Artículos Originales

Evaluación de pruebas inmunológicas en el diagnóstico de Giardia duodenalis y Cryptosporidium spp., Honduras

Evaluation of immunologic tests in the diagnosis of Giardia duodenalis and Cryptosporidium spp., Honduras

Kaminsky, Rina G.; García, Jorge A.

Rina G. Kaminsky

camilaestela12@yahoo.com

Instituto de Enfermedades Infecciosas Honduras

Jorge A. García

garciaguilarjorge@gmail.com

Asociación Hondureña de Parasitología Honduras

Revista Médica Hondureña

Colegio Médico de Honduras, Honduras

ISSN: 0375-1112

ISSN-e: 1995-7068

Periodicidad: Semestral

vol. 90, núm. 1, 2022

revmh@colegiomedico.hn

Recepción: 11 Noviembre 2021

Aprobación: 22 Junio 2022

URL: http://portal.amelica.org/ameli/journal/470/47033724703372003/

DOI: https://doi.org/10.5377/rmh.v90i1.14394

Autor de correspondencia: camilaestela12@yahoo.com

Forma de citar:Kaminsky RG, García JA. Evaluación de pruebas inmunológicas en el diagnóstico de Giardia duodenalis y Cryptosporidium spp., Honduras. Rev Méd Hondur. 2022; 90 (1): 36-43. DOI: https://doi.org/10.5377/rmh.v90i1.14394

Modelo de publicación sin fines de lucro para conservar la naturaleza académica y abierta de la comunicación científica

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Resumen: Antecedentes: No conocemos datos sobre evaluación de pruebas inmunológicas para mejorar el diagnóstico de Giardia duodenalis y Cryptosporidium spp., agentes etiológicos de diarrea de importancia mundial, en Honduras. Objetivos: Comparar dos pruebas inmunológicas para el diagnóstico de Giardia y Cryptosporidium spp. con microscopía de rutina y determinar su aplicabilidad local. Métodos: Estudio descriptivo transversal. En 2013, 134 muestras de heces recibidas en el Servicio de Parasitología del Hospital Escuela (HE) y 67 muestras del Centro de Salud Alonso Suazo (CSAS) se analizaron con una Prueba Rápida Inmunocromatográfica (PDR). En 2019-2020, 60 muestras de heces del HE se analizaron con una prueba inmunoenzimática ELISA. El protocolo de rutina incluyó examen directo en solución salina y solución de Lugol, coloración tricrómica y coloración ácido resistente modificada (ARM) (HE) y examen directo en solución salina y solución de Lugol (CSAS). Resultados: Cada prueba inmunológica mostró mayor positividad que la microscopía: en 134 muestras del HE para Giardia (6.7% vs 4.5%) y Cryptosporidium (3.7% vs 0.7%), similar en 67 muestras del CSAS (14.9% vs 7.5% para Giardia; 0.7% para Cryptosporidium con la prueba inmunológica). De 60 muestras analizadas por ELISA en HE, 31.7% fue positiva por Giardia vs 18.3% en examen directo y 23.3% en coloración tricrómica; 6.7% positiva por Cryptosporidium spp. vs 3.3% por coloración ARM. Discusión: Pruebas inmunológicas aumentaron significativamente el diagnóstico de ambas parasitosis; sin embargo, publicaciones sobre pruebas similares ofrecieron resultados no concluyentes. Por costo elevado podrían reservarse para pacientes pediátricos, pacientes inmunocomprometidos en hospitales, complementando microscopía. Los laboratorios de salud deben fortalecer capacidad diagnóstica.

Palabras clave: Cryptosporidium, Diagnóstico, Giardia, Pruebas inmunológicas, Honduras.

Abstract: Background: We know no data about evaluation of immunologic tests for improved diagnosis of Giardia duodenalis and Cryptosporidium spp., worldwide important etiologic agents of diarrhea, in Honduras. Objectives: To evaluate two immunologic tests for the diagnosis of Giardia and Cryptosporidium spp. And determine their applicability compared to microscopy results. Methodology: Descriptive transverse study. One hundred and sixty-four stool samples from the Parasitology Service (PS), Hospital Escuela (HE) and 67 samples from a health center were analyzed with an immunochromatographic rapid test (2013); 60samples from PS were tested by an immunoenzymatic test ELISA (2019-2020). Microscopic routine protocol examination included direct smear in saline and Lugol solutions, trichrome stain and carbol fuchsine acid resistant modified stain (ARM). Results: Either immunologic test recognized more Giardia (6.7% vs 4.5%) and Cryptosporidium (3.7% vs 0.7%) than microscopy in 134 samples at HE with the rapid immunochromatographic assay, as well as in 67 samples at CSAS (14.9% vs. 7.5% for Giardia and 0.7% for Cryptosporidium with immunological test). Of 60 samples analyzed by ELISA test in HE, 31.7% was positive for Giardia compared to 18.3% in the direct smear and 23.3% with trichrome stain; Cryptosporidium spp. was 6.7% positive compared to 3.3% with ARM stain. Discussion: Immunologic tests significantly improved Giardia and Cryptosporidium microscopic diagnosis; however, other publications utilizing similar tests presented inconclusive results. High cost would limit their use for pediatric and immunocompromised patients in hospitals, complementing microscopy. Public health laboratories must strengthen diagnostic capacity.

Keywords: Cryptosporidium, Diagnosis, Giardia, Honduras, Immunologic tests.

INTRODUCCIÓN

A nivel mundial la diarrea es la segunda causa de mortalidad en niños menores de 5 años. 1 En el año 2021 se reportaron 142,315 casos de diarrea sin sangre en Honduras, 55,667 (39.1%) en menores de 5 años, con una tasa de 6,530 casos por 100,000 habitantes; 2 se desconocen los factores determinantes asociados a diarrea en Honduras. Giardia duodenalis . Cryptosporidium spp son causas más importantes de diarrea transmitida por agua y alimentos, estimándose más de 200 millones de episodios de giardiasis a nivel mundial. 3 Aún en ausencia de síntomas entéricos, la infección persistente de giardiasis estuvo asociada con talla y peso reducidos a los dos años de edad. 4 La diarrea profusa por Cryptosporidiumen menores de 24 meses causa desnutrición importante, con

8.5 veces más riesgo de muerte 2-3 meses después o retraso en el desarrollo físico y cognitivo más adelante. El Estudio Entérico Global Multicéntrico (GEMS siglas en inglés) identificó Cryptosporidium como la segunda causa más común de diarrea moderada o severa en menores de 2 años en siete países surasiáticos y África subsahariana y como la segunda prioridad en parásitos transmitidos por alimentos en algunos países europeos. 5,6 La infección por Cryptosporidium en individuos con inmunidad comprometida por diferentes razones (malignidad, malnutrición, VIH/SIDA) es de importancia crítica por falta de opciones terapéuticas que erradiquen este parásito de la mucosa intestinal o respiratoria. Estas parasitosis son de importancia en salud pública y fueron definidas por la Organización Mundial de la Salud como Enfermedades Tropicales Desatendidas (ETD), tomando en cuenta su alta prevalencia, el efecto negativo en el crecimiento, desarrollo y funciones cognitivas disminuidas a posteriori en niños infectados a temprana edad, que afecta la habilidad en alcanzar todo su potencial de desarrollo físico y socioeconómico. 7,8

Existen muchas técnicas de laboratorio para el diagnóstico confiable de estos parásitos en muestras de heces, tanto microscópicas como técnicas inmunológicas que utilizan antígenos específicos en pruebas rápidas inmunocromatográficas (PDR), o imunoenzimáticas (ELISA, Ensayo por Inmunoabsorción ligado a Enzimas, por sus siglas en inglés), o detección de ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) más sensible que la microscopía, o incluso métodos moleculares para la diferenciación entre especies de Giardia (5 especies diferentes y varios grupos) y entre especies de Cryptosporidium (23 especies diferentes y 61 genotipos) reservados, por su alto costo en infraestructura y personal especialmente adiestrado, a laboratorios de investigación y de poca aplicación en laboratorios de rutina en países de escasos recursos. 8,9 Actualmente diferentes métodos inmunoenzimáticos y pruebas rápidas inmunocromatográficas comerciales que existen en el mercado de aplicación en laboratorios de rutina detectan antígenos parasitarios, son simples de ejecutar y ofrecen rapidez en el diagnóstico sin necesidad de equipo especial o incluso fluido eléctrico. Sin embargo, al ser elaborados por diferentes casas comerciales no existe reproducibilidad entre unos y otros por lo que deben ser previamente evaluados e interpretados.

No conocemos datos sobre evaluación de pruebas inmunológicas para mejorar el diagnóstico de G. duodenalis . Cryptosporidium spp. en Honduras. Este estudio se realizó con los objetivos de probar dos métodos inmunológicos para diagnóstico de Giardia . Cryptosporidium, una prueba rápida inmunocromatográfica (PDR) y un método inmunoenzimático (ELISA), comparados con los resultados de la rutina microscópica en dos centros asistenciales en Tegucigalpa y determinar su aplicabilidad local.

MATERIALES Y MÉTODOS

Estudio descriptivo transversal. Se revisaron y compararon los resultados de la rutina microscópica (método directo, coloración tricrómica y coloración Ácido Resistente Modificada, ARM) con dos pruebas inmunológicas diferentes para la detección de G. duodenalis . Cryptosporidium spp. Para comparar métodos microscópicos con PDR, se realizó un muestreo por conveniencia en dos laboratorios: 134 muestras de heces del Servicio de Parasitología (SP) del Hospital Escuela (HE) y 67 muestras del laboratorio del Centro de Salud Alonso Suazo (CSAS) positivas por Giardia y/o Cryptosporidium, así como muestras negativas de consistencia diarreica o líquida (año 2013). Para la prueba de ELISA (año 2020) se tomó 60 muestras de heces del SP del HE de similares características. En el SP del HE se siguió el protocolo de examen de muestras establecido: examen macroscópico de la muestra, preparación de extendidos para coloración ARM y preparación directa en solución salina fisiológica y solución de Lugol. En el laboratorio del CSAS el examen de rutina consistió en registrar la consistencia de la muestra y un examen microscópico en solución salina y en solución de Lugol; dicho laboratorio no había implementado la coloración ARM. Una vez examinadas, las muestras de este laboratorio eran recogidas el mismo día antes de las 11:00 a.m. por personal asignado del SP del HE, sin repetir el examen microscópico en el SP. El mismo día que se recibían dichas muestras en el SP del HE se realizaba la PDR, se anotaban en un registro específico los datos de edad y sexo del paciente, consistencia de la muestra y los resultados de la PDR y se entregaban al laboratorio del CSAS al día siguiente.

La donación en 2019 de estuches para la prueba inmunológica de ELISA permitió compararla con los resultados microscópicos de 60 muestras de heces del SP del HE. Se tomaron muestras de características descritas antes, guardando una alícuota de cada muestra a 20.0°C hasta el momento del análisis por ELISA. Para todas las muestras examinadas se registraron los datos de la boleta de solicitud de: edad y sexo, y los siguientes grupos etarios: 0-5 años, 6-10 años y mayores de 10 años. Se registraron otros hallazgos microscópicos de interés: protozoos comensales, leucocitos, eritrocitos, cristales de Charcot-Leyden, presencia de moco, etc.

Se utilizaron dos pruebas inmunológicas. La prueba de diagnóstico rápido (PDR) ImmunoCard STAT! Crypto/ Giardia, para la detección cualitativa de antígenos de Giardia. Cryptosporidium en muestras de heces humanas (Meridian Bioscience, Cincinnati, OH, Estados Unidos), donada por la Fuerza de Tarea Conjunta Bravo (FTCB) de los Estados Unidos de América. La prueba ELISA para la detección de antígenos de G. duodenalis y antígenos de Cryptosporidium spp; (IVD Research Inc., Quality Diagnostic Products, Carlsbad, CA, Estados Unidos). La prueba ELISA fue donada por el fabricante mencionado. En cada prueba inmunológica se siguieron las instrucciones provistas por el fabricante. Previa ejecución del método de ELISA se preparó un protocolo sobre papel dividido en 62 casillas, reservando las dos primeras casillas para anotar el control negativo y el control positivo respectivamente, y el resto para anotar el número de cada muestra de heces. La interpretación de resultados de la prueba ELISA se realizó por visión normal, marcando a lápiz en el protocolo las casillas de color amarillo que denota positividad, comparados con el control negativo y positivo según las instrucciones del manufacturador.

La comparación de los resultados de las pruebas inmunológicas y microscópicas se realizó mediante la estimación de Sensibilidad y Especificidad y su respectivo Intervalo de Confianza al 95% (IC95%), utilizando la calculadora estadística en línea OpenEpi para evaluación de Pruebas Diagnósticas (https://www.openepi.com/DiagnosticTest/DiagnosticTest.htm). Se evaluó el desempeño de los métodos inmunológicos utilizando como estándar de oro los métodos microscópicos y viceversa. La descripción de la población en estudio se realizó mediante la estimación de frecuencias y proporciones, para la variable edad se estimó la mediana porque los datos no presentaban una distribución normal. Para la descripción de los casos, se incluyó la totalidad de casos de giardiasis y criptosporidiasis diagnosticados por los diferentes métodos.

En este estudio la información de los participantes humanos se obtuvo de registros institucionales, por lo tanto, no se aplicó consentimiento informado ni se sometió un protocolo a dictamen ético. La información personal de los participantes se manejó de manera confidencial por parte del equipo investigador. Para obtener acceso a los registros institucionales los autores realizaron la coordinación institucional correspondiente obteniendo la colaboración y aprobación para llevar a cabo el estudio en los diferentes periodos. Los resultados positivos (microscopía y PDR) fueron entregados al personal de laboratorio correspondiente quienes se responsabilizaron en hacer llegar dichos resultados al expediente clínico de los participantes.

RESULTADOS

El Cuadro 1 muestra resultados del 2013 y del 2019-2020 según aparece especificado en las columnas de las pruebas respectivas. De las 134 muestras del SP del HE, el 47.8% (64/134) era del sexo femenino, en 1.5% (2/134) no se registró ese dato. El 63.4% (85/134) tenía de 0 a 5 años, 11.9% (16/134) de 6 a 10 años y 23.9% (32/134) era mayores de 10 años; en 0.7% (1/134) no se consignó edad. El 32.8% (44/134) de las muestras era de consistencia diarreica o líquida. El 6.7% (9/134) de las muestras fue positiva para G. duodenalis en PDR vs. 4.5% (6/134) en el examen microscópico directo; una de las muestras con quistes de Giardia en el examen directo fue negativa con PDR; la diferencia entre ambos porcentajes fue estadísticamente significativa (.<0.01). Para el diagnóstico de Cryptosporidium, 3.0% (4/134) muestras fueron positivas por PDR, comparado con 0.7% (1/134) por microscopía; la diferencia entre ambos porcentajes fue estadísticamente significativa (.<0.05).

En el CSAS, 53.7% (36/67) muestras provenían del sexo femenino, con 52.2% (35/67) en la edad de 0-5 años, 35.8% (24/67) de 6 a 10 años y 12.0% (8/67) mayor de 10 años. El 89.5% (60/67) de las muestras era formada o blanda; el 14.9% (10/67) y 7.5% (5/67) fue positiva por G. duodenalis en PDR y por microscopía respectivamente, la diferencia entre ambos porcentajes fue estadísticamente significativa (.<0.01); 0.7% (1/67) fue positiva por Cryptosporidium en PDR. No se consignan datos de ARM dado que esta técnica no se realizaba en el CSAS. Este establecimiento de salud informó 4.5% (3/67) muestras con leucocitos y 61.2% (41/67) con Blastocystis spp.

Las 60 muestras para la prueba de ELISA se recolectaron entre noviembre 2019 a marzo 2020 del SP del HE; 40.0% (24/60) del sexo femenino, 46.7% (28/60) tenía entre 0 a 5 años, 43.4% (38/60) de las heces era entre diarreica y líquida. G. duodenalis fue diagnosticada en 31.7% (19/60) de las muestras con el método de ELISA, comparado con 23.3% (14/60) en la coloración tricrómica y 18.3% (11/60) en el examen directo;la diferencia entre el porcentaje detectado con ELISA y microscopía (coloración tricrómica) fue estadísticamente significativa (p<0.01 (Cuadro 1). El 6.7% (4/60) de las muestras fue positiva para Cryptosporidium por ELISA vs 3.3% (2/60) por la coloración ARM, la diferencia entre ambos porcentajes fue estadísticamente significativa (p<0.01). Se revisaron cinco muestras positivas por G. duodenalis en ELISA y negativas con la coloración tricrómica, habiendo encontrado un quiste bien definido en una de las láminas antes negativa. Igualmente, se revisó a posteriori las dos coloraciones ARM negativas y ELISA positivas, en una se encontró ooquistes de Cryptosporidium. No hubo falsos negativos en esta prueba. Otros hallazgos fueron: 25% (15/60) con leucocitos, 6.7% (4/60) eritrocitos, 18.3% (11/60) cristales de Charcot-Leyden y 16.7% (10/60) con glóbulos de grasa.

Cuadro 1
Cuadro 1

*2019-2020: los métodos fueron examen directo y coloración tricrómica, 2013: examen directo en ambos sitios. **método usado fue coloración ARM, en CSAS este método no se ha implementado. HE=Hospital Escuela, CSAS=Centro de Salud Alonzo Suazo, NC= no consignado

Cuadro 2.
Características de los casos de giardiasis y criptosporidiasis, diagnoticados por métodos microscópicos e inmunológicos, Hospital Escuela y Centro de Salud Alonso Suazo, 2013, 2019-2020, Honduras.

*Chilomastix o Trichomonas, NA=No aplica. **Grasa: vista como glóbulos refringentes, ninguna metodología específica

En el SP del HE hubo una mayor proporción de solicitud de examen de heces en el sexo masculino; en CSAS la mayoría fue del sexo femenino. De los tres grupos etarios la frecuencia de solicitud fue mayor entre menores de 5 años; no se observó diferencia entre la consistencia de las heces, a excepción de las muestras del CSAS, en donde la mayoría era formada o blanda. La presencia de leucocitos varió entre 4.5% a 25%, y la de cristales de Charcot-Leyden, entre 6% y 18.3%. En muestras del SP del HE se informó 29.8% de coinfección con amebas comensales, 17.9% con flagelados comensales y entre 22.4% y 28.3% de Blastocystis spp. (Cuadros 1 y 2).

Analizando por separado las características de las 36 muestras positivas por Giardia (detectadas por cualquier método) (Cuadro 2) el 72.2% (26/36) correspondió al sexo masculino, 55.6% (20/36) entre 0-5 años (mediana 4.5 años), sin diferencias en la consistencia de las heces. El 41.7% (15/36) de las muestras tenía coinfección con Blastocystis spp, 22.2% (8/36) con amebas comensales y 11.1% (4/36) con flagelados comensales; en 16.6% (6/36) se reconoció cristales de Charcot-Leyden y leucocitos en 11.1% (4/36). En los 9 casos de Cryptosporidium spp., la frecuencia entre ambos sexos fue similar, 77.8% (7/9) en las edades entre 0-5 años, 66.6% (6/9) en heces formadas o blandas, 44.4% (4/9) presentaba leucocitos, 11.1% (1/9) amebas comensales y 22.2% (2/9) Blastocystis spp. No se hicieron comparaciones estadísticas entre criptosporidiasis y giardiasis; sin embargo, en giardiasis el 72% se presentó en el sexo masculino, había más moco y prevaleció la presencia de cristales de Charcot Leyden.

En las muestras del HE la PDR fue más sensible (83.3%, IC95% 43.7-96.9) y específica (96.9%, IC95% 92.3-98.8) que el método directo para detectar Giardia (Cuadro 3). A su vez, el método directo mostró 55.6% (IC95%: 26.7-81.1) de sensibilidad y 99.2% (IC95%: 95.6-99.9) de especificidad frente a la PDR. En el CSAS, la sensibilidad de la PDR fue de 100% (IC95%: 56.5-100.0) al reconocer el doble de casos que el examen directo y una especificidad de 91.9% (IC95%: 82.5-96.5); el examen directo tuvo una sensibilidad de 50.0% (IC95%: 23.7-76.3) y especificidad de 100% (IC95% 93.7-100.0) frente a la PDR. En otras palabras, se detectó mayor número de positivos con PDR y no hubo falsos negativos. Igualmente, la prueba de ELISA fue más sensible y específica para detectar Giardia que el método directo (100%, IC95%: 74.1-100.) y 83.7%, IC95%: 70.9-91.5), respectivamente. La coloración tricrómica fue más sensible que el método directo (73.7%, IC95%: 51.2-88.2) con especificidad de 100% (IC95%: 91.4-100.0). El examen directo fue menos sensible, pero mantuvo la especificidad comparada con ELISA y la coloración tricrómica (57.9%, IC95%: 36.3-76.9 y 100%, IC95%: 91.4-100.0), respectivamente.

Cuadro 3.
Cuadro 3.

Sensibilidad y especificidad de técnicas microscópicas y métodos inmunológicos en el diagnóstico de Giardia duodenalis, 2013, 2019-2020, Honduras.

HE=Hospital Escuela, CSAS=Centro de Salud Alonzo Suazo; ARM=Acido-Resistente Modificado; PDR=Prueba de Diagnóstico Rápido (método Inmunocromatografía

Cuadro 4.
Cuadro 4.

Sensibilidad y especificidad de técnicas microscópicas y métodos inmunológicos, en el diagnóstico de Cryptosporidium spp. 2013, 2019-2020, Honduras

La detección de Cryptosporidium (Cuadro 4) por PDR comparado con ARM (HE), tuvo una sensibilidad de 100% (IC95% 20.6-100.0) y especificidad de 97.7% (IC95% 93.6-99.2); la coloración ARM comparada con la PDR tuvo una sensibilidad de 25.0% (IC95% 4.6-69.9) y especificidad de 100% (IC95% 97.1-100.0). En CSAS no se había implementado la coloración ARM al momento de este estudio, lo que no permitió hacer estas estimaciones. En relación con la detección de Cryptosporidium, la prueba de ELISA tuvo sensibilidad de 100% (IC95% 32.2-100.0) y especificidad de 96.5% (IC95% 88.3-99.0) comparado con ARM; pero la coloración ARM tuvo una sensibilidad de 50.0% (IC95% 15.0-85.0) y especificidad de 100% (IC95% 93.6-100.0) comparado con ELISA.

En la Figura 1A se muestra un ooquiste de Cryptosporidium spp., coloreado por ARM e identificado por un color rojo-púrpura brillante, redondo o ligeramente ovalado; la medición de varios ooquistes fue entre 4 y 6 μm de tamaño. Los quistes de Giardia (Figura 1B), las formas encontradas con mayor frecuencia fueron reconocidos por morfología: ovoides, entre 10-12 μm de tamaño, de pared delgada y con una separación conspicua del citoplasma en el extremo redondeado, identificando en su interior 3-4 núcleos y restos de flagelos. Los trofozoítos (Figuras 1C, D), que pueden estar presentes en heces frescas diarreicas o líquidas, se observan con menos frecuencia y se caracterizan por un disco suctorio en su parte anterior y la presencia de 4 pares de flagelos que pueden definirse en la coloración tricrómica o con solución de Lugol bajo objetivo de inmersión. No se contabilizó la presencia de trofozoítos y/o quistes en las muestras de heces; la morfología descrita es la morfología universal de las formas encontradas en muestras de heces, con pocas variaciones

Figura 1.
Figura 1.

Cryptosporidium spp. y Giardia duodenalis A. Cryptosporidium spp., ooquiste teñido por carbol fucsina ácido resistente modificado (ARM), B. Giardia duodenalis, dos quistes en coloración tricrómica (modificada de Wheatley), C. Giardia duodenalis, un trofozoíto en coloración tricrómica acompañado de un cristal de Charcot-Leyden (flecha), D. Giardia duodenalis, trofozoíto, coloreado con solución de Lugol. x1000 magnificación en todas. Originales García JA. Todas las fotografíascorresponden al estudio y fueron tomadas en el SP del HE al momento del diagnóstico

DISCUSIÓN

Según nuestro conocimiento, este es el primer informe de la aplicación de una coloración tricrómica y de dos métodos inmunológicos comparando con los resultados del examen coproparasitoscópico de pacientes que buscaron atención médica en el HE y en el CSAS. Las pruebas inmunológicas PDR y ELISA diagnosticaron mayor número de positivos para ambos parásitos comparado con los métodos microscópicos en los sitios estudiados; la PDR permitió identificar muestras que habían sido negativas por microscopía (3 G. duodenalis en el SP del HE y 5 en el CSAS y un Cryptosporidium); la prueba de ELISA fue más sensible que el método directo (100% vrs 57.9%) y la coloración tricrómica (100% vrs 73.7%). En el CSAS la PDR detectó Cryptosporidium en un niño de 2 años; ese centro no realiza la coloración ARM.

Estudios discutidos a continuación que evaluaron diferentes PDR concordaron que eran de fácil ejecución, requerían de poco tiempo y no necesitaban equipo especial. Sin embargo, mostraban resultados variables según la casa comercial productora, diferente metodología de producción, presencia de especies diferentes del parásito por regiones geográficas y costo adicional para el laboratorio. 10 Tres PDR evaluadas en Malawi y Kenya, GIARDIA/CRYPTOSPORIDIUM QUIK-CHEK, RIDA-QUICK para Cryptosporidium/Giardia Combi y CRYPTO/GIARDIA DUO-Strip presentaron rangos de sensibilidad entre 48.2% en Malawi a 85.7% en Kenya para G. duodenalis y rangos entre 42.9% en Malawi a 76.9% en Kenya para Cryptosporidium. Por el contrario, la especificidad fue aceptable, de 88.7% a 100%. Se hace notar que los participantes eran niños severamente desnutridos con diarrea aguda; las ventajas de las PDR fueron su rapidez de ejecución y el hecho de no necesitar equipo especial. Una explicación para la baja sensibilidad es que podría tratarse de diferentes grupos de Giardia (C-F) o diferentes especies de Cryptosporidium o bien por una baja densidad parasitaria. Adicionalmente, al comparar la PDR ImmunoCard STAT! con inmunofluorescencia directa (IFD) en laboratorios de salud pública de Estados Unidos, se detectó un 45.6% de falsos positivos, asociado a heces de sujetos mayores de 25 años y tipo de preservante usado en el transporte de las heces. 11

Un problema importante en el diagnóstico de Cryptosporidium es la presencia de diferentes especies zoonóticas; C. hominis y C. parvum son las más frecuentes, pero otras como C. meleagridis, C. bovis, C. canis y C. felis también infectan al humano; de allí la necesidad de contar con pruebas capaces de identificar diferentes especies. Curiosamente, una misma prueba (CerTest Crypto) diseñada para identificar especies de Cryptosporidium dio resultados diferentes en cinco países africanos: la más alta sensibilidad fue observada en Madagascar (72.2%) comparado con Gabón y Ghana con 50% y 52% respectivamente y el más bajo en Tanzanía (35.2%); una sensibilidad general de 49.6%, especificidad de 92.5% y valor predictivo de 61.3%. 12 No hubo evidencia de que los resultados estuvieran influenciados por período de lluvia, período de evaluación, género o grupo etario y sí hubo concordancia de que la edad más parasitada por Cryptosporidium fue en los dos primeros años de vida.

Otro método inmunológico disponible es la prueba inmuno-enzimática ELISA. Similar a las PDR, estuches de diferentes casas comerciales deberán ser evaluados antes de su implementación. Su ejecución demora más de una hora, pero pueden examinarse hasta 94 muestras de heces al mismo tiempo, con la ventaja de ofrecer considerable positividad frente al examen microscópico. Algunos estuches permiten la separación de pocitos individuales cuando urge el resultado en una rutina. Se experimentó una prueba prototipo en un área indígena rural de Guatemala, Tri-Combo Parasite Screen comparada con ELISAs individuales para Giardia spp, Cryptosporidium spp. y Entamoeba histolytica en una población de 620 niños entre 18 meses y 6 años sin síntomas intestinales. 13 Las pruebas individuales reconocieron 8.4% (52/620), 0.3% (2/620) y 0.5% (3/620) de Giardia spp., E. histolytica y Cryptosporidium spp. respectivamente, comparado con 5.7% (35/620), 0.5% (3/620) y 0% para los mismos parásitos reconocidos por métodos microscópicos; de los 57 positivos en las pruebas ELISA individuales solo 23 (40%) fueron positivos por microscopía. Los autores señalaron ventajas adicionales de esta prueba incluyendo su utilidad en área rural carente de electricidad o agua corriente en el laboratorio. Por otra parte, un estudio comparativo de cuatro métodos utilizando muestras seriadas humanas, de gatos y de perros en Brasil encontró que la prueba de ELISA fue positiva para Giardia en 69.8% (67/96) comparada con 89.6% (89/97) en un método de flotación por sulfato de zinc en sujetos que habían sido positivos por G. duodenalis. 14 Estos investigadores concluyeron que la técnica de flotación de sulfato de zinc (Faust 1939) resultó mejor en sensibilidad y especificidad para detectar G. duodenalis de muestras seriadas de humanos, gatos y perros. 14 En Beni-Suef, Egipto, la positividad de la prueba de ELISA en adultos jóvenes (31-40 años) y aquellos entre 51 a 60 años,todos inmunocompetentes, fue de 12.5% comparada con 9.5% en una coloración ARM. Al analizar la sensibilidad y especificidad de ELISA con la microscopía por el método ROC (Receiving Operating Characteristics, siglas en inglés), encontraron que ambas pruebas tenían una fuerte sensibilidad y especificidad, con un valor de p<0.0001. 15 Una revisión en la estrategia diagnóstica actual para G. duodenalis encontró que las pruebas inmunoenzimáticas eran igual o más sensitivas que el examen microscópico y concluía que la microscopía tradicional, en combinación con métodos de concentración, debía mantenerse en laboratorios de rutina por ser económicos y de alta sensibilidad, pudiendo dejar los métodos inmunológicos y moleculares como pruebas complementarias. 16

La coloración tricrómica, menos exigente que la coloración clásica con hematoxilina férrica para el diagnóstico de flagelados, ciliados y amebas intestinales no se había utilizado de rutina en el HE, si bien es un método más elaborado en costo, tiempo de ejecución y adiestramiento del personal que el método directo, las heces no están diluidas lo que facilitaría recuperar trofozoítos/quistes escasos y permite destacar la morfología particular de protozoos intestinales incluyendo G. duodenalis, asegurando mayor confiabilidad en el diagnóstico. 17

La necesidad de un diagnóstico oportuno y confiable para estas infecciones parasitarias no está limitada a la importancia del manejo, en particular de niños vulnerables desnutridos y en especial Cryptosporidium spp. en pacientes inmunocomprometidos. Los datos obtenidos en el diagnóstico son contribuyentes al conocimiento de la epidemiología de estas parasitosis, necesarios en el diseño de medidas de prevención y control adecuadas y la obtención de estadísticas nacionales. Inexplicablemente, la implementación de una coloración específica para diagnóstico microscópico de Cryptosporidium no está generalizada en los laboratorios de salud en Honduras, 18 a pesar de existir publicaciones al respecto en la Revista Médica Hondureña desde 1986. 19 Por añadidura, criptosporidiasis es tema obligado en la enseñanza de parasitología a alumnos de V año e internos de la Facultad de Ciencias Médicas, UNAH, desde 1990.

Dentro de las limitantes del estudio se menciona: Se realizó entre población hospitalaria y de un centro de salud, sin comparar entre pacientes viviendo con VIH/SIDA, o población al azar asintomática, niños y adultos. El número de participantes estuvo limitado por la cantidad de pruebas inmunológicas recibidas como donación. Los métodos microscópicos utilizados, a excepción de la coloración tricrómica en el SP del HE, no incluyeron métodos de concentración ni el examen de varias muestras de un mismo paciente en días diferentes lo que posiblemente hubiera aumentado la positividad en los resultados por microscopía. No se contó con métodos diagnósticos de referencia, como extracción de ADN por PCR. Tampoco se cuantificó la cantidad de quistes/ooquistes presentes en preparaciones directas o coloreadas, lo cual tendría una relación directa con la positividad de la prueba inmunológica diseñada tal vez para una carga antigénica más alta. Al interpretar comparativamente los resultados de las pruebas inmunológicas frente métodos microscópicos, el tamaño de la muestra fue pequeño, lo que se reflejó en la baja cantidad de positivos, especialmente Cryptosporidium. Como consecuencia, los intervalos de confianza muestran inexactitud,que se refleja en la amplitud de las estimaciones.

Recobrar el parásito por cualquier método, microscópico en este caso (salvo métodos moleculares), confirma la etiología de cualquier infección parasitaria. En este estudio ambas pruebas inmunológicas demostraron diferencias estadísticas significativas en la identificación de G. duodenalis y Cryptosporidium comparadas con microscopía; por ser más costosas para laboratorios de salud pública, podrían reservarse a pacientes pediátricos y pacientes inmunocomprometidos en hospitales, sin sustituir microscopía. Adicionalmente, los laboratorios de salud deben fortalecer la capacidad diagnóstica del personal a través de cursos de educación continua, facilitar la implementación de métodos de concentración (Giardia) y coloración ARM (Cryptosporidium), de aplicación universal y como base indispensable de experiencia.

Los cursos de educación continua que ofrece la Asociación Hondureña de Parasitología (AHPA), tienen como objetivo fortalecer, mejorar y actualizar la calidad técnica del personal de laboratorio y pueden ser una ayuda necesaria de tomar en cuenta. 20 Asimismo, el clínico debe ser alertado sobre estos parásitos en caso de que desconozca su presencia en la comunidad o su significado como causantes de enfermedad y la importancia de solicitar exámenes específicos cuando exista fuerte sospecha clínica. Esto permitiría mejorar la confiabilidad de los resultados, un manejo mejor dirigido del paciente y la construcción de datos epidemiológicos sobre la frecuencia de ambos parásitos, por lo menos en población que consulta al HE y en el CSAS

REFERENCIAS

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Notas de autor

¹ Máster en Ciencias, Parasitología; Técnico de Laboratorio

² Máster en Epidemiología, Licenciatura en Microbiología

camilaestela12@yahoo.com

Enlace alternativo

https://www.revistamedicahondurena.hn/assets/Uploads/Vol90-1-2022-7.pdf (pdf)

https://www.researchgate.net/publication/361957279_Evaluacion_de_pruebas_inmunologicas_en_el_diagnostico_de_Giardia_duodenalis_y_Cryptosporidium_spp_Honduras (html)

https://www.camjol.info/index.php/RMH/article/view/14394 (html)

http://www.bvs.hn/RMH/pdf/2022/pdf/Vol90-1-2022-7.pdf (pdf)