PENDAHULUAN

SARS CoV-2 merupakan virus baru yang pertama kali ditemukan di Wuhan, China pada akhir tahun 2019 dan menyebar hampir ke seluruh Negara di dunia (Phelan et al., 2020). Organisasi kesehatan dunia (WHO) mengumumkan pada awal tahun 2020 bahwa penyakit COVID-19 sebagai keadaan darurat kesehatan masyarakat. Di Indonesia, kasus COVID-19 pertama dan kedua diumumkan pada tanggal 12 Maret 2020. Berdasarkan kasus yang ditemukan, mulai teridentifikasi klaster-klaster dari SARS CoV-2 yang tersebar di beberapa wilayah di Indonesia. Hingga awal tahun 2022, persebaran semakin meningkat hingga tercatat beberapa varian baru terutama varian Delta dan Omicron (Turista et al., 2020). Salah satu daerah di Indonesia tercatat sebagai daerah dengan tingkat kasus tergolong tinggi adalah Provinsi Jawa Tengah (Philips & Wicaksono, 2020)

Berbagai teknik molekuler banyak digunakan untuk mendeteksi keberadaan dari SARS CoV-2 seperti deteksi gen spesifik, genotyping hingga pengurutan asam nukleat. Whole genome sequencing (WGS) merupakan salah satu metode pengurutan asam nukleat secara utuh. Metode tersebut diketahui memiliki keunggulan lebih dibandingkan dengan metode lain, misalnya targeted sequencing. Whole genome sequencing mampu mendeteksi perubahan asam nukleat yang terjadi pada semua gen sehingga metode tersebut dijadikan sebagai metode monitoring perkembangan dan persebaran SARS CoV-2 di suatu wilayah. Beberapa penelitian menunjukan bahwa metode WGS berhasil digunakan pada genome virus SARS CoV-2 untuk mengetahui mutasi, pemetaan persebaran hingga deteksi beberapa varian baru (Gunadi et al., 2020; Massi et al., 2022). Di Indonesia, metode WGS masih sangat jarang sekali dilakukan. Hal tersebut karena metode WGS merupakan cara baru dan proses pengerjaannya yang memerlukan pelatihan keterampilan lanjutan.

Pengembangan dan perbaikan metode WGS perlu dilakukan guna mendapatkan hasil secara maksimal. Optimasi dapat dilakukan sebagai langkah untuk mengetahui komponen-komponen yang digunakan serta proses dalam pengerjaan. Primer merupakan komponen yang sangat penting dalam persiapan sampel amplikon. Laju mutasi yang sangat cepat dari SARS CoV-2 diduga menjadi faktor yang mempengaruhi dalam keberhasilan amplifikasi Polymerase Chain Reaction dan sekuensing. Selain itu, untuk mengevaluasi hasil sekuensing ada beberapa indikator penting yang dapat terapkan sebagai luaran kualitas dari hasil pengerjaan WGS yaitu nilai cluster density, passing filter dan Q30. Nilai indikator tersebut dibandingkan dengan nilai standar sesuai dengan instrumen dan reagen kit yang digunakan sehingga didapatkan nilai untuk mengevaluasi pengerjaan proses sekuensing. Menurut Kastanis et al. (2019) dalam percobaannya menggunakan lima instrumen miseq sequencing untuk mancari metode dan indikator penting dalam mendapatkan kualitas hasil standar. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui dan evaluasi berdasarkan indikator penting dalam pengerjaan whole genome SARS CoV-2 di Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Provinsi Jawa Tengah.

METODE

Penelitian dilakukan secara survei. Sampel didapatkan dan dikumpulkan dari beberapa laboratorium dan rumah sakit di Jawa Tengah, Jawa barat, Banten dan Jakarta untuk dilakukan observasi. Secara umum, tahapan yang dilakukan dalam mengerjakan whole genome sequencing meliputi pengumpulan sampel, preparasi sampel, preparasi perpustakaan DNA, sekuensing dan analisis data. Penelitian ini terdiri dari empat batch pengerjaan dengan jumlah sampel dalam setiap batch sebanyak 96 sampel. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biomolekuler, Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah pada bulan Maret hingga Juli 2022.

Pengumpulan Sampel

Sampel dikumpulkan dari beberapa laboratorium dan rumah sakit dari lokasi asal yang berbeda. Sampel yang didapatkan merupakan sampel positif COVID-19 dan untuk observasi lebih lanjut hingga analisis whole genome. Pengambilan sambel dari hasil swab nasofaring dan dihomogenkan dalam viral transport medium untuk disimpan pada suhu -20℃.

Ekstraksi RNA Virus

Ekstraksi RNA virus menggunakan Singuway Extraction RNA Kit dengan mesin automatic extraction mengikuti penelitian yang sebelumnya telah dimodifikasi (Xiong et al., 2020). Sebanyak 25µl larutan ilution buffer diambil dari plate yang akan digunakan dengan tujuan untuk meningkatkan kosentrasi RNA hasil ekstraksi. Kemudian sebanyak 200µl larutan viral transport medium (VTM) yang berisi sampel virus hasil swab dimasukan ke dalam plate sesuai kode sampel yang ditentukan. Masukan plate ke dalam mesin ekstraksi dan jalankan sesuai program yang digunakan.

Preparasi Perpustakaan DNA

Persiapan perpustakaan DNA menggunakan reagen Illumina COVIDSeq Test yang kemudian dilakukan beberapa modifikasi untuk dapat disesuaikan dengan kondisi dilaboratorium. Anneal RNA dilakukan dengan menyiapkan plate PCR. Sebayak 8,5µL dimasukan ke dalam setiap well-plate PCR. Tambahkan sebanyak 8,5µL sampel hasil ekstraksi ke dalam well. Tutup plate menggunakan seal dan shake dengan kecepatan 1,000xg selama 1 menit kemudian masukan dalam mesin PCR untuk running. Selanjutnya synthesis first strain cDNA dilakukan dengan menyiapkan mastermix yang berisi larutan first strain mix dan RVT. Sebanyak 8µL mastermix dimasukan ke dalam well plate yang berisi sampel hasil anneal RNA. Seal dan shake dengan kecepatan 1.000x g selama satu menit kemudian masukan plate dalam mesin PCR untuk running. Selanjutnya yaitu amplify DNA virus yang dilakukan dengan membuat dua mastermix yang berbeda yaitu mastermix berisi primer pool versi V3 dan V4 yang dilakukan pada batch yang berbeda (Clark et al., 2022). Sebanyak dua plate PCR disiapkan untuk mastermix pertama dan kedua. Sebanyak 20µl mastermix dimasukan ke dalam well sesuai plate. Tambahkan sebanyak 5µl sampel cDNA ke dalam well satu dan dua. Seal dan shake dengan kecepatan 1.000x g selama 1 menit kemudian masukan dalam mesin PCR untuk running (Bhoyar et al., 2021).

Langkah selanjutnya yaitu tagmentation yang dilakukan dengan menyiapkan mastermix berisi EBLTs, TB1 dan Nuclease free water. Campurkan hasil amplifikasi PCR primer pool 1 dan primer pool 2 masing-masing 10µl sesuai kode sampel pada plate baru. Tambahkan sebanyak 30µl mastermix kesetiap well yang berisi sampel. Seal dan shake dengan kecepatan 1000x g selama 1 menit. Kemudian masukan pada mesin PCR untuk running. Setelah PCR selesai, tambahkan sebanyak 10µl ST2 ke dalam setiap well. Seal dan shake dengan kecepatan 1000x g selama satu menit. Lakukan inkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Tempatkan plate sampel pada magnetic stand selama 3 menit. Buang semua supernatant dan lakukan pencucian menggunakan TWB sebanyak dua kali. Langkah selanjutnya yaitu amplify tagmentation dilakukan dengan cara menyiapkan mastermix yang berisi EPM HT dan Nuclease free water. Sebanyak 40µl mastermix dan 10µl index ditambahkan pada setiap sampel yang telah dicuci. Seal dan shake dengan kecepatan 1000x g selama 1 menit. Kemudian masukan plate ke dalam mesin PCR untuk di running (Bhoyar et al., 2021).

Langkah selanjutnya yaitu pool and clean up libraries dilakukan dengan cara mengambil sebanyak 5µl dari setiap sampel dan dimasukan pada mikrotube 2ml, tambahkan sebanyak 396 ITB ke dalam tube dan inkubasi selama 5 menit pada suhu ruang. Letakan tube pada magnetic stand selama 3 menit. Buang semua supernatant lalu tambahkan 1ml ethanol 80% dan inkubasi selama 30 detik. Lakukan langkah tersebut sebanyak dua kali. Bersihkan semua sisa ethanol hingga benar-benar bersih, lalu tambahkan sebanyak 50µl Resuspen buffer ke dalam tube. Vortex dan spindown tube kemudian inkubasi selama 2 menit. Letakan kembali tube pada magnetic stand selama 2 menit. Sebanyak 20µl supernatant diambil dan dimasukkan pada tube baru sebagai stok. Langkah selanjutnya yaitu normalisasi dan pengenceran dilakukan dengan cara sebanyak 2µl sampel dari stok diencerkan menggunakan RSB dengan hasil pengenceran 10 kali. Hasil pengenceran di lakukan quantify menggunakan qubit untuk mengetahui nilai kosentrasi. Hasil pengenceran 10 kali kemudian diencerkan kembali menjadi 4nm. Hasil pengenceran 4nm kemudian dilakukan pembukaan untai DNA hingga menjadi untai tunggal menggunakan NaOH 10%. Lakukan pengenceran hingga kosentrasi akhir yaitu 10pm untuk dimasukkan pada mesin Illumina Miseq sequencing (Pillay et al., 2020).

Pengolahan dan Analisis Data

Analisis data hasil penelitian dilakukan secara deskriptif. Hasil sekuensing berupa FASTQ dianalisis menggunakan program sequencing analysis viewer yang menghasilkan nilai cluster density, passing filter dan Q30. Data yang didapatkan kemudian dibandingkan untuk evaluasi pengerjaan yang didasarkan pada keberhasilan sequencing. Parameter keberhasilan sekuensing dalam penelitian ini yaitu didapatkannya hasil analisis Dragen COVID lineage.

HASIL

Pengerjaan whole genome sequencing diawali dengan proses ekstraksi RNA virus SARS CoV-2. Kemudian dilakukan amplifikasi PCR untuk proses penempelan enzim reverse transcriptase serta penggandaan secara invitro.

Gambar 1
Visualisasi Hasil Amplifikasi PCR
No. 1 dan No. 12 DNA Marker 100bp, No. 2-9 sampel setiap batch, No. 10 kontrol negatif, No. 11 kontrol positifDOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v15i1.706.g734

Gambar 2
Tampilan Hasil Analisis Sequencing Analysis Viewer (SAV) WGS Batch 18 menggunakan Instrumen Miseq
DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v15i1.706.g735

Proses amplifikasi PCR berhasil yang ditandai dengan pita DNA hasil visualisasi gel elektroforesis dengan panjang produk 400bp. DNA marker digunakan sebagai standar untuk mengetahui panjang produk hasil amplifikasi. Visualisasi yang dilakukan pada penelitian ini diambil dari dua sampel secara acak pada setiap batch untuk mengetahui keberhasilan dalam mendapatkan materi genetik serta penggandaan RNA virus. Sebanyak delapan sampel visualisasi hasil PCR yang menunjukan keberhasilan sesuai dengan kontrol positif pada well nomor 11 yaitu 400bp, dan kontrol negative pada well 10 menunjukan hasil yang sesuai di mana PCR yang dilakukan tanpa materi virus (Gambar 1).

Whole genome sequencing dilakukan dengan empat kali running pada batch 12, 14, 17 dan 18. Dua set primer artic digunakan sebagai pembanding yaitu primer versi V3 dan V4 yang digunakan pada masing-masing 2 batch. Primer versi V3 digunakan pada batch 12 dan 14 sedangkan primer versi V4 digunakan pada batch 17 dan 18.

Tabel 1
Jenis Primer dan Persentase Keberhasilan

DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v15i1.706.g735

Sebanyak 384 sampel dalam empat batch dengan masing-masing batch terdiri dari 96 sampel menunjukan hasil persentase keberhasilan yang bervariasi antar batch. Persentase keberhasilan menunjukan keberhasilan meningkat dari batch 12 hingga batch 18 dengan masing-masing persentase berturut-turut 61%, 73%, 95% dan 100%. Perbedaan dua batch pertama yaitu 12 dan 14 dengan dua batch terakhir yaitu 17 dan 18 pada penelitian ini diduga karena primer yang digunakan berbeda. Dua batch pertama, primer yang digunakan merupakan primer pool artic versi V3 sedangkan dua batch terakhir, primer yang digunakan yaitu primer pool artic versi V4. Primer pool artic versi V4 menunjukan hasil yang lebih stabil dibandingkan dengan primer pool artic versi V3 yang ditunjukan dengan persentase keberhasilan yang lebih tinggi (Tabel 1).

Hasil sekuensing dilakukan analisis untuk evaluasi proses pengerjaan whole genome sequencing. Analisis dilakukan dengan menggunakan program sequencing analysis viewer (SAV) dari Illumina. Program tersebut dapat digunakan untuk melihat beberapa indikator untuk menilai hasil sekuensing.

Tabel 2
Hasil Analisis WGS menggunakan SAV

DOI: https://doi.org/10.36990/hijp.v15i1.706.g737

Setiap indikator untuk melihat kualitas hasil sekuensing menunjukan nilai yang bervariasi di setiap batch pengerjaan. Indikator dari cluster density tertinggi ditunjukan pada batch 18 di mana nilai tersebut merupakan nilai yang optimal yaitu 1379±32. Nilai cluster density pada batch 12, 14 dan 17 menunjukan nilai yang rendah (under cluster) yaitu 839±24-1086±25. Nilai cluster PF pada batch 14, 17 dan 18 menunjukan nilai yang optimal yaitu 92,88±0,57%-96,66±0,58%. Namun pada batch 12 nilai yang rendah yaitu 55,10±36,69. Kemudian nilai Q30 dengan nilai optimal pada setiap batch yaitu 91,84%-95,68% (Tabel 2).

PEMBAHASAN

Whole genome sequencing merupakan salah satu aplikasi dari next generation sequencing yang penggunaannya menjadi tren dalam mencari informasi genetik suatu organisme (Park & Kim, 2016). Sejak munculnya pandami COVID-19, whole genome sequencing digunakan sebagai metode monitoring perubahan struktur asam nukleat seluruh gen dari SARS CoV-2. Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah salah satu pusat rujukan sekaligus tempat yang mengerjakan whole genome SARS CoV-2 dalam monitoring kasus COVID-19 di Jawa Tengah. Berdasarkan hasil penelitian, keberhasilan dari empat batch yang teliti, bahwa dua batch terakhir memiliki persentase keberhasilan lebih tinggi dibandingkan pada dua batch pertama. Hal tersebut diduga karena primer yang digunakan berbeda yaitu primer pool artic versi V3 dan V4. Menurut Clark et al. (2022) penggunaan jenis primer sangat mempengaruhi hasil sekuensing dari whole genome sequencing. Hasil penelitian tersebut merekomendasikan primer versi V4 lebih baik untuk menghasilkan genome SARS CoV-2 dengan kosentrasi yang rendah. Selain itu, primer pool artic versi V4 baik digunakan untuk studi genome SARS CoV-2 yang telah bermutasi.

Berbagai instrument dapat digunakan sebagai alat untuk pengurutan genome SARS CoV-2. Namun setiap alat yang digunakan umumnya memiliki nilai standar dari indikator yang digunakan sebagai acuan dalam melihat kualitas hasil sekuensing. Menurut Ravi et al. (2018) analisis indikator dengan nilai ideal untuk instrument Miseq dengan reagen Miseq V3 yaitu cluster density 1200-1400k/mm. Cluster PF >85% dan >70% untuk Q30%. Nilai dari parameter tersebut berbeda jika instrument yang digunakan juga berbeda. Nilai dari indikator cluster density dalam penelitian ini yaitu batch 12, 14 dan 17 menunjukan nilai yang tergolong under clustering (rendah) karena tidak mencapai nilai indikator standar. Meski demikian, genome yang melalui standar pada flowcell cukup optimal sehingga signal dalam pembacaan tetap terdeteksi dengan baik seperti pada batch 18 dengan nilai cluster density yang optimal. Cluster passing filter pada penelitian ini menunjukan nilai yang ideal yaitu 92,88±0,57-96,66±0,58 kecuali pada batch 12 di mana nilai passing filter menunjukan nilai yang rendah yaitu 55,10±36,69 dan jauh dibawah standar >85%. Hal tersebut dapat menjadi salah satu faktor rendahnya persentase keberhasilan dalam pengerjaan whole genome sequencing pada batch 12 (Tabel 1).

Parameter dalam WGS seperti cluster density, cluster PF dan Q30 menjadi indikator yang sangat penting untuk evaluasi proses sekuensing (Kastanis et al., 2019). Cluster density merupakan klaster yang dibentuk dalam flowcell secara klonal. Jumlah klaster yang terbentuk dipengaruhi oleh kualitas dari perpustakan DNA dalam proses penyiapan. Penyiapan perpustakaan DNA dilakukan dengan prosedur dan ketelitian dalam pengerjaan karena tahapan ini menjadi tahapan yang sangat penting sebagai penentu kualitas hasil whole genome sequencing (Ravi et al., 2018). Cluster PF merupakan klaster yang dapat melalui filter pembacaan dan menunjukkan kemurnian klaster. Jika garis density berdekatan dengan garis PF maka hasil sekuensing semakin baik. Garis tersebut menunjukan perbandingan kepadatan klaster klonal dengan klaster yang dapat melalui filter. Garis yang berdekatan menunjukan perbandingan yang selaras dari keduanya (Kircher et al., 2012). Sedangkan Q30 merupakan intensitas signal dari pembacaan, semakin tinggi nilai Q30 maka intensitas pembacaan semakin tinggi (Kircher et al., 2012; Ravi et al., 2018). Beberapa indikator ideal ditunjukan seperti pada Gambar 2.

Pengurutan menggunakan metode whole genome sequencing merupakan metode yang baik dilakukan untuk mendapatkan beberapa informasi genetik secara menyeluruh. Beberapa studi menunjukan bahwa hasil sekuensing menggunakan metode pengurutan whole genome sequencing memberikan informasi yang kompleks tentang karakteristik basa nukleutida dalam rangkaian genome. Beberapa informasi seperti anotasi, mutasi hingga lineage dari SARS CoV-2 ditemukan dari hasil analisis tersebut sehingga dapat digunakan sebagai monitoring dari persebaran mutasi varian virus SARS CoV-2. Berdasarkan penelitian Umair et al., (2021) metode whole genome sequencing mampu mendeteksi varian G614 di beberapa wilayah di Pakistan. Penelitian lain, mengenai deteksi mutasi dan lineage dari SARS CoV-2 di beberapa negara berhasil dilakukan menggunakan metode whole genome sequencing untuk monitoring perubahan varian di Negara tersebut (Frampton et al., 2021; Martins et al., 2021).

KESIMPULAN DAN SARAN

Optimasi pengerjaan whole genome sequencing menggunakan primer pool artic V3 dan V4 menunjukan keberhasilan lebih tinggi dengan penggunaan primer pool artic versi V4 seperti yang ditunjukan pada batch 17 dan 18. Hasil evaluasi berdasarkan keberhasilan dan indikator penting dari percobaan ini, primer pool versi V4 dapat direkomendasikan sebagai primer untuk pengerjaan whole genome sequencing SARS CoV-2.

Kekurangan Penelitian

Beberapa parameter tidak dapat diobservasi seperti kualitas sampel virus menjadi faktor lain terhadap persentase keberhasilan. Selain itu, data hasil sekuensing perlu menggunakan beberapa perangkat lunak dalam memastikan kualitas dan keberhasilan pengerjaan whole genome sequencing. Data yang didapatkan hanya berdasarkan dari perangkat lunak dan program yang tersedia dai Illumina.

Mengakui

Ucapan terimakasih kepada Balai Laboratorium Kesehatan dan Pengujian Alat Kesehatan Provinsi Jawa Tengah.

DAFTAR PUSTAKA

Bhoyar, R. C., Senthivel, V., Jolly, B., Imran, M., Jain, A., Divakar, M. K., Scaria, V., & Sivasubbu, S. (2021). An optimized, amplicon-based approach for sequencing of SARS-CoV-2 from patient samples using COVIDSeq assay on Illumina MiSeq sequencing platforms. STAR Protocols, 2(3), 100755. https://doi.org/10.1016/j.xpro.2021.100755

Clark, A. C. R., Hardison, M. T., Houdeshell, H. N., Vest, A. C., & Darcy, A. (2022). Evaluation of an optimized protocol and Illumina ARTIC V4 primer pool for sequencing of SARS-CoV-2 using COVIDSeq ^TM and DRAGEN ^TM COVID Lineage App workflow.

Frampton, D., Rampling, T., Cross, A., Bailey, H., Heaney, J., Byott, M., Scott, R., Sconza, R., Price, J., Margaritis, M., Bergstrom, M., Spyer, M. J., Miralhes, P. B., Grant, P., Kirk, S., Valerio, C., Mangera, Z., Prabhahar, T., Moreno-Cuesta, J., … Nastouli, E. (2021). Genomic characteristics and clinical effect of the emergent SARS-CoV-2 B.1.1.7 lineage in London, UK: a whole-genome sequencing and hospital-based cohort study. The Lancet Infectious Diseases, 21(9), 1246–1256. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(21)00170-5

Gunadi, Wibawa, H., Marcellus, Hakim, M. S., Daniwijaya, E. W., Rizki, L. P., Supriyati, E., Nugrahaningsih, D. A. A., Afiahayati, Siswanto, Iskandar, K., Anggorowati, N., Kalim, A. S., Puspitarani, D. A., Athollah, K., Arguni, E., Nuryastuti, T., & Wibawa, T. (2020). Full-length genome characterization and phylogenetic analysis of SARS-CoV-2 virus strains from Yogyakarta and Central Java, Indonesia. PeerJ, 8, 1–15. https://doi.org/10.7717/peerj.10575

Kastanis, G. J., Santana-Quintero, L. V., Sanchez-Leon, M., Lomonaco, S., Brown, E. W., & Allard, M. W. (2019). In-depth comparative analysis of Illumina ® MiSeq run metrics: Development of a wet-lab quality assessment tool. Molecular Ecology Resources, 19(2), 377–387. https://doi.org/10.1111/1755-0998.12973

Kircher, M., Sawyer, S., & Meyer, M. (2012). Double indexing overcomes inaccuracies in multiplex sequencing on the Illumina platform. Nucleic Acids Research, 40(1), 1–8. https://doi.org/10.1093/nar/gkr771

Martins, A. F., Zavascki, A. P., Wink, P. L., Volpato, F. C. Z., Monteiro, F. L., Rosset, C., De-Paris, F., Ramos, Á. K., & Barth, A. L. (2021). Detection of SARS-CoV-2 lineage P.1 in patients from a region with exponentially increasing hospitalisation rate, February 2021, Rio Grande do Sul, Southern Brazil. Eurosurveillance, 26(12), 0–4. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2021.26.12.2100276

Massi, M. N., Abidin, R. S., Farouk, A.-E., Halik, H., Soraya, G. V., Hidayah, N., Sjahril, R., Handayani, I., Hakim, M. S., Gazali, F. M., Setiawaty, V., & Wibawa, T. (2022). Full-genome sequencing and mutation analysis of SARS-CoV-2 isolated from Makassar, South Sulawesi, Indonesia. PeerJ, 10, e13522. https://doi.org/10.7717/peerj.13522

Park, S. T., & Kim, J. (2016). Trends in next-generation sequencing and a new era for whole genome sequencing. International Neurourology Journal, 20, 76–83. https://doi.org/10.5213/inj.1632742.371

Phelan, A. L., Katz, R., & Gostin, L. O. (2020). The Novel Coronavirus Originating in Wuhan, China: Challenges for Global Health Governance. JAMA - Journal of the American Medical Association, 323(8), 709–710. https://doi.org/10.1001/jama.2020.1097

Philips, V., & Wicaksono, T. Y. (2020). Karakter dan Persebaran Covid-19 di Indonesia. CSIS Commentaries, April, 1–12.

Pillay, S., Giandhari, J., Tegally, H., Wilkinson, E., Chimukangara, B., Lessells, R., Moosa, Y., Mattison, S., Gazy, I., Fish, M., Singh, L., Khanyile, K. S., San, J. E., Fonseca, V., Giovanetti, M., Alcantara, L. C. J., & de Oliveira, T. (2020). Whole genome sequencing of sars-cov-2: Adapting illumina protocols for quick and accurate outbreak investigation during a pandemic. Genes, 11(8), 1–13. https://doi.org/10.3390/genes11080949

Ravi, R. K., Walton, K., & Khosroheidari, M. (2018). Miseq: A next generation sequencing platform for genomic analysis. Methods in Molecular Biology, 1706, 223–232. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-7471-9_12

Turista, D. D. R., Islamy, A., Kharisma, V. D., & Ansori, A. N. M. (2020). Distribution of COVID-19 and phylogenetic tree construction of sars-CoV-2 in Indonesia. Journal of Pure and Applied Microbiology, 14(May), 1035–1042. https://doi.org/10.22207/JPAM.14.SPL1.42

Umair, M., Ikram, A., Salman, M., Khurshid, A., Alam, M., Badar, N., Suleman, R., Tahir, F., Sharif, S., Montgomery, J., Whitmer, S., & Klena, J. (2021). Whole-genome sequencing of SARS-CoV-2 reveals the detection of G614 variant in Pakistan. PLoS ONE, 16(3 March), 1–11. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0248371

Xiong, D., Dai, W., Gong, J., Li, G., Liu, N., Wu, W., Pan, J., Chen, C., Jiao, Y., Deng, H., Ye, J., Zhang, X., Huang, H., Li, Q., Xue, L., Zhang, X., & Tang, G. (2020). Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPRCas12a. PLoS Biology, 18(12 December), 1–12. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000978

Catatan kaki

Author notes

m.nurhafid15@gmail.com