Identificación de microorganismos asociados al suelo, sustrato y agua de un sistema productivo de Cannabis sativa L.

Identification of microorganisms associated with the soil, substrate and water of a Cannabis sativa L. production system.

Patiño Moscoso, Manuel Alfonso; Rodríguez Yzquierdo, Gustavo Adolfo; Betancourt Vásquez, Mónica

Manuel Alfonso Patiño Moscoso

mbentancourtv@agrosavia.co

Agrosavia Colombia

Gustavo Adolfo Rodríguez Yzquierdo

Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria Agrosavia, Mosquera, Colombia. Colombia

Mónica Betancourt Vásquez

mbentancourtv@agrosavia.co

Agrosavia Colombia

Temas Agrarios

Universidad de Córdoba, Colombia

ISSN: 0122-7610

ISSN-e: 2389-9182

Periodicidad: Semestral

vol. 27, núm. 1, 2022

revistatemasagrarios@correo.unicordoba.edu.co

Recepción: 25 Mayo 2022

Aprobación: 03 Junio 2022

URL: http://portal.amelica.org/ameli/journal/218/21834982183498010/

Temas Agrarios 2021. Este artículo se distribuye bajo los términos de la Licencia Creative Commons Attrubution 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/deed.es), que permite copiar, redistribuir, remezclar, transformar y crear a partir del material, de forma no comercial, dando crédito y licencia de forma adecuada a los autores de la obra

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Resumen: El cultivo de cannabis medicinal ha tomado una gran importancia en los últimos años en Colombia y en otros países de Latinoamérica. Dadas las características de producción del cultivo, que se basa fundamentalmente en modelos orgánicos, es importante conocer los microorganismos que acompañan el sistema de producción y sus posibles implicaciones en el manejo. En este trabajo se aislaron y caracterizaron los microorganismos en las diferentes fases de producción de un cultivo de cannabis en alta densidad: plantulación, o áreas de propagación, lotes de producción y las áreas de poscosecha (presecado de flor); en cada una de estas áreas se tomaron muestras de: suelo, sustratos y agua y se identificaron los microorganismos presentes, por siembra directa en medios de cultivos, empleando identificación microscópica y caracterización molecular. Se encontró una alta diversidad en todas las áreas de producción y se evidenció que los microorganismos benéficos (Trichoderma spp. y Bacillus spp.) aplicados al sistema productivo ayudan a regular las poblaciones de los microorganismos en el suelo y en lo sustratos. Se identificó que la perlita y la fibra de coco favorecen el desarrollo de las poblaciones de microorganismos solubilizadores de fósforo y fijadores de nitrógeno y que la producción de compost a partir de los desechos del cultivo es fitosanitariamente seguro. No se identificó en ninguna de las muestras evaluadas poblaciones de patógenos en niveles que pudieran explicar la presencia de enfermades en el cultivo.

Palabras clave: Microorganismos, Cannabis, Suelo.

Abstract: Cultivation of medicinal cannabis has become important in recent years in Colombia and other Latin American countries. Considering the production characteristics of the crop, which is fundamentally based on organic models, it is important to know the microorganisms associated with the production system and their possible implications for management. In this research, microorganisms were isolated and characterized in different growth phases of a high-density cannabis crop: planting, or propagation areas, production areas, and postharvest areas (pre-drying flowering). Samples of soil, substrates and water were taken, and the present microorganisms were identified by direct sowing in culture media, using microscopic identification and molecular characterization. A high diversity was found in all production areas, and it was evidenced that beneficial microorganisms (Trichoderma spp. and Bacillus spp.) applied to the production system regulate the microorganism populations in soil and substrates. It was identified that perlite and coconut fiber allow increasing populations of phosphorus solubilizing and nitrogen fixing microorganisms. Compost from crop remains is safe at a sanitary level. No pathogen populations at disease levels for the crops were identified in samples.

Keywords: Microorganisms, Cannabis, Soil.

INTRODUCCIÓN

En Colombia el cultivo de Cannabis (Cannabis sativa L.) con fines medicinales representa una alternativa productiva muy importante para Colombia, la cual se encuentra enmarcada en la Ley 1787 de 2016. Antes del año 2000 el uso lícito del cannabis estaba limitado a la investigación científica. Sin embargo, a partir de esa fecha muchos países desarrollaron legislaciones para aprobar su uso medicinal, generando un aumento considerable de la producción. Para el año 2000 la producción mundial se estimó en 1,4 toneladas (ton), mientras que para el año 2017 se registraron 406,1 ton (Ramírez, 2019).

Las plantas de cannabis contienen varios tipos de cannabinoides, dentro de los más conocidos están: tetrahydro cannabinol (THC), y el cannabidiol (CBD). Mientras que el THC tiene efectos psicoactivos el CBD tiene nula o baja psicoactividad; pero tiene un alto potencial para el manejo y la disminución del dolor asociado a diferentes enfermedades en humanos (Zuardi, 2006, André et al., 2016, Sharafi et al., 2019,) y por esta razón, su cultivo empieza a expandirse rápidamente en Colombia y en otros países del mundo (Adesina, et al., 2020).

El Cannabis con fines medicinales puede ser cultivado a libre exposición o en condiciones protegidas. Sin embargo, para la producción de aceites u otros derivados farmacéuticos a base de cannabidiol es muy común que se usen espacios controlados que permiten regular parámetros ambientales como: luz (cantidad y calidad), temperatura, humedad relativa, fotoperiodo y el nivel de dióxido de carbono, implicados directamente en los niveles y concentración del CBD. Además, para masificar los procesos de producción en general se utilizan cultivos a alta densidad y ciclos continuos, con manejos intensivos en condiciones controladas (Chandra et al., 2020).

Este tipo de sistemas de producción en condiciones intensivas y controladas, tienen como desventaja que favorecen la aparición de plagas y enfermedades, las cuales pueden volverse endémicas, debido a la alta uniformidad genética y a las condiciones favorables climáticas para el desarrollo de patógenos foliares y del suelo (Chandra et al., 2010, Chandra, et al., 2011). Para el caso de Cannabis esta condición es muy limitante, debido a que existen numerosos reportes que indican que las aplicaciones de plaguicidas pueden afectar la acumulación y calidad de contenidos de CBD o pueden generar contaminaciones de metales pesados en las inflorescencias afectando el uso y consumo para los humanos (Montoya et al., 2020, Amendola et al., 2021), lo cual limita y dificulta considerablemente el manejo agronómico y sanitario de los cultivos.

Muchos de los sistemas productivos de cannabis requieren una fase previa en la multiplicación del material vegetal denominada comúnmente plantulación, en esta etapa se requieren sustratos para la propagación del material vegetal en forma asexual y es una fase crítica por las posibles pérdidas que ocurren debido a problemas sanitarios. De igual modo, en condiciones protegidas, durante la fase de trasplante, se emplean sustratos como lana de roca o fibra de coco en mezcla con abonos orgánicos y suelo (Chandra et al., 2020; Punja, 2021). Las características microbiológicas de estos sustratos pueden tener efectos en el tipo de patógenos o plagas presentes en los cultivos y, por lo tanto, determinar su composición microbiológica es importante dentro del manejo integrado del sistema (Punja, 2021).

Los microrganismos presentes se convierten en un componente fundamental del funciona- miento de un sistema productivo. Las plantas exhiben una diversa gama de interacciones con estos organismos que habitan en el suelo, que abarcan un gran rango de posibilidades ecológicas (competitivas, explotadoras, neutrales, comensales, mutualistas) (Jacoby et al., 2017). Por lo tanto, es necesario comprender la comunidad de microrganismos presentes en el suelo y sustratos para desarrollar estrategias de prevención y control más eficientes (Zheng et al., 2020). Por su parte, la calidad del agua en sistemas intensivos de cannabis es un elemento primordial para; por una par- te, contar con una adecuada eficacia de los controladores biológicos que normalmente son aplicados, y por otra, evitar dispersión de problemas sanitarios por el uso de aguas de inadecuada calidad en términos de presencia de microorganismos patogénicos en labores tales como riego o aplicación de bioinsumos al cultivo (Sutton et al., 2006, Punja, 2021).

La caracterización de estos microrganismos, acompañada de un diagnóstico acertado de los agentes causales de las enfermedades, así como su posible fuente de ingreso en todas las etapas de producción, cosecha y postcosecha, contribuyen significativamente a la generación de estrategias encaminadas al mejoramiento de la eficiencia productiva, el aseguramiento de la calidad y la inocuidad del producto. Así mismo es necesario caracterizar y comprender las funcionalidades y asociaciones de los microrganismos potencialmente benéficos presentes en las diferentes fases productivas y los insumos empleados en ellas, con el fin de mejorar las prácticas agrícolas, el desempeño agronómico de los materiales y el rendimiento en la cantidad y calidad de cannabinoides (Taghinasab y Jabaji, 2020).

Por lo anteriormente señalado, el objetivo del este trabajo fue aislar, caracterizar, identificar y conservar microrganismos asociados al suelo, sustratos y aguas en un sistema productivo de cannabis con fines farmacéuticos, con el fin de avanzar en el entendimiento de lo que significan las comunidades de microorganismos presentes para la producción integrada y eficiente de este cultivo.

MATERIALES Y MÉTODOS

El trabajo se desarrolló en un cultivo del departamento de Antioquia, caracterizado por su producción bajo invernadero, en suelo suplementado con materia orgánica y en altas densidades. El cultivo de cannabis bajo invernadero, en general se caracteriza por tener diferentes etapas en la producción: plantulación, o áreas de propagación, lotes de producción y las áreas de poscosecha (presecado de flor), en cada una de estas áreas se tomaron muestras de: suelo, sustratos y agua, mensualmente por un periodo de 12 meses, con el fin de caracterizar los microorganismos presentes y su relación con la presencia de enfermedades en el cultivo o el establecimiento de los organismos benéficos aplicados en el sistema.

Para el caso de sustratos se tomaron en las áreas de plantulación, muestras directamente de los sacos que se usaban para rellenar las bandejas. El sustrato estaba compuesto por turba, fibra de coco, perlita y compost en relación (1:1:1:0,5). Las muestras de agua se tomaron de las distintas fuentes de riego, en momentos diferentes de un día de trabajo

En la finca en evaluación se preparaba compost a partir de los desechos de la misma planta de cannabis (podas de formación, podas sanitarias y residuos de cosecha), más la adición de organismos benéficos (organismos eficientes y Trichoderma spp.) y por lo tanto, era importante conocer si el compost podría tener implicaciones en la dispersión de enfermedades dentro del cultivo. Se tomaron muestras del compost provenientes de diferentes partes de la pila; teniendo cuidado de tomar siempre de aquellas que habían culminado su proceso de maduración y empezaban usarse para la preparación de sustratos o enmiendas orgánicas. Cada muestra estaba compuesta de 10 submuestras de 100 gramos, para un total de 1 kilo de muestra de trabajo. Se tomaron muestras en cuatro momentos diferentes que corresponden en adelante a las muestras de Compost 1 a 4.

Cada material fue procesado de manera diferencial como se describe a continuación.

Procesamiento de muestras

Suelo, compost y sustratos:

Se suspendió 1 g de la muestra en 9 ml de solución salina NaCl al 0,85%. La suspensión se dejó en agitación durante 1 hora para posteriormente realizar diluciones seriadas. De las diluciones 10-2 a 10-5 se sembraron 100 µL por caja por triplicado en medios Potato Dextrosa Agar (PDA) + Tritón (100 µL/L) + Cloranfenicol (- 0,05 g/L) para hongos, Agar Nutritivo para bacterias, tripticasa de soya para actinomicetos, Ashby (bacterias presuntivas fijadoras de nitrógeno) y SMRS (bacterias presuntivas solubilizadoras de fósforo) (Becerra et al., 2011; Betancur, 2018; López et al., 2010).

Agua: Las muestras de agua tomadas, fueron procesadas en diluciones 100 a 10-2, las cuales se sembraron por triplicado en medio PDA + Tritón + Cloranfenicol y Agar Nutritivo (100 µL por caja).

Estas se incubaron en oscuridad a 25oC durante 7 días. Día en el cual se realizó el recuento de unidades formadoras de colonia en cada una de las diluciones. Se realizaron improntas de los aislamientos fungosos, puros para observar al microscopio estructuras características de los hongos (Langvad, 1980). Se realizó además Tinción de Gram a los aislamientos bacterianos (O’Toole, 2016).

Caracterización de los aislamientos

Las colonias puras de cada uno de los aislamientos fueron caracterizadas morfológicamente (macroscópica y microscópica) y molecularmente. Se realizó extracción de ADN siguiendo la metodología propuesta por Griffith y Shaw (1998) para hongos y el Kit UltraClean® Microbial DNA Isolation Kit para bacterias (Mobio Technologies Inc.). Posteriormente se realizó amplificación por PCR empleando los primeros ITS1F-ITS4 (ITS1-F 5ʹ-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3ʹ y ITS45ʹ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ʹ) para hongos y 27F-1492R (27F 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) para bacterias. Las secuencias resultantes fueron comparadas con la región ITS1-5.8S-ITS2 (hongos) y del Gen ARNr 16s (bacterias) correspondiente de las secuencias de la Base de datos GenBank del Centro Nacional para La Información Biotecnológica (NCBI).

Los biotipos de hongos y bacterias se encuentran actualmente conservados en medio PDA y Agar nutritivo a-4oC (3 copias de cada aislamiento) y en Crioviales en solución de crioconservación (Glicerol 20% y Peptona al 0.5%) a-80oC.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Las muestras Compost 1 y Compost 2 presentaron la mayor concentración de hongos totales, en el orden de los 3 a 5 millones de UFC por gramo de sustrato. Así mismo la muestra de Compost 3 al momento de su recolección evidenció la mayor concentración de bacterias mesófilas con aproximadamente 124 millones de UFC por gramos de sustrato. La muestra de Compost 4 mostró una disminución significativa de la concentración de hongos y bacterias totales (Tabla 1 y Figura 1).

Los análisis microbiológicos indicaron la presencia de bacterias en el sustrato perlita, y de hongos y bacterias en la muestra de coco, lo cual puede considerarse normal, dado que los proveedores del material no garantizan su esterilización, por lo tanto, este tipo de sustratos pueden contener importantes concentraciones de microorganismos.

Adicionalmente diversos reportes indican que es frecuente encontrar hongos y bacterias lignocelulolíticos capaces de degradar la fibra de coco, o incluso estar presentes de forma latente mediante estructuras de resistencia (endosporas para el caso de bacterias como bacilos y cocobacilos) a la espera de condiciones adecuadas para su crecimiento (Gupta et al., 2016). Los datos encontrados, parecen indicar que la fibra de coco, la turba y el compost, están contribuyendo significativamente en el enriquecimiento de la microbiota benéfica en las mezclas de suelo inoculado con poblaciones de solubilizadores de fósforo y fijadores de nitrógeno. Probablemente las condiciones de escases de nutrientes en el sustrato de coco favorecen la selección de este tipo de microorganismos benéficos (Filippidou et al., 2016).

Figura 1. Crecimiento de algunos hongos y bacterias aisladas de sustratos y aguas en sistema productivo de Cannabis medicinal. A. UFC de hongos en Compost 2 b. UFC de hongos en fibra de coco c. UFC de bacterias en mezcla de suelo inoculado d. UFC de bacterias en perlita e. Colonia de Aspergillus niger f. Colonia de Penicillium roseomaculatum g. Colonia de Trichoderma longibrachiatum h. Colonia de Fusarium oxysporum i. Colonia de Bacillus pumilus j. Colonia de Lysinibacillus sphaericus k. Colonia de Bacillus aerius l. Colonia de Lysinibacillus fusiformis.

Tabla 1. Recuento de unidades formadoras de colonia en muestras de aguas y sustratos.

Muestra | Unidades | Hongos totales | Bacterias totales | Actinos | Solubilizadores P | Fijadores N
Compost 1 | UFC.gˉ¹ | 4,97 x 108 | - | - | - | -
Compost 2 | UFC.gˉ¹ | 2,40 x 10⁶ | - | - | - | -
Compost 3 | UFC.gˉ¹ | 3,15 x 10⁴ | 1,24 x 10⁸ |  |  |
Compost 4 | UFC.100mlˉ¹ | 3,67 x 10³ | 8,06 x 10⁶ | <100 | 1,4 x 10⁶ | > 10000
Perlita | UFC.gˉ¹ | <1000 | 6,33 x 10⁵ | - | - | -
Coco | UFC.gˉ¹ | 1,47 x 10⁵ | 9,57 x 10⁷ | 0 | 5,1 x 10⁵ | 1,23 x 10⁷
Turba | UFC.gˉ¹ | 7,63 x 10⁴ | 5,57 x 10⁷ | 6,67 x 10³ | 4,1 x 10⁴ | 9,33 x 10⁵
Mezcla suelo inoculado | UFC.gˉ¹ | 8,88 x 10⁴ | 6,7 x 10⁷ | 0 | 3,00 x 10⁵ | 3,93 x 10⁶
Suelo Bloque producción | UFC.gˉ¹ | 7,38 x 10⁴ | 1,9 x 10⁷ | 3,67 x 10³ | 6,00 x 10⁵ | 1,49 x 10⁷
Agua confinamiento | UFC.100mlˉ¹ | <10 | 3,57 x 10³ | - | - | -
Agua cruda | UFC.100mlˉ¹ | <10 | 1,10 x 10⁴ | - | - | -

UFC.gˉ¹: Unidades formadoras de colonia por gramo de sustrato; UFC.100mlˉ¹: Unidades formadoras de colonia por 100 ml de suspensión. Los datos corresponden a la media de tres repeticiones en tres ensayos repetidos en el tiempo.

Las muestras de Compost 1 y Compost 2, evidenciaron la mayor diversidad de hongos con 7 biotipos diferentes y la muestra de Compost 3, mostró la mayor diversidad de bacterias con 6 biotipos caracterizados (Tabla 2 y Tabla 3). Ya que el compostaje es un proceso biológico llevado a cabo por microorganismos, estos hallazgos parecen ser coherentes e indicadores de un proceso adecuado de compostaje que está favoreciendo la riqueza de diferentes especies (Cao et al., 2019) El mayor porcentaje de aislamientos obtenidos correspondió a Penicillium y Lysinibacillus; organismos ubicuos, presentes en gran diversidad de ambientes igual a lo descrito por Christian et al., 2019, Yadav et al., 2017.). (Tabla 2 y Tabla 3).

En la muestra de Compost 1 se encontraron 7 biotipos de hongos filamentosos diferentes, los cuales por caracterización molecular correspondieron a los géneros Cladosporium sp., Penicillium sp., Aspergillus sp., Plectosphaerella sp., Rasamsonia sp., Geomyces sp., entre otros. Estos son géneros de hongos ubicuos, habitantes comunes de suelos. Solo los aislamientos de Cladosporium sp. podrían representar una amenaza potencial en caso tal que fueran considerados patógenos en la especie Cannabis sativa (Punja et al., 2019, Punja et al., 2018).

En ninguno de los sustratos, compost o suelos evaluados se aislaron biotipos de los géneros Pythium sp., Rhizoctonia sp., Cercospora sp., Sclerotinia sp., los cuales se han reportado frecuentemente como patógenos en plantas de Cannabis sativa (Punja et al., 2019) y los cuales además eran considerados las principales limitantes del cultivo en evaluación. Considerando que el compost que se utiliza en sistema productivo se obtiene a partir del procesamiento del material de cosecha (hojas, tallos) de plantas enfermas y/o sanas, este resultado indica que el proceso de compostaje se está haciendo correctamente y que se está cumpliendo con las fases que garantizan la calidad microbiológica del compost (De Corato, 2020). De igual forma en la muestra Compost 3, cinco de los 6 biotipos aislados de bacterias fueron bacilos Gram + esporulados lo cual es otro indicador del correcto proceso de compostaje efectuado en la finca (Tabla 3), Durante la etapa termofílica de compostaje poblaciones de bacterias patógenas (En su mayoría Gram-) se reducen y solo aquellas capaces de generar estructuras de resistencia como endosporas (Gram+) sobreviven (Chandna et al., 2013). La presencia de bacilos aerobios Gram + esporulados (BAFES) en las muestras de Compost también podrían estar relacionados con la aplicación de algún inoculante a base de Bacillus spp. que era de común uso en el sistema productivo evaluado.

La riqueza de hongos encontrados en la muestra de compost 3 fue significativamente más baja que en las muestras de Compost 1 y Compost 2 (Tabla 2). En esta muestra solo se encontraron dos morfotipos pertenecientes a los géneros Plectosphaerella sp. y Aspergillus sp. (Tabla 2). La prevalencia de Bacilos Gram + esporulados en la presente muestra es un indicador más del proceso adecuado de compostaje como se ha mencionado anteriormente donde solo las bacterias mesófilas que presenten estructuras de resistencia o latencia pueden sobrevivir a las etapas termofílicas de compostaje (Chandna et al., 2013).

En la fibra de coco se aislaron biotipos que por caracterización molecular pertenecen a los géneros Penicillium sp., Aspergillus sp. y Fusarium sp. Los biotipos del género Penicillium evidenciaron una mayor concentración (cercanos a los 6000 UFC.ml₋₁) junto con el biotipo de Fusarium (cercano a los 10.000 UFC.ml₋₁) en este sustrato con respecto a los otros biotipos aislados.

El género Fusarium sp. comprende una amplia variedad de especies no patogénicas que viven de forma saprofita en muchos ambientes (Karim et al., 2016). En esta misma muestra se encontraron tres biotipos de bacterias Gram -, que por caracterización molecular correspondieron a los géneros Klebsiella sp., Enterobacter sp., Cronobacter sp. y una Gram +, Lysinibacillus sp. Un mismo comportamiento se encontró en la perlita, la cual, a pesar de no mostrar la presencia de hongos, evidenció la aparición de tres morfotipos característicos de bacterias (Bacilo Gram + esporulado, Bacilo Gram – y Coco Gram +). Con la caracterización molecular de estos aislamientos se encontró que correspondían a bacterias de los géneros Bacillus sp., Staphylococcus sp. y Lysinibacillus sp. (Tabla 3). Lo cual indica que se trata de un sustrato que no representa una amenaza desde el punto de vista fitosanitario para el sistema productivo y por el contrario podrían tener algún papel en el control biológico de patógenos del suelo, como los descritos para el género Bacillus sp. (Fira et al., 2018; Villareal-Delgado et al., 2018).

En suelos recién inoculados con una mezcla de microorganismos benéficos (práctica común en la finca de estudio) solamente se encontraron tres biotipos de dos géneros de hongos; Trichoderma spp. y Penicillum sp. Este resultado parece indicar que la aplicación de organismos benéficos reduce de forma drástica a otros microorganismos del suelo lo cual ha sido descrito por otros autores (Umadevi et al., 2018). Este es un hallazgo importante que permite esclarecer la efectividad de la aplicación de estos bioproductos en el control de otros hongos bajo el modelo evaluado. Así mismo es un indicador de la supervivencia de las poblaciones de Trichoderma sp. en el suelo. Es de resaltar que este género comprende una amplia variedad de especies con actividad biocontroladora, inductora de resistencia y promotora de crecimiento (Nakkeeran et al., 2018).

En la misma muestra de suelo inoculado se encontraron biotipos de los géneros Pseudomonas sp., Klebsiella sp. y Lysinibacillus sp. los cuales no representan un problema fitosanitario (Tabla 3). Sin embargo, su presencia indica una mayor efectividad de Trichoderma spp. para desplazar hongos, que para desplazar bacterias.

En la muestra del suelo de producción se estableció por morfología microscópica y molecular la presencia de aislamientos de los géneros Fusarium sp., Trichoderma sp., Cladosporium sp., Aspergillus sp., Penicillium sp. y Acremonium sp. (Tabla 2). Es importante indicar que especies del género Fusarium junto con Gibberella sp.y Morteriella sp. son hongos dominantes en suelos con aplicaciones de fertilizantes basados en NPK y que géneros como Cyphellophora sp., Penicillium sp., Chloridium sp., Trichoderma sp. y Acremonium sp. incrementan en suelos fertilizados (Ding et al., 2017). Lo anterior se relacionó con la fertilización química que se emplea en el sistema productivo para suplementar los sustratos y suelos preparados; es importante resaltar, que a pesar de que los sistemas de Cannabis en general utilizan modelos de producción limpios y reducen las aplicaciones de plaguicidas, al ser cultivos con una alta rotación y ciclos muy cortos (tres a cuatro meses), es necesario suplementar los sustratos con fertilización química (Bernstein et al., 2019).

En las muestras de suelo de los lotes de propagación se aislaron colonias de Fusarium solani, un patógeno frecuentemente reportado en Cannabis y causante de marchitamiento y mal de talluelo (Punja, 2018; Punja et al., 2019). Sin embargo, la frecuencia y el número de unidades formadoras de colonia encontradas, no permitieron correlacionar su presencia con el desarrollo de enfermedades en el cultivo.

Este aspecto continúa en evaluación por el equipo de investigadores de este proyecto. Para el caso de las poblaciones bacterianas se observaron aislamientos Gram +, con morfologías microscópicas de bacilos, cocos y actinobacterias (Tabla 3). Los Bacilos Gram + esporulados aislados de la muestra pueden provenir de las aplicaciones de Bioplaguicidas a base de B. subtillis, B. amyloliquefaciens y B. thuringiensis realizadas con frecuencia en el cultivo.

En la muestra de turba, hubo crecimiento de morfotipos del género Penicillium sp. (Tabla 2), lo cual resulta llamativo, dado que este tipo de sustratos se venden como estériles, sin embargo es posible que las condiciones de almacenamiento o incluso preparación facilite el desarrollo de organismos de tipo ambiental como Penicillium sp., el no hallazgo de patógenos importantes en los cultivos como Fusarium sp., Rhizoctonia sp. o Pythium sp. causantes de “damping off” en las plántulas (Mcpartland, 2019) genera tranquilidad sobre el uso de este tipo de sustratos. Se debe destacar que en esta muestra fue la única en la cual fue posible aislar un biotipo de actinobacteria, estos son una fuente significativa de compuestos antibióticos que pueden estar regulando en el suelo poblaciones de bacterias patógenas Gram - (de Lima Procópio et al., 2012).

En ninguna de las dos muestras de agua hubo presencia de hongos filamentosos. En la muestra de agua de la zona de producción de material vegetal, solamente se aisló, un morfotipo correspondiente a un Bacilo Gram + esporulado, los cuales no son considerados agentes fitopatógenos. Este probablemente esté asociado con empleo de Bioplaguidas a base de especies de Bacillus sp. En la muestra de agua cruda se caracterizó la presencia de 4 morfotipos de Bacilos Gram +. Es común que en ambientes acuáticos inestables con una disponibilidad escasa de nutrientes abunden bacterias Gram + aunque en menor proporción que bacterias Gram – (Cabral, 2010). En este sentido, ninguna de las muestras de agua, es una fuente de contaminación de hongos fitopatógenos y bacterias. Para el caso del agua cruda, se realizó la caracterización molecular de los morfotipos estableciendo la presencia de los géneros Lysinibacillus sp., Pseudomonas sp. y Rhizobium sp. (Tabla 3).

Tabla 2. Caracterización de biotipos de hongos aislados de sustratos*

Muestra | Caracterización molecular | Concentración (UFC.gˉ¹)
Compost 1 | Cladosporium sp. | 2,05 x 10⁵
Cladosporium sp. | 7,25 x 10⁴
Geomyces sp. | 3,50 x 10⁵
Plectosphaerella cucumerina | 1,50 x 10⁵
Phialemonium inflatum | 3,35 x 10⁶
Geomyces sp. | 2,00 x 10⁴
Geotrichum sp. | 1,50 x 10⁵
Compost 2 | Pseudogymnoascus sp. | 4,00 x 10⁴
Plectosphaerella cucumerina | 1,30 x 10⁶
Penicillium citreonigrum | 3,50 x 10⁴
Pseudogymnoascus appendiculatus | 2,50 x 10⁵
Geomyces pannorum | 4,00 x 10⁴
Aspergillus niger | 1,00 x 10⁴
Penicillium spinulosum | 1,50 x 10⁴
Compost 3 | Plectosphaerella oligotrophica | 3,55 x 10⁴
Aspergillus fumigatus | 1,50 x 10³
Fibra de coco | Penicillium spinulosum | 6,00 x 10³
Aspergillus niger | 4,00 x 10³
Penicillium roseomaculatum | 7,00 x 10⁴
Penicillium roseomaculatum | 5,00 x 10³
Fusarium fujikuroi | 1,00 x 10⁴
Turba | Penicillium sp. | 1,00 x 10⁴
Penicillium spinulosum | 3,50 x 10⁴
Pseudogymnoascus pannorum | 2,00 x 10³
Mezcla suelo inoculado | Trichoderma atroviride | 1,00 x 10⁴
Penicillium amphipolaria | 9,00 x 10⁴
Trichoderma harzianum | 5,00 x 10³
Suelo Bloque de producción | Fusarium oxysporum | 4,00 x 10³
Trichoderma longibrachiatum | 2,00 x 10³
Cladosporium sphaerospermum | 1,65 x 10⁴
Penicillium bilaiae | 4,50 x 10³
Acremonium aff. Curvulum | 2,50 x 10³
Fusarium solani | 2,50 x 10³

*Caracterización basada en secuencias parciales Its. Suplemento 1. UFC.gˉ¹: Unidades formadoras de colonia por gramo de sustrato; UFC.100mlˉ¹: Unidades formadoras de colonia por 100 ml de suspensión.

Tabla 3. Caracterización de biotipos de bacterias aisladas de aguas y sustratos.

Muestra | Caracterización molecular | Concentración (UFC.gˉ¹)
Fibra de coco | Klebsiella pneumoniae | 1,00 x 10⁶
Enterobacter cloacae | 5,33 x 10⁶
Cronobacter sakazakii | 5,33 x 10⁶
Lysinibacillus sp. | 5,33 x 10⁶
Lysinibacillus fusiformis | 3,33 x 10⁷
Mezcla suelo inoculado | Pseudomonas sp. | 4,00 x 10⁶
Klebsiella pneumoniae | 2,80 x 10⁷
Pseudomonas sp. | 1,33 x 10⁶
Lysinibacillus sphaericus | 2,00 x 10⁶
Suelo Bloque de producción | Lysinibacillus fusiformis | 1,33 x 10⁶
Bacillus megaterium | 5,00 x 10⁶
Lysinibacillus fusiformis | 1,00 x 10⁶
Lysinibacillus fusiformis | 1,57 x 10⁶
Turba | Lysinibacillus fusiformis | 9,00 x 10⁶
Lysinibacillus sp. | 1,13 x 10⁷
Lysinibacillus fusiformis | 2,37 x 10⁷
Lysinibacillus fusiformis | 5,90 x 106
Streptomyces griseoaurantiacus | 5,00 x 105
Compost 3 | Bacillus aerius | 8,00 x 10⁶
Lysinibacillus fusiformis | 4,33 x 10⁶
Bacillus cereus | 3,33 x 10⁵
Bacillus subtilis | 3,67 x 10⁶
Lysinibacillus fusiformis | 9,67 x 10⁶
Bacillus pumilus | 1,00 x 10⁷
Perlita | Bacillus pumilus | 6,2 x 10⁵
Staphylococcus pasteuri | 4,00 x 10⁴
Lysinibacillus fusiformis | 2,30 x 10⁵
Agua confinamiento | Lysinibacillus sp. | 3,67 x 10³
Agua cruda | Lysinibacillus fusiformis | < 1000
Pseudomonas costantinii | < 1000
Lysinibacillus sp. | 2,50 x 10³
Lysinibacillus fusiformis | 3,00 x 10³
Rhizobium pusense | 1,50 x 10³

* Caracterización basada en secuencias parciales Its. Suplemento 1. UFC.gˉ¹: Unidades formadoras de colonia por gramo de sustrato; UFC.100mlˉ¹: Unidades formadoras de colonia por 100 ml de suspensión.

Los microorganismos presentes, en las muestras de suelo, tanto bacterias como hongos, se encuentran en concentraciones significativamente altas y presentan una amplia diversidad en la rizosfera. Esto demuestra que esta zona está influenciada por una intensa asociación de la actividad microbiana con las raíces de las plantas (Fincheira y Quiroz, 2018).

Los exudados de la planta determinan o modifican la comunidad microbiana a lo largo del sistema de raíces y estos a su vez secretan diversos metabolitos no volátiles con efectos beneficiosos que incluyen promoción del crecimiento de las plantas produciendo fitohormonas, o mejorando la biofertilización y promoviendo la reducción del estrés abiótico y bióticos induciendo resistencia a las plantas o por antibiosis. Por su parte, existen suelos supresivos donde no ocurre la enfermedad, aunque esté presente el patógeno. Algunos autores reportan que bacterias de la familia Pseudomonadaceae, son más abundantes en suelos supresores. Así mismo se han identificado estreptomice- tos capaces de producir sustancias volátiles químicamente diversas (COV) con actividad antifúngica y con propiedades promotoras del crecimiento vegetal (Braga et al., 2016).

La presencia de bacterias promotoras de crecimiento de las plantas (PGPR) de los géneros Pseudomonas sp., Bacillus sp., Lysinibacillus sp. y Rhizobium sp. en diferentes tipos de muestras del cultivo evaluado sugiere una alternativa prometedora a los fertilizantes químicos en este sistema productivo. Estas bacterias pueden promover el crecimiento y desarrollo de las plantas a través de varios mecanismos, tales como: fijación de nitrógeno atmosférico, producción de sideróforos (los sideróforos quelatan el hierro para estar disponible para la raíz de la planta), solubilización de minerales (particularmente fósforo), producción de sustancias promotoras del crecimiento de las plantas (como auxinas, citoquininas, giberelinas) y la síntesis de varios otros compuestos promotores del crecimiento (por ejemplo, enzimas), así mismo estimulan el alargamiento de los sistemas radiculares, formación de raíces laterales y adventicias, pelos radiculares y pelos radiculares ramificados, juega un papel importante en la mejora de crecimiento y rendimiento de cultivos en diversas condiciones ambientales y del suelo (Pagnani et al., 2018).

CONCLUSIONES

La alta diversidad de microrganismos benéficos observados en el sistema de Cannabis indica la bondad del modelo de producción orgánico típico en estos cultivos y permite inferir que las interacciones benéficas tienen un gran potencial para la prevención y manejo de plagas en este tipo de sistemas productivos.

No se encontró en ninguna de las muestras analizadas: suelos, sustratos, compost o aguas, provenientes de diferentes fases de producción del cultivo de Cannabis la presencia de microorganismos patógenos, que pudieran explicar la incidencia de enfermedades dentro del cultivo; lo que indica, que el compost proveniente de residuos de la misma plantación y que los sustratos que se adicionan al suelo (perlita y fibra de coco), no representa riesgos sanitarios para la producción.

Se encontraron altas poblaciones de solubilizadores de fósforo y fijadores de nitrógeno en las muestras de perlita y fibra de coco, lo que permite indicar que estos sustratos favorecen poblaciones benéficas en sustratos y suelos.

Se observó que en suelos tratados con Trichoderma spp. se presenta una menor cantidad de biotipos de hongos, lo cual confirma su papel como regular de las poblaciones de patógenos del suelo.

Agradecimientos

A la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria-AGROSAVIA por los recursos asociados al proyecto ID 1001057: Caracterización materiales Cannabis.

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Notas

Conflicto de intereses Los autores declaran que es un trabajo original y no existió conflicto de intereses de ningún tipo en la elaboración y publicación del manuscrito.