Aislamiento y elucidación estructural por resonancia magnética nuclear (RMN 1H, RMN 13C, DEPT135, COSY y HSQC) del compuesto (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno extraído de hojas de Piper patulum .

Isolation and structural elucidation by nuclear magnetic resonance (1H NMR, 13C NMR, DEPT135, COSY and HSQC) of compound (E) -1,3,5-trimethoxy-2- (prop-1-enyl) benzene extracted from Piper patulum.

Castillo-Arroyave, José; Fuentes, Byron; López-Mayorga, Byron; Álvarez-Toledano, Cecilio

José Castillo-Arroyave

jlcastilloarroyave@gmail.com

Universidad San Carlos de Guatemala, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Guatemala

Byron Fuentes

fuentes.byron@usac.edu.gt

Universidad San Carlos de Guatemala, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Guatemala

Byron López-Mayorga

lopez.byron@usac.edu.gt

Universidad San Carlos de Guatemala, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia Guatemala

Cecilio Álvarez-Toledano

cecilio@unam.mx

Instituto de Química Universidad Nacional Autónoma de México México

Revista Científica

Universidad de San Carlos de Guatemala, Guatemala

ISSN-e: 2224-5545

Periodicidad: Semestral

vol. 30, núm. 2, 2022

almadariaga1@gmail.com

Recepción: 24 Noviembre 2021

Aprobación: 03 Agosto 2022

URL: http://portal.amelica.org/ameli/journal/50/502701502701019/

DOI: https://doi.org/10.54495/Rev.Cientifica.v30i2.279

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Resumen: Guatemala es un país de gran diversidad biológica, la que ha permitido a diferentes investigadores de productos naturales, obtener resultados de interés y relevancia científica, principalmente sobre propiedades farmacológicas, sin embargo, hasta el momento se desconoce la estructura molecular, conformaciones y configuraciones exactas de muchos de los metabolitos secundarios responsables de dichas propiedades. Por lo tanto, en esta investigación se planteó como objetivo aislar y elucidar la estructura de un fenilpropanoide obtenido en las hojas de Piper patulum. El aislamiento se realizó por extracciones líquido-líquido y técnicas cromatográficas (cromatografía en columna -CC-), obteniendo .092 g del compuesto de interés. La elucidación se realizó por espectroscopía de masas, espectroscopia infrarroja -IR- y experimentos de resonancia magnética nuclear -RMN-, dando como resultado la estructura correspondiente a (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno. Posteriormente el fenilpropanoide presentó actividad antioxidante mediante la prueba cualitativa con 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo -DPPH-.

Palabras clave: fitoquímica, espectroscopía, metabolito secundario, fenilpropanoide, antioxidante.

Abstract: Guatemala is a country of great biological diversity, which has led natural product researchers to obtain results of great interest and scientific relevance, mainly in pharmacological properties; However, the molecular structure, conformations, and configurations of many secondary metabolites responsible for these properties are unknown. In this research, the objective was to isolate and elucidate the structure of a phenylpropanoid obtained from in the leaves of Piper patulum. The isolation was carried out by liquid-liquid extractions and chromatographic techniques (Column Chromatography -CC-), obtaining .092 g. The elucidation was performed by mass spectroscopy, infrared spectroscopy -IR- and nuclear magnetic resonance experiments -NMR-, the data obtained indicates the corresponding (E) -1,3,5-trimethoxy-2- (prop-1-enyl) benzene. Subsequently, the phenylpropanoid presented antioxidant activity through the qualitative test with 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl-DPPH

Keywords: phytochemistry, spectroscopy, secondary metabolites, phenylpropanoid, antioxidant.

Introducción

El género Piper es de gran relevancia en la familia piperaceae, (Quijano‐Abril et al., 2006) ya que contiene alrededor de 1,000 especies de interés medicinal (Torres-Pelayo et al., 2016). Estas se encuentran geográficamente en regiones tropicales y subtropicales del planeta (Quijano‐Abril et al., 2006; Standley & Steyermark, 1952), entre otras, Centroamérica, América del sur incluyendo la Amazonia central, (Jaramillo & Manos, 2001; Quijano‐Abril et al., 2006), donde ha encontrado condiciones propicias para su distribución .

Fitoquímicamente es un género con gran diversidad de metabolitos secundarios (Parmar et al., 1997); destacando los alcaloides (Nascimento et al., 2012; Parmar et al., 1997), lignanos (Parmar et al., 1997), neolignanos (Chen et al., 2013), terpenoides (Parmar et al., 1997), kavalactonas (Dharmaratne, et al., 2002), esteroides (Parmar et al., 1997), piperamidas (Dyer et al., 2004; Nascimento et al., 2012), piperólidos (Lago et al., 2005), flavonoides y derivados (chalconas dihidrochalconas, flavonas y flavanonas) (Portet et al., 2007, 2008) y fenilpropanoides (Chen et al., 2013; Masuda et al., 1991).

La diversidad de metabolitos secundarios del género Piper le otorga interés para su estudio en aplicaciones biomédicas (Mgbeahuruike et al., 2017) entre las cuales se destacan su actividad bactericida, fungicida (Alécio et al., 1998), anti-leishmaniasis (Bodiwala et al., 2007), antimalárica (Al-Adhroey et al., 2011), anticancerígena (Iwamoto et al., 2015), ansiolítica (Dharmaratne et al., 2002; Garrett et al., 2003; Prinsloo et al., 2019), antiinflamatoria (Ganguly et al., 2007) y antioxidante (Dasgupta & De, 2004; Zarai et al., 2013).

El estudio de Piper patulum Betrol, es de gran interés en Guatemala, ya que se encuentra distribuida principalmente en las regiones del sur de México y Guatemala (Álvarez et al., 2014). Debido a sus características fitoquímicas esta especie puede resultar de beneficio para el país. En Guatemala se ha determinado en Piper patulum (Cruz et al., 2008) por métodos cualitativos, distintos compuestos como alcaloides, flavonoides, antraquinonas, saponinas, principios amargos, aceites volátiles, cumarinas, y aceites esenciales con actividad antioxidante (Cruz et al., 2012), pero aún no se ha establecido la composición estructural de gran parte de los compuestos responsables de dicha actividad. Adicionalmente, en la actualidad la relación estructura-actividad es un factor importante al momento de seleccionar moléculas que tienen actividad biológica, por lo que conocer la estructura de los metabolitos secundarios cobra aún más relevancia, por tanto, esta investigación tenía como objetivo elucidar la estructura de uno de los compuestos responsables de brindarle la actividad antioxidante a la planta Piper patulum. Por esa razón se aisló por cromatografía en columna un fenilpropanoide, cuya estructura se elucidó por técnicas espectroscópicas.

Materiales y métodos

Extracción y aislamiento.

Se colectaron hojas frescas de Piper patulum en el mes de mayo del año 2018, en el municipio de Samayac, departamento de Suchitepéquez, en la Ecoparcela El Kawatal, Guatemala. El material vegetal se seleccionó y secó en un horno de convección a una temperatura de 50 ℃ hasta alcanzar un contenido de humedad de 6 %; posteriormente se pulverizó a un tamaño de partícula uniforme de 5 mm.

El material vegetal (200 g) se extrajo por percolación con una mezcla (1.5 L) de diclorometano y metanol 2:1 (v/v). El procedimiento de extracción se realizó por triplicado por 48 h; luego, se eliminó el disolvente a presión reducida obteniéndose 45.19 g del extracto crudo. Se eliminaron las clorofilas según el método de Fernandes et al. (1997) por extracción líquido-líquido obteniéndose una fracción de hexano (1.11 g) y otra de diclorometano (1.31 g).

Se tomaron 1.1172 g de la fracción hexánica luego se realizó cromatografía en columna (CC) utilizando una columna vidrio de 2.5 cm de diámetro y se empacó con sílice hasta alcanzar una altura de 15 cm. Seguidamente se realizaron eluciones de 50 ml utilizando como fase móvil hexano:acetato de etilo (9:1) eluyéndose 5 fracciones de interés, las cuales se mezclaron (.118 g) y se repurificaron por CC utilizando la misma metodología, obteniéndose .092 g. El compuesto obtenido fue cristalino y luego se determinó el Rf (.63) por cromatografía en capa fina (CCF). Debido a la naturaleza y complejidad del estudio no se realizaron repeticiones de estos procedimientos.

Análisis espectroscópico

El compuesto aislado disuelto en cloroformo deuterado se analizó por RMN en un equipo Bruker Avance de 300 MHz para ¹H (32 escaneos por análisis) y de 75 MHz (1024 escaneos por análisis) para ¹³C y DEPT 135. El espectro de FT-IR (6 escaneos por experimento) se determinó en un equipo TF Bruker tensor, el espectro de GC/MS por la técnica DART⁺ se obtuvo en un equipo JEOL, The accuTOF JMS-T100LC, utilizando Helio como gas ionizador. Todos los análisis se realizan siguiendo las especificaciones del fabricante configurando el número de escaneos por lectura óptimo para los equipos. Se realizó una lectura por cada experimento.

Actividad antioxidante

La actividad antioxidante se evaluó por duplicado cualitativamente con CCF utilizando una mezcla de hexano: acetato de etilo 9:1 como fase móvil y fue revelado con DPPH según (Cruz et al., 2008).

Análisis de datos

Los datos obtenidos espectroscópicamente se resolvieron comparando las señales obtenidas con diversas fuentes bibliográficas,(Faix, 1992; Mason, 1971) Para resolver los espectros de RMN se utilizó el software MestRe Nova versión 12.0.0-20080 (Willcott, 2009)

Resultados

Los rendimientos mostrados en la tabla 1 indican que se obtuvo un mayor porcentaje para la fracción con diclorometano, sin embargo, el compuesto que se logró aislar se encontró en la fracción hexánica.

Tabla 1.

Rendimientos de los extractos obtenidos de las hojas de Piper patulum Betrol.

En la tabla 2 se destaca el valor de referencia de .092, lo que indica su afinidad hacia disolventes apolares. También se puede confirmar su capacidad antioxidante.

Tabla 2.

Características del compuesto (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno.

¹ Fase Móvil 9:1 Hex:AcEt ² DPPH; 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo. ³La masa determinó por DART⁺.

En la tabla 3 se presentan las longitudes de onda de las vibraciones características a los distintos grupos funcionales que conforman la molécula aislada. La figura 1 muestra su estructura.

Tabla 3.

IR del fenilpropanoide (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno.

¹D: Débil, M: Medio, F: Fuerte

En la Tabla 4 se encuentran los desplazamientos en torno al ambiente químico de los protones y los carbonos evaluados por RMN. En la sección de ¹H se describe la identidad de cada hidrogeno, su relación con los hidrógenos de los átomos vecinos y su cantidad (columna 1, 2 y 3, respectivamente) estas características que indican de forma general la estructura del metabolito aislado. En las otras columnas se presentan los desplazamientos para los átomos de carbono, por ejemplo, DEPT-135; la ausencia de 3 señales sugiere que son carbonos cuaternarios; la figura 3 confirma lo descrito en la tabla.

Tabla 4.

RMN 1H y 13C del fenilpropanoide (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno.

¹ C representa el número de carbono del compuesto 1 ² dd: doble de doble S: simple dq: doble de cuádruple ³ J= constante de acoplamiento

Las figuras 1 y 2 corresponden a experimentos de RMN de correlación, donde es posible observar los acoplamientos spin-spin entre los núcleos, indicando la posición estructural de los átomos en la molécula. En la figura 1 se muestra solamente una relación entre los átomos 7 y 8 por lo que son vecinos (Tabla 4); ahora bien, en la figura 2 se encuentran múltiples correlaciones, donde cada una indica la asignación de los hidrógenos para cada carbono. Es importante acotar que los desplazamientos químicos ( ) se describen en la tabla 4.

Figura 1. COSY espectroscopía de correlación homonuclear (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno.

Figura 2. HSQC Espectroscopía de correlación heteronuclear (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno.

En la figura 3 se indica la estructura de la molécula aislada, la posición de los sustituyentes en el anillo aromático y su configuración geométrica descrita en la tabla 4 y en las figuras 2 y 3.

Figura 3. Fenilpropanoide con el nombre IUPAC (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno.

Discusión

En un estudio previo (Cruz et al., 2012) se propuso la presencia del fenilpropanoide utilizando la técnica de GC/MS. En la presente investigación se consiguió aislarlo y elucidar inequívocamente su estructura.

La importancia de determinar la estructura exacta en los compuestos químicos adquirió relevancia en la farmacología por el caso de la talidomida (Fabro et al., 1967), conociéndose las implicaciones que tiene la configuración enantiomérica de una especie química. En la química de productos naturales se encuentran situaciones similares, se sabe que los fenilpropanoides que poseen isómero geométrico cis, presentan una mayor toxicidad, hepatotoxicidad y daño cardiaco en contraposición del isómero trans (Benny et al., 2017).

Dada la importancia de determinar la configuración geométrica del compuesto asilado, se empleó la RMN como herramienta para asignarla; esta técnica junto con la difracción de rayos X son las de mayor efectividad para determinar los isómeros orgánicos. En la tabla 4 RMN ¹H se muestran los valores de las constantes de acoplamiento (J), este parámetro nos permite conocer las interacciones que tienen los átomos vecinos sobre el ambiente químico del núcleo analizado, por un fenómeno que se conoce como acoplamiento spin-spin (Bax & Freeman, 1981). Para la olefina se encuentra una constante de acoplamiento de 18 Hz (Tabla 4) este valor indica que el grupo alqueno presente configuración trans.

La técnica de espectroscopía por infrarrojo nos permite determinar en base la frecuencia e intensidad de las vibraciones la identidad de diversos grupos funcionales presentes en la molécula, por lo cual en conjunto con técnicas complementarias como RMN es posible elucidar la estructura del compuesto aislado.

En la investigación sobre los fenilpropanoides fueron identificadas no solamente las diferentes configuraciones geométricas, más también los diversos isómeros estructurales (Parmar et al., 1997) por lo tanto en esta investigación se realizaron análisis bidimensionales de RMN -COSY- y -HSQC- figura 1 y 2, siendo posible llegar a conclusiones asertivas sobre las posiciones de sustituyentes, (Figura 3). Por lo tanto, el nombre IUPAC que corresponde al fenilpropanoide aislado es (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno.

En lo que respecta a su actividad biológica, en la tabla 2, se observan los datos que indican que el fenilpropanoide es secuestrador activo de radicales libres sobre DPPH (función antioxidante), siendo esta característica un avance en el conocimiento de los metabolitos, ya que en trabajos anteriores se había demostrado que los extractos provenientes de Piper patulum poseen actividad antioxidante (Cáceres et al., 2012), pero hasta el momento no se había podido atribuir dicha actividad a un compuesto en particular, por lo cual se concluye que el (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno es uno de los componentes responsables de actividad.

Se ha demostrado que la actividad antioxidante de los fenilpropanoides está relacionada con su capacidad para donar densidad electrónica (Boulebd, 2019). Ya que en esta investigación se elucidó la estructura del fenilpropanoide aislado, es posible indicar que los grupos metoxilos en 1,3,5 y electrones π deslocalizados de la olefina en trans con el anillo bencénico (Chang et al., 2007) son los responsable de la capacidad antioxidante del compuesto identificado como (E)-1,3,5-trimetoxi-2-(prop-1-enil) benceno.

La importancia de los resultados de esta investigación radica no solo en la elucidación estructural de la molécula, sino en el valor intrínseco de lograr concretar una metodología viable para el aislamiento del fenilpropanoide, así como demostrar su actividad antioxidante y de esta forma sentar las bases para futuras investigaciones sobre aislamiento de productos naturales.

Agradecimientos

Al Lic. Armando Cáceres Estrada por proporcionar el material vegetal.

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