular de las bacterias (Puupponen et al., 2001). Corzo (2012) mostró la acción inhibitoria de los compuestos fenólicos de frutas sobre bacterias gram-positivas, con zonas de inhibición de 10 mm de diámetro a una concentración de 100 µg/µl. Resultados de inhibición similares, 10,67 mm, fueron obtenidos en la presente investigación a concentraciones menores de extracto (0,1%). Kim y Shin (2012) mostraron que los extractos de semilla de Citrus trifoliate tuvieron actividad inhibitoria contra Listeria pero no contra S. mutans. En este último caso, la falta de acción inhibitoria contra S. mutans podría deberse a la variedad de naranja utilizada.

Cuadro 1.

Resultados del diámetro de la zona de inhibición de soluciones de extractos de EA maracuyá y EM naranja sobre Listeria monocytogenes y Streptococcus mutans

Tratamiento (concentración del extracto alcohólico, %) | Listeria monocytogenes | Streptococcus mutans
Diámetro de la zona de inhibición (mm)
M (0,05)1 | 8,22++A | 7,67+A
M (0,1) 1 | 9,22++A,B | 9,00++A,B
N (0,05) 2 | 9,11++A,B | 8,44++A,B
N (0,1) 2 | 10,67+++B | 9,33++B

Valores promedios seguidos de letras superíndices diferentes indican diferencia estadística por la prueba de Tukey (p≤0,05 %).

-: no inhibición (6 mm), +: ligera inhibición (6 a 8 mm), ++: inhibición moderada (8 a 10 mm), +++: inhibición fuerte (>10 mm).

1M: extracto alcohólico del EA maracuyá

2N: extracto alcohólico del EM naranja

Inhibición in vitro de extractos alcohólicos frente a bacterias gram-negativas (Salmonella spp, Escherichia coli)

Los resultados (Cuadro 2) mostraron una relación directa entre la concentración del extracto alcohólico y el diámetro de la zona de inhibición solo para EM naranja, siendo mayor la inhibición para la más alta concentración (p≤0,05). La concentración al 0,1% de extracto alcohólico de EM naranja y EA maracuyá tuvieron el mayor efecto inhibitorio sobre Salmonella spp. (Cuadro 2), mientras que los extractos de EA maracuyá al 0,05% tuvieron la menor inhibición (p≤0,05). La concentración del extracto alcohólico de EA maracuyá al 0,1% tuvo el mayor efecto inhibitorio sobre la bacteria Escherichia coli, mientras que el menor efecto inhibitorio fue el obtenido por el extracto de EM naranja al 0,1%, p≤0,05 (Cuadro 2). La inhibición de EM naranja al 0,1% sobre Salmonella spp fue fuerte, mientras que contra E. coli fue ligera. Así mismo los extractos de EA maracuyá al 0,05% tuvieron una ligera acción antimicrobiana sobre E. coli.

Según Tahera et al. (2014) los extractos alcohólicos (mentanol y etanol) tuvieron efecto inhibitorio contra Salmonella spp, mientras que los extractos acuosos no tuvieron ningún efecto contra el microorganismo. Esto sugiere la existencia de actividad antimicrobiana de los compuestos extraídos con alcoholes. Extractos etanólicos de tallos de maracuyá mostraron actividad antimicrobiana contra E. coli, con una zona de inhibición de diámetro entre 7 y 9 mm, pero no contra Salmonella spp (Aernan et al., 2013). Al parecer la eficiencia del extracto depende no solo del solvente utilizado, sino de la concentración utilizada (Mohanasundari et al., 2007).

Cuadro 2.

Resultados de la zona de inhibición de extracto alcohólico de EA maracuyá y EM naranja sobre Salmonella spp. y Escherichia coli

Tratamiento | Salmonella spp | Escherichia coli
Diámetro de la zona de inhibición (mm)
M (0,05)1 | 7,89+A | 8,33++A,B
M (0,1) 1 | 9,22++A,B | 9,78++B
N (0,05) 2 | 8,44++A | 8,78++A,B
N (0,1) 2 | 10,22+++B | 7,67+A

Valores promedios seguidos de letras superíndices diferentes indican diferencia estadística por la prueba de Tukey (p≤0,05 %).

-: no inhibición (6 mm), +: ligera inhibición (6 a 8 mm), ++: inhibición moderada (8 a 10 mm), +++: inhibición fuerte (>10 mm).

1M: extracto alcohólico del EA maracuyá

2N: extracto alcohólico del EM naranja

Inhibición in vitro de extracto alcohólico de EM naranja y EA maracuyá frente a hongos (Penicillium sp y Rhizopus spp)

Los resultados mostraron una relación directa entre concentración del extracto alcohólico y el diámetro de la zona de inhibición (p≤0,05), con excepción del EM naranja sobre Penicillium sp. La concentración al 0,05% de extracto alcohólico de EA maracuyá tuvo el menor efecto inhibitorio sobre Penicillium, en relación a los otros tres tratamientos, los cuales fueron similares entre sí (p≤0,05) (Cuadro 3). Los extractos alcohólicos de EM naranja y EA maracuyá a 0,05% tuvieron iguales efectos de inhibición sobre Rhizopus, que los extractos de EM naranja a la misma concentración, siendo menores al efecto inhibitorio de EM naranja y EA maracuyá al 0,01%, p≤0,05 (Cuadro 3). La acción inhibitoria de extractos de EA maracuyá al 0,05% fue ligera sobre ambos hongos, así como los de EM naranja al 0,05% sobre Rhizopus spp. No hubo acción inhibitoria fuerte de ninguno de los extractos sobre los hongos estudiados.

Christ-Ribeiro et al. (2019) emplearon extractos del pericarpio de arroz y spirulina e inhibieron el crecimiento de Penicillium verrucosum y Rhizopus oryzae en el 39,8 y 20,2%, respectivamente. A pesar de no poder comparar directamente los resultados con los del presente estudio, es evidente la presencia de compuestos fenólicos con efecto antifúngico en ambos casos.

Cuadro 3

Resultados del diámetro de la zona de inhibición de extracto alcohólico de EA maracuyá y EM naranja sobre Penicillium y Rhizopus

Tratamiento | Penicillium sp. | Rhizopus spp.
Diámetro de la zona de inhibición (mm)
M (0,05)1 | 7,67+A | 7,44+A
M (0,1)1 | 9,22++B | 9,11++B
N (0,05)2 | 9,11++B | 7,67+A
N (0,1)2 | 9,56++B | 9,0++B

Valores promedios seguidos de letras superíndices diferentes indican diferencia estadística por la prueba de Tukey (p≤0,05 %)

-: no inhibición (6 mm), +: ligera inhibición (6 a 8 mm), ++: inhibición moderada (8 a 10 mm), +++: inhibición fuerte (>10 mm).

1M: extracto alcohólico del EA maracuyá

2N: extracto alcohólico del EM naranja

Curvas de crecimiento de Listeria monocytogenes, Streptococcus mutans, Salmonella spp, Escherichia coli, Penicillium sp, y Rhizopus spp frente a extractos alcohólicos de EM naranja y EA maracuyá

En la figura 1 se puede observar que las UFC (normalizadas) de Listeria monocytogenes y Streptococcus mutans en presencia de extractos alcohólicos de EA maracuyá y EM naranja a la concentración de 0,1% disminuyó en un período de 6 h, luego de lo cual se redujo la velocidad de disminución. Los extractos de EA maracuyá produjeron una mayor reducción de las UFC frente a estas dos bacterias gram-positivas en relación a los de EM naranja en el transcurso de las 24 h de estudio. Según Pupponen et al. (2001) las variaciones de poder inhibitorio encontradas pueden deberse a las diferencias estructurales de las superficies celular de las bacterias.

Figura 1.
Curva de crecimiento de (a) Listeria monocytogenes y (b) Streptococcus mutans frente a extractos alcohólicos de EM naranja (rombos sombreados) y EA maracuyá (cuadrados sombreados) al 0,1%

En la figura 2a, se observa que la inhibición de Salmonella spp. a partir de las 6 h de análisis fue completa bajo la acción de extractos de EA maracuyá a la concentración de 0,1%, siendo esta inhibición mayor que la de EM naranja. En el Figura 2b, se puede observar que la bacteria Escherichia coli se inhibió completamente a las 6 h de estudio en presencia de extractos de las dos frutas.

Figura 2.
Curva de crecimiento de (a) Salmonella spp y (b) Escherichia coli frente a extractos alcohólicos de EM naranja (rombos sombreados) y EA maracuyá (cuadrados sombreados) al 0,1%

La inhibición total de Rhizopus spp y Penicillium sp se da a partir de las 4 y 6 horas respectivamente (Figura 3) mediante el empleo de extractos alcohólicos tanto de EM naranja como de EA maracuyá a una concentración del 0,1%.

Carrillo-Inungaray et al. (2006) mostraron que la inhibición de Penicillium digitatum y Rhizopus oryzae en presencia de soluciones con solutos de carácter orgánico e inorgánico se debe a la disminución de la actividad de agua. Posiblemente, la presencia de compuestos fenólicos podría producir cambios de actividad de agua que también contribuyan a la inhibición de los microorganismos.

Figura 3.
Curva de crecimiento de (a) Penicillium sp y (b) Rhizopus spp frente a extractos alcohólicos de EM naranja (rombos sombreados) y EA maracuyá (cuadrados sombreados) al 0,1%

CONCLUSIONES

Soluciones de extractos alcohólicos en concentraciones del 0,1%, de exocarpo-mesocarpio de naranja y epicarpio-albedo de maracuyá, tuvieron el mayor poder inhibitorio frente a Listeria monocytogenes, Streptococcus mutans, Salmonella spp, Escherichia coli, Penicillium sp, y Rhizopus spp. El método de difusión de discos mostró que las bacterias fueron más inhibidas por los extractos del exocarpo-mesocarpio de la naranja y los del epicarpio-albedo del maracuyá en relación a los hongos, con inhibiciones completas entre las 6 y 24 h. Por otro lado, se observó que la inhibición completa de los hongos se dio entre las 4 y 6 h, por acción de ambos extractos.

LITERATURA CITADA

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