Marcação de Insetos para estudos biológicos

Insect Marking for biological studies

Martins de Araujo, Márcio; Sanhueza Salas, Fernando Javier; Arthur, Valter

Márcio Martins de Araujo

marcio_araujo@usp.br

Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares Brasil

Fernando Javier Sanhueza Salas

fernando.salas@sp.gov.br

Instituto Biológico de São Paulo. Laboratório e Estudo de vetores. Brasil

Valter Arthur

arthur@cena.usp.br

Centro de Energia Nuclear na Agricultura. Brasil

Revista de la Facultad de Agronomía

Universidad Nacional de La Plata, Argentina

ISSN: 1669-9513

Periodicidade: Semestral

vol. 121, núm. 1, 2022

redaccion.revista@agro.unlp.edu.ar

Recepção: 11/11/21

Aprovação: 15/02/22

URL: http://portal.amelica.org/ameli/journal/23/233043233043005/

DOI: https://doi.org/10.24215/16699513e093

Modelo de publicação sem fins lucrativos para preservar a natureza acadêmica e aberta da comunicação científica

ePub gerado a partir de XML JATS4R

Resumo: A técnica de marcação permite estudar os comportamentos e interações ecológicas dos insetos, como por exemplo padrões de dispersão, movimento, territorialidade, manuseio, consumo de alimentos, associações vetor-parasita, e cadeias ou teias alimentares. Essa revisão descreve as vantagens e desvantagens dos marcadores, destacando três métodos cujo diferencial é a permanência no inseto independente do estágio de vida. Os radioisótopos minimizam a manipulação direta e o trauma nos insetos, podem ser aplicados em grandes populações e são facilmente rastreáveis, porém o seu descarte limita a aplicação em campo. Os isótopos estáveis ocorrem naturalmente no ambiente, não são radioativos e estão relacionados à estudos ecológicos de níveis tróficos e processos metabólicos, dentre os elementos mais são utilizados, os isótopos de carbono refletem principalmente a dieta dos animais; os isótopos de nitrogênio refletem as práticas agrícolas (extensiva x intensiva) e em parte a dieta. Os isótopos de oxigênio e hidrogênio são vinculados à composição isotópica da água que, por sua vez, é dependente de fatores geográficos tais como altitude, clima e latitude. Por sua vez, os oligoelementos também são utilizados como marcadores internos (não radioativos) e podem variar de acordo com a localização geográfica alterando as quantidades encontradas nas plantas e insetos. Portanto, a busca de uma melhor metodologia que permita detectar a correlação dos insetos com o homem e o meio ambiente depende do tipo de estudo a ser realizado.

Palavras-chave: radioisótopos, isótopos estáveis, oligoelementos, dispersão, comportamento.

Abstract: The marking technique allows studying the behaviour and ecological interactions of insects, such as patterns of dispersion and movement, territoriality, handling and consumption of food, vector-parasite associations and food chains and webs. This review describes the advantages and disadvantages of markers, highlighting three methods whose differential is that they remain in the insect regardless of the stage of life. Radioisotopes minimize direct manipulation and trauma to insects, can be applied to large populations and are easily traceable, but their disposal limits field application. Stable isotopes that occur naturally in the environment are not radioactive and are related to ecological studies of trophic levels and metabolic processes, among the most used elements, carbon isotopes mainly reflect the diet of animals; nitrogen isotopes reflect agricultural practices (extensive x intensive) and in part diet and oxygen and hydrogen isotopes are linked to the isotopic composition of water, which, in turn, is dependent on geographic factors such as altitude, climate and latitude. Trace elements are also used as internal (non-radioactive) markers and can vary according to geographic location, changing the amounts found in plants and insects. Therefore, the search for a better methodology to detect the correlation of insects with man and the environment depends on the type of study to be carried out.

Keywords: radioisotopes, stable isotopes, trace elements, dispersion, behaviour.

INTRODUÇÃO

Quantificar a dispersão de insetos é a chave para entender a dinâmica da população e para responder a perguntas relacionadas às características comportamentais dos insetos e restrições fisiológicas ou genéticas. Mas, o objetivo de estudar a dispersão não é apenas aumentar o conhecimento fundamental das populações de insetos em si, mas também desenvolver sistemas de previsão para alertar os agricultores e silvicultores sobre invasões de pragas. O movimento em grande escala dos insetos causa problemas econômicos consideráveis na produção agrícola e nos sistemas florestais. As culturas fornecem uma concentração temporal e espacial de recursos que podem atrair ou prender muitos insetos de longas distâncias (Osborne et al., 2002).

Portanto, a liberação e captura é uma das principais estratégias para estudar o voo dos insetos em condições de campo, sendo possível determinar o raio de dispersão de um predador ou parasitóide em diversos agroecossistemas, além de viabilizar estudos sobre longevidade, crescimento, densidade e comportamento (Conrad et al., 2002).

A técnica pode ser utilizada tanto para insetos em laboratório quanto no campo, principalmente em trabalhos relacionados à ecologia e ao comportamento, sendo algumas premissas fundamentais para a utilização de qualquer técnica de marcação (Fernandes, 2002):

· A marcação não pode afetar o comportamento do inseto: o inseto marcado deve apresentar o mesmo comportamento que o inseto não marcado (selvagem), estando, dessa forma, perfeitamente integrado às condições de campo após a marcação e liberação.

· Os insetos marcados e não marcados devem ter a mesma probabilidade de captura: a marcação não pode afetar a coleta dos insetos. Há casos em que a marcação permite a visualização a distância (por exemplo, corantes fluorescentes). Isso pode, eventualmente, favorecer a observação de insetos marcados em detrimento daqueles não marcados e afetar o resultado. Por exemplo, se o objetivo é quantificar a população local, a maior probabilidade de observação de insetos marcados afeta diretamente a determinação do tamanho dessa população.

· A marcação deve ser durável: a marcação deve acompanhar o inseto por toda a sua vida ou pelo menos ser durável durante o período de estudo. O marcador não pode ser eliminado em função do comportamento do inseto ou por condições climáticas.

· A manipulação e a liberação não podem afetar a longevidade ou o comportamento do inseto: em alguns casos, os insetos precisam ser criados em laboratório e/ou capturados para serem marcados. Posteriormente, eles serão liberados, devendo comportar-se da mesma forma que os indivíduos selvagens, bem como ter a mesma expectativa de vida.

A marcação de insetos é descrita desde a década de 30, através do uso de etiquetagem (Fletcher, 1936), mutilação (Querci, 1936), tintas/manchas (Gillies, 1961; Mac Cord et al., 1983), pós fluorescentes (Chang, 1946), corantes internos (Bailey et al., 1962), corante alimentar (Williams, 1962), marcadores de proteína (Hagler et al., 1992), radioisótopos (Patterson et al., 1969; Zhou et al., 2004) e mais recentemente isótopos estáveis (Faiman et al., 2019).

Rastrear o movimento dos insetos em seu habitat natural é essencial para a compreensão de sua biologia básica, demografia e etologia. Uma ampla variedade de marcadores é usada para avaliar a dinâmica da população de insetos, dispersão, hábitos subterrâneos, territorialidade, comportamento alimentar, interações em nível trófico e outras interações ecológicas. O marcador ideal deve persistir sem inibir a biologia "normal" do inseto. Além disso, o marcador deve também ser ambientalmente seguro, econômico e fácil de usar (Hagler & Jackson, 2001).

A seleção da melhor técnica para marcação de insetos dependerá do sistema a ser estudado, ou seja, tamanho, estágio de vida e habitat, ou seja, não existe uma metodologia universal. Estudos preliminares devem ser feitos antes de conduzir qualquer investigação em que um marcador será usado para identificação. Dentre as várias opções de rastreamento, Lavandero et al. (2004) e El Sheikha (2019) listaram suas vantagens e limitações (Tabela 1). Apesar da maioria dos marcadores serem considerados eficazes para os seus respectivos propósitos, a flexibilidade dos isótopos quanto aos modos de aplicação, detecção e tipos de estudos a serem realizados aumentam seu potencial uso como ferramenta de pesquisa em contraste com os procedimentos convencionais. Assim, esta revisão analisa de forma abrangente as técnicas de radiomarcação, isótopos estáveis e oligoelementos, principalmente pela retenção nos processos metamórficos.

Tabela 1

Vantagens e desvantagens de diferentes técnicas de marcação e rastreamento para uso em estudos ecológicos e comportamentais de insetos.

Adaptado de Lavandero et al. (2004) e El Sheikha (2019).

1. RADIOISÓTOPOS

No final da década de 1940, as liberações isotópicas de operações nucleares demonstraram a utilidade dos radioisótopos para estudar a dinâmica dos sistemas biológicos e no início da década de 1950, os ecologistas estavam usando radioisótopos para novas áreas de pesquisa experimental. Marcar os insetos com radioisótopos para estudar a dispersão, densidades populacionais, comportamento e ingestão de alimentos tornou-se um método de marcação de insetos muito popular entre os anos 1950 e 1970 (Mastrangelo & Walder, 2011).

Os insetos são mais radiorresistentes do que os vertebrados superiores, mas menos resistentes do que bactérias, protozoários e vírus. Uma das razões para isso é a Regra de Dyar, ou seja, os artrópodes têm um crescimento descontínuo e a maioria das divisões celulares acontecem apenas durante o processo de muda (Behera et al., 1999).

A quantidade de um radioisótopo retido por um inseto após a administração de uma única dose, diminui exponencialmente ao longo do tempo devido à eliminação biológica e ao decaimento radioativo. O tempo necessário para que a quantidade de um determinado radiotraçador internalizado diminua pela metade em um determinado inseto é denominado meia-vida efetiva (Showler et al., 1988).

As vantagens de usar radioisótopos em vez de marcadores convencionais está relacionada a sua permanência relativa (corantes muitas vezes são removidos e a muda geralmente elimina as marcações externas), a rápida verificação e a possibilidade de rastrear os insetos marcados que estavam fora de vista (por exemplo, no subsolo). Vários traçadores foram estudados, como Cobalto 60, Estrôncio 89, Zinco 65, Iodo 131, Cálcio 45, Cério 144, mas o Fósforo 32 é o radioisótopo mais aplicado para marcação devido à sua meia-vida curta, segurança, atividade e fácil de detecção (Tabela 2) (O'brien & Wolfe, 1964).

Tabela 2

Principais radioisótopos utilizados em ecologia.

Neto et al. (1976).

Para análises mais prolongadas é necessário avaliar o ciclo de desenvolvimento do inseto a ser estudado. Quan et al. (1957) utilizaram Cério 144 como marcador persistente para populações de pulgas, mosquitos, baratas e carrapatos, sua meia vida é de 282 dias e o isótopo do seu decaimento denominado de Praseodímio 144 tem meia vida de 18 min, mas o seu beta energético de 2,97 MeV é alto e facilita sua detecção.

Uma das funções do radioisótopo é medir o consumo de alimentos, sem ser eliminado pelo sistema biológico do inseto. As larvas das abelhas Apis melifera Linnaeus, não defecam até pouco antes da pupação, assim o Trítio e ¹⁴C não são isótopos adequados pois podem ser perdidos como vapor de água tritíada (HTO) ou ¹⁴CO₂. (Dietz & Lambremont, 1970a). Já para o ³²P a retenção foi constatada durante o período larval, portanto foi possível mensurar o consumo alimentar entre as castas nas abelhas, onde as larvas que se transformaram em rainha tinham um consumo médio de 19% a mais do que as operárias (Dietz & Lambremont, 1970b).

Para marcação de duas espécies de lepidópteras Panaxia dominula Linnaeus e Arctia caja Linnaeus, Kettlewell (1952) tratou a fonte alimentar com enxofre (³⁵S) que possui meia vida de 87,1 dias e emite um raio beta de baixa energia (-0,168 MeV). As larvas alimentadas com as plantas tratadas apresentaram baixas contagens, diferentemente dos seus excrementos, porém, após a pupação os adultos possuíam contagens superiores. Isso, se deve ao fato de que o imago tem uma área de superfície maior do que uma larva, do qual a maioria dos raios beta foi absorvida. Também foi constatado a concentração de enxofre nas asas de alguns lepidópteros.

Arthur et al. (1987) utilizaram radioisótopo para avaliar a dispersão de adultos de Sphenophorus levis Vaurie, imergidos em solução de ³²P, por 15 minutos e liberados em dois talhões de cana-de-açúcar. Observaram que os machos se dispersam mais rapidamente que as fêmeas com distâncias de até 24,7 e 9,12 m, respectivamente, e a detecção desses insetos marcados foi de aproximadamente três semanas.

Para Buscarlet (1983), a principal vantagem é que as informações são obtidas do próprio inseto e não dos alimentos consumidos ou dos produtos retirados. Existem também algumas limitações que impõem a escolha adequada do traçador. Por exemplo, o conteúdo alimentar no isótopo original não marcado deve ser constante e alto o suficiente para induzir uma taxa mensurável de eliminação do traçador.

Esse método, indicado para consumidores primários ou predadores, se baseia na conservação do radioisótopo por meio do sistema "alimentos-insetos-corpos-produtos removidos". Se os insetos recebem alimentos uniformemente marcados, a absorção pode ser calculada a partir da quantidade de traçador medido no corpo e nos produtos removidos por secreção, excreção, respiração de CO2, (se ¹⁸O ou ¹⁴C foi utilizado), transpiração de água (se ¹⁸O ou ³H foi usado), produção de ovos e outros (Kasting & Mcginnis, 1965).

Para marcação de adultos de Aedes aegypti Linnaeus, Hassett & Jenkins (1951) constataram que a absorção de ³²P ocorre para larvas de terceiro e quarto instares devido à alta taxa de alimentação, e o acúmulo desse isótopo no tecido foi em média de 30% no intestino médio e posterior, 20% nos túbulos de Malpighi. As fêmeas acumulavam cerca de 15% nos corpos gordurosos e 5% nos músculos das asas. Outros 5% foram encontrados no cordão nervoso ventral e 9% nas glândulas salivares. Radeleff et al. (1952) criando moscas da bicheira, Callitroga americana Cushing e Patten, em dietas artificiais e naturais marcadas com ³²P, também observaram acúmulo desse radioisótopo no abdômen e no tórax dos adultos.

Moore et al. (1974) estudou o potencial uso da técnica de marcação de radioisótopos para investigação da relação predador-presa, utilizando ovos e larvas da traça Heliothis virescens Fabricius alimentadas com ³²P em solução de sacarose a 10%, para predação da joaninha Coleomegilla maculata DeGeer. Dessa maneira, através de equações de predição da análise de regressão pode-se saber o número de ovos ou larvas consumidos, desde que determine a radioatividade da presa antes do consumo.

Em laboratório Sgrillo et al. (1977) ao ministrarem solução açucarada contendo ³²P para adultos de Lixophaga diatraeae Towns, observaram que as larvas no interior das fêmeas incorporaram o radioisótopo, dessa forma, foi possível detectar um parasitismo de 24% em lagartas de Diatraea saccharalis Fabricius frente aos adultos marcados em gaiola ecológica.

Williams & Reichle (1968) estimaram a taxa de consumo do besouro Chrysochus auratus Fabricius através da eliminação de rubídio-86 e fósforo-32 inoculado em plantas de Apocynum cannabinum Linnaeus, os indivíduos consumiram 56,8% (15,9 mg) de seu peso corporal seco em alimentos por dia, da folhagem ingerida 43% matéria seca foi digerida e 56% da energia assimilada. O valor calórico (cal/g) do alimento digerido foi 1,17 vezes maior do que o consumido e os besouros assimilaram 87% do ⁸⁶Rb e 74% do ³²P presentes nos alimentos, sendo que a meia-vida biológica de ⁸⁶Rb no inseto foi de um dia, enquanto a de ³²P foi de 7,5 dias nas fêmeas e 10,2 dias nos machos, essa diferença possivelmente é um reflexo do metabolismo do fósforo envolvida na formação do ovo.

A aplicação é feita sobre o inseto ou na dieta e a sua detecção depende do tipo de radiação a ser medida, do estado físico da amostra e local podendo ocorrer através de um contador Geiger-Muller, cintilação liquida, detectores de cintilação sólida, autoradiografia e medidores portáteis de taxa (Showler et al. 1988). Sua transferência pode ocorrer a nível trófico superior facilitando a marcação de predadores, porém nos casos em que há trofalaxia é possível haver troca de material radioativo entre insetos marcados e não marcados, reduzindo a confiabilidade da técnica. Assim, por questões de segurança, deve ser utilizada apenas em ambientes fechados (laboratórios ou casas de vegetação) e tem custo elevado, porém, os insetos podem ser mantidos vivos (Fernandes, 2002).

2. ISÓTOPOS ESTÁVEIS

Um substituto para muitos métodos de radionuclídeos são os métodos de isótopos estáveis, uma vez que não apresentam riscos para a saúde ou para o meio ambiente e ainda podem ser empregados em condições de campo. Os isótopos estáveis não são radioativos, nem tóxicos e ocorrem naturalmente no meio ambiente. Esses elementos possuem átomos com o mesmo número de prótons, mas diferente número de nêutrons da forma mais comum do elemento encontrada na natureza, resultando em uma massa diferente, portanto, eles podem ser facilmente distinguidos. Por exemplo, um isótopo estável de nitrogênio (¹⁵N) e carbono (¹³C) são responsáveis por 0,732% e 1,08% de todo o nitrogênio e carbono, respectivamente (Michener & Lajtha, 2007).

Na biologia, os isótopos estáveis, incorporados aos tecidos dos insetos, são utilizados em estudos ecológicos de níveis tróficos e processos metabólicos, no campo da entomologia aplicada, os isótopos de carbono têm sido usados para a marcação e identificação permanente de insetos (Mainali et al., 2022). A variação natural dos isótopos estáveis é uma ferramenta que elucida a dinâmica espaço-temporal das vias ecológicas, aplicada com sucesso para rastrear uma ampla gama de organismos dispersantes e itens de interesse forense (Le Bot et al., 2011).

O princípio da técnica é que a composição isotópica estável de um animal seja determinada por sua dieta, que por sua vez irá refletir a “assinatura” do ambiente onde cresceu. Por exemplo, no caso do hidrogênio (H), a composição isotópica da chuva varia geograficamente de forma previsível, principalmente em função da temperatura, e qualquer organismo assumirá o perfil isotópico H da região em que se desenvolveu (Bowen, 2010). Assim Holder et al. (2015) através da análise de isótopos de hidrogênio das asas dos besouros Arhopalus ferus Mulsant, parte metabolicamente inertes após a emergência do adulto, conseguiram demonstrar que a infestação de um navio cargueiro provavelmente se originou em Auckland, Nova Zelândia.

A composição isotópica assimilada nos tecidos dos organismos é promovida pela discriminação de isótopos mais pesados durante processos biológicos (Botteon, 2018) e sua detecção é realizada por meio de espectrometria de massa e exige mão-de-obra especializada para manipulação do equipamento, os custos de análise por amostra, dependendo do isótopo e da matriz, pode variar de US$ 5 a 100,00. As assinaturas isotópicas naturais já são utilizadas em diversas áreas de pesquisa, dessa forma existe uma escala de padronização internacional às quais, grandes diferenças nas abundâncias dos isótopos de carbono (12C≈1,1%, 13C≈98,9%) e nitrogênio (15N≈0,3663% e 14N≈99,63%), as razões ¹³C/¹²C e ¹⁵N/¹⁴N são geralmente expressas em notação delta (δ) partes por mil (por mil ‰) (IAEA, 2009).

Além do seu potencial para o uso em quarentena de plantas, essa técnica pode fornecer informações para detectar hospedeiros alternativos de espécies invasoras fora de seu ambiente original. Dessa forma, com intuito de determinar a origem geográfica da população de Bactrocera dorsalis Hendel no norte da China, Zhao et al. (2018) estabeleceram uma relação entre a água da chuva e os valores das razões dos isótopos estáveis de hidrogênio (δ²H) nesse inseto e constataram que os valores de δ²H não eram consistentes com os da água da chuva em Pequim, mas sim para cidade de Fuzhou, no sudeste da China, esta disseminação provavelmente ocorreu devido o comércio interno de frutas e vegetais.

Para estudar a predação em condições de campo, Nienstedt & Poehling (2004) marcaram o pulgão Sitobion avenae Fabricius com isótopo estável ¹⁵N e ofertaram para predadores de diferentes estratégias de alimentação como por exemplo o besouro Platynus dorsalis Pontopiddan e a aranha Erigone atra Blackwall. Em seus resultados observaram que o conteúdo desse isótopo nos predadores estava acima do nível natural, até 11 dias após a ingestão, sendo este valor correlacionado com o número de pulgões marcado ingeridos, permitindo a sua quantificação. Além disso, o conteúdo de ¹⁵N aparentemente não foi influenciado pela ingestão de presas adicionais não marcadas.

Faiman et al. (2019) utilizaram oxido de deutério (²H₂O), por não deixa traços duradouros no ambiente sazonal e ser facilmente armazenado na quitina dos insetos, marcaram as espécies de Anopheles gambiae Giles, observaram que a disponibilidade do isotopo ²H para as larvas do mosquito foi aumentada por microrganismos coletados e cultivados localmente (ou seja, protozoários, algas e bactérias) fornecidos na dieta larval. Após o início de enriquecimento o isótopo pode ser detectado entre 5 a 7 dias, porem a faixa de segurança é de 10 a 15 dias. Por fim, os autores sugerem que essa marcação seja viável por mais de quatro meses proporcionando oportunidades para estudos de captura de marcas de longo prazo em grande escala.

Juarez et al. (2020) conduziram um estudo sobre dispersão de adultos de Ae. aegypti em duas comunidades residenciais no Texas, EUA, através do enriquecimento de recipientes com isótopos estáveis (¹³C e ¹⁵N) observaram a distância média e máxima percorrida por machos foi de 242 m e 429 m e para fêmeas foi de 195 m e 337 m respectivamente. De acordo com os autores os custos da análise isotópica por amostra deve ser aproximadamente US$ 6, e essa tecnologia pode ser usada para tratar questões relacionadas à biologia e ao controle de mosquitos em ambientes locais de diversas partes do mundo.

A diferença inerente nas assinaturas isotópicas de dietas de criação em massa comparadas com dietas selvagens nos fornece marcadores naturais de baixo custo para insetos criados em larga escala uma vez que as plantas vasculares terrestres diferem em suas razões ¹³C/¹²C por causa de suas vias fotossintéticas e enzimáticas, C₃, C₄ ou metabolismo ácido das crassuláceas (CAM) e sua discriminação relativa contra os átomos ¹³C mais pesados. Quase todas as árvores frutíferas e outras espécies de plantas dicotiledôneas são plantas C₃ (maçã, banana, frutas cítricas etc.) e possuem uma faixa isotópica entre −25‰ e −35‰ sendo a média de -27±2‰. Enquanto para as plantas C₄ pertencentes às Poaceae (cana-de-açúcar) e Cyperaceae, esses valores variam entre -7 e -18‰ com média de - 11‰ (Hood-Nowotny et al., 2016).

As plantas C₃ incorporam preferencialmente o ¹²C porque reduzem o CO₂ a fosfoglicerato através da enzima RuBP-carboxilase, que é sensível às diferenças de massa dos isótopos de carbono; já as plantas C₄ reduzem o CO₂ a ácido aspártico ou málico através da enzima PEP-carboxilase, que não possui o poder discriminatório da RuBP-carboxilase (Boutton, 1991). Esses valores isotópicos agrupados em intervalos distintos e sem sobreposição permitem identificar a dieta dos animais a partir da análise isotópica dos produtos em questão, uma vez que a assinatura isotópica dessa fonte alimentar é refletida nos tecidos específicos dos animais após certo tempo de metabolismo (Deniro & Epstein, 1978; 1981)

As assinaturas de isótopos de C, O, N e S em insetos criados em massa são geralmente independentes umas das outras, ou seja, fonte de açúcar, fonte de água usada para fazer a dieta, fertilização da fonte primária de N na dieta e as condições geográficas de origem da fonte S. Isso significa que eles podem ser tratados como marcadores independentes (Girón & Ríos, 1980).

As proteínas (medidas pelo nitrogênio) e os carboidratos (medidos pelo carbono) exercem influência no estado fisiológico e nutricional de um inseto (Le Gall & Behmer, 2014), em laboratório as respostas de forrageamento por fêmeas de Bactrocera tryoni Froggatt aos locais de proteína e oviposição estão correlacionadas com o nitrogênio e o carbono corporal total, dos quais baixos níveis elevam a busca por proteínas, enquanto que altos níveis correspondem a maior procura para oviposição (Balagawi et al., 2014). Além disso, a alimentação de proteína aumenta a longevidade e o sucesso de acasalamento dos machos, onde as fêmeas acasaladas por esses indivíduos alimentados com proteínas armazenam esperma por mais tempo comparados com aqueles desprovidos de proteínas (Prabhu et al., 2008). De acordo com Wigglesworth (1972), o metabolismo por grama de peso corporal do inseto diminui com o seu crescimento, de modo que a respiração é proporcional à massa do indivíduo com um expoente fracionário cerca de 2/3 (0,67).

No estudo realizado por Zhou et al. (2004) através de proteínas marcadas com ¹⁴C na dieta de fêmeas de A. aegypti, observaram que para atender à necessidade dos processos fisiológicos, incluindo atividades reprodutivas e sobrevivência após o primeiro ciclo gonotrófico, são necessárias reservas adicionais de proteínas. Além disso, carboidratos, incluindo açúcares e glicogênio derivados dos aminoácidos da proteína da refeição, atingiu rapidamente cerca de 5% (3% de açúcares mais 2% de glicogênio) em 1 h, enquanto o nível de reserva de lipídeos atingiu cerca de 2,5% neste momento, sugerindo que a gliconeogênese dos aminoácidos das proteínas da refeição é uma via metabólica de resposta rápida, em comparação com a lipogênese. Por outro lado, a conversão máxima de aminoácidos em açúcares mais glicogênio (7%) foi menor do que a conversão em lipídeo (16%). Isso sugere que a lipogênese deve atender às necessidades das reservas maternas de triaciglicerol (TAG) e dos lipídios do ovo.

Para Drosophila nigrospiracula Patterson e Wheeler, a mudança dos recursos alimentares do hospedeiro natural para uma dieta de laboratório de levedura por apenas 24 horas resultou em uma mudança nas assinaturas de isótopos estáveis em direção aos valores do novo recurso, isto valida sua aplicação em estudos de ecologia de recursos e habitats alimentares sendo sensível o suficiente para detectar mudanças dietéticas recentes, desde que os hospedeiros difiram em suas razões de isótopos estáveis (Markow et al., 2000).

Na Austrália, Mainali et al. (2022), comparou as razões isotópicas de carbono e nitrogênio entre B. tryoni criadas em diferentes dietas de larvas e moscas selvagens coletadas. Devido a variabilidade da fonte de alimento na fase larval e adulta valores de δ¹⁵N foram inconclusivos, porém, na análise de δ¹³C foi possível determinar a origem das moscas das frutas e rastrear mudanças na composição isotópica conforme as dietas dominadas por C₄ (laboratório) e C₃ (frutos de plantas). Isto demonstra que o uso de açúcar C₄ na dieta de larvas e adultos pode ser um marcador intrínseco adequado de moscas das frutas liberadas em um programa Técnica do Inseto Estéril. Resultado similar ao de Botteon (2018) que com Anastrefa fraterculus Wiedemann obteve valores diferentes de δ¹³C comparado as moscas selvagens e criadas em frutos a base de fontes C₃, mesmo após 15 dias de mudança de dieta.

Kjeldgaard et al. (2021) avaliaram as interações inter e intracoloniais em populações introduzidas de formigas Solenopsis invicta Buren no Texas e para quantificar o compartilhamento entre ninhos monogínicos (colônias com uma única rainha que põe ovos) e poligínicos (colônias com várias rainhas que põem ovos) no campo foi oferecido as operarias de cada ninho uma solução de sacarose contendo glicina marcada com ¹⁵N. Cinco dos 52 ninhos não tratados mostraram evidências de compartilhamento com o ninho tratado (dois monogínicos e três poligínicos) a 5 metros de distância, possivelmente ninhos polidômicos, pois de modo geral as colônias se comportaram de forma idêntica, sugerindo que ambas as formas sociais mantêm limites estritos de colônia, independente da distância.

3. OLIGOELEMENTOS (ELEMENTOS RAROS)

As técnicas de marcação com elementos raros foram desenvolvidas na década de 1970 como uma alternativa à marcação de insetos com isótopos radioativos. Os oligoelementos são usados como ferramentas de marcação interna em aproximadamente 8 ordens e 30 famílias de insetos, incluindo carrapatos e aranhas. Alguns desses utilizados na marcação incluem os elementos rubídio (Rb), estrôncio (Sr), césio (Cs), manganês (Mn), háfnio (Hf) e irídio (Ir) e os elementos lantanídeos: lantânio (La), samário (Sm), európio (Eu), disprósio (Dy) e cério (Ce). Esses elementos são utilizados na forma natural (não radioativa) e, em geral, adicionados à dieta na forma de cloreto, sendo que, o Rb em sua forma de cloreto (RbCl) é o marcador mais frequentemente usado para insetos (Hagler & Jackson, 2001).

A análise dos elementos de césio, estrôncio e rubídio, após digestão do material orgânico, pode ser feita por meio de espectrofotometria ou espectroscopia (plasma). Entretanto, para os lantanídeos como o disprósio, a detecção do seu teor deve ser realizada por meio da ativação de nêutrons. Durante esse processo, o ¹⁶⁴Dy, que é um isótopo de ocorrência natural, forma o isótopo ¹⁶⁵Dy, que emite radiação gama. Essa emissão pode ser detectada por meio de filme de raio X, que fica marcado pela radiação (Fernandes, 2002).

Para determinação do nível de marcação com elementos raros, Stimmann (1974) considera que os insetos marcados atinjam pelo menos a média acrescida 3 vezes o desvio padrão em comparação com os insetos controle, dessa forma mais de 99% dos insetos de campo devem possuir valores inferiores encontrados nos insetos marcados. Conhecendo as concentrações dos elementos no alimento, no inseto e nas fezes, podem-se determinar os a porcentagem de alimento ingerido, digerido e sua conversão em biomassa (Parra et al., 2013).

Hopper & Woolson (1991) conseguiram marcar o parasitóide de Heliothis sp., Microplitis croceipes Cresson,por até vinte dias após a emergência, usando isolada ou conjuntamente os elementos Dy, Cs, Rb e Sr, constatando que a utilização de mais de um elemento para marcação permite um maior número de combinações e, conseqüentemente, maiores possibilidades de marcação de insetos.

A praticidade de marcar insetos com oligoelementos depende de alguns fatores, listados na revisão de Hagler & Jackson (2001):

· Os níveis naturais dos elementos-traços, encontrados na crosta terrestre, podem variar de acordo com a localização geográfica e alterar as quantidades encontradas em plantas e insetos;

· A absorção desses elementos varia de acordo com a espécie, portanto é necessário determinar os níveis dos oligoelementos antes de iniciar os estudos com marcação;

· Existe uma correlação entre a quantidade do marcador com tamanho do inseto, aumentando ainda mais a variabilidade entre espécies;

· Para essa técnica é importante aplicar a concentração mais alta possível sem afetar a fisiologia e comportamento do inseto, fornecendo assim a marca acima da quantidade encontrada em insetos não marcados;

· O modo de aplicação determina sua intensidade e duração;

· Por fim, a quantidade de oligoelemento retido por um inseto pode diminuir ao longo do tempo devido a alimentação, excreção, acasalamento e oviposição.

Para Ceratitis capitata Wiedemann o Rb pode ser usado como marcador fisiológico interno para avaliar a dispersão em campo, sendo incorporado ao inseto por meio da alimentação de larvas ou adultos em plantas hospedeiras tratadas com aplicações foliares. A concentração mínima de Rb necessária na dieta larval para marcar as moscas adultas seria de aproximadamente 3000 µg Rb/g e para adultos cerca de 1000 µg Rb/g, e estas concentrações são alcançadas por meio de múltiplas aplicações de aproximadamente 10 g Rb/L na planta hospedeira (Van Steenwyk et al., 1992).

Wilkins et al. (2007) ao alimentar larvas de Anopheles gambiae e Anopheles stephensi Liston em RbCl constataram que o aumento nas concentrações desse elemento afeta a longevidade, portanto passaram a recomendar uma concentração de 200 ppm para marcação de ambas as espécies, onde a detecção de Rb em machos adultos ocorre a partir de 6 dias de idade e fêmeas adultas 10 dias de idade.

Já Maciel de Freitas et al. (2004) avaliaram a marcação de ovos de Aedes albopictus Skuse após uma única refeição de sangue contendo RbCl, e encontraram uma concentração molar ideal de 0,025 M resultando em mais de 80% dos lotes de ovos marcado com Rb. Nas fêmeas adultas esse elemento foi detectado essencialmente no abdômen, cuja produção de ovos e sobrevivência não diferiram das não marcadas, pelo menos nas três semanas seguintes à refeição de sangue marcada.

Kumano et al. (2021) utilizando dieta artificial tratada com 0,5% de Rb para machos de Euscepes postfasciatus Fairmaire, constataram a transferência deste oligoelemento na ejaculação em fêmeas inseminadas sem afetar sua longevidade, portanto essa metodologia permite monitorar o nível espacial de esterilidade em um programa de erradicação através do desempenho de machos estéreis frente as fêmeas selvagens.

CONCLUSÕES

Entender a dispersão dos insetos é fundamental para compreensão de sua biologia, demografia e etologia. A marcação dos insetos não pode afetar seu comportamento, deve ter duração correspondente ao tempo de estudo, não ser tóxico, fácil aplicação e identificação, além disso é prudente considerar o custo-benefício e a segurança ambiental para determinar sua viabilidade. As três técnicas discutidas nessa revisão, apresentam um grau de permanência elevado, independem do tamanho do inseto e localização para rastreio. Para radioisótopos as informações são obtidas pelo próprio inseto, já para isótopos estáveis e oligoelementos é necessário determinar a quantidade de traçador na dieta. A composição isotópica assimilada nos tecidos dos organismos é promovida pela discriminação de isótopos mais pesados durante os processos biológicos, podem ser detectadas em consumidores primários, predadores e na própria prole, outra característica relevante na área radioentomológica é a identificação de espécies invasoras de acordo com sua região, demonstrado a versatilidade dessas ferramentas.

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