Introducción

Panamá es el mayor consumidor de arroz en centroamericana (68 kg/persona) (FAO, 2018) siendo uno de los alimentos indispensables en la dieta del panameño. En consecuencia, su producción tiene una gran importancia a nivel social, político, económico y, sobre todo, en lo relacionado con la seguridad alimentaria del país (IICA, 2009).

En el cultivo del arroz las enfermedades de origen microbiano constituyen uno de los factores que inciden en la obtención de bajos rendimientos y manchado de los granos. Estas enfermedades pueden ser provocadas por diversos microorganismos como hongos, bacterias y virus (Acebo et al. 2011). El Añublo bacteriano de la panícula del arroz, provocado por Burkholderia glumae es una de ellas, adquiriendo gran importancia en los últimos años (Pedraza, 2012). Esto provoca la disminución en la calidad del grano y bajos rendimientos debido a la su agresividad y difícil manejo en campo, lo que se refleja en pérdidas económicas, perjudicando la producción de arroz, rubro básico para la población de nuestro país.

En las últimas décadas el control biológico de plagas y enfermedades en la agricultura ha adquirido gran importancia frente a los problemas fitosanitarios ocurridos por el uso indiscriminado de plaguicidas químicos en la agricultura, lo cual ha traído como consecuencia severos problemas de contaminación al medio ambiente y ha generado la resistencia de plagas y enfermedades, así como la presencia de nuevas especies de microorganismos fitopatógenos con un grado de afectación más virulento (Quesada y García, 2014) (Villarreal, 2017).

Materiales y Métodos

1. Colecta de campo

La colecta de las muestras se realizó en la localidad de Los Alvéos, corregimiento de Cabuya, distrito de Antón, provincia de Coclé, República de Panamá, próximo a las coordenadas UTM (Datum WGS84) 591361.06 m E; 943492.23 m N. La mayoría de los productores de arroz de esta zona, se dedican a la agricultura de subsistencia, bajo la modalidad de cultivos orgánicos. En el campo se tomarán muestras de suelo para su análisis fisicoquímico. El muestreo se efectuó en una parcela (10 m²) cultivada con arroz, variedad Gab 8, bajo el sistema de agricultura de subsistencia (sustento del dueño de la finca y su familia). El sitio de muestreo fue seleccionado para la bioprospección de microorganismos debido a que no estaba sometido a los efectos de los agroquímicos.

2. Procesamiento de muestras

En esta etapa se procesaron las muestras de la rizósfera de las plantas de arroz, aislando bacterias; se evaluó in vitro el potencial antagónico de los aislamientos bacterianos ante el fitopatógeno Burkholderia glumae (previamente aisladas e identificadas). Se identificaron las cepas con mayor potencial de inhibición y se realizó la conservación criogénica de estos microorganismos Los ensayos se realizaron en el laboratorio de Microbiología del Centro Regional Universitario de Coclé-Universidad de Panamá.

De cada una de las plantas colectadas se separaron la parte aérea de la basal; la zona rizosférica fue dividida en tres secciones: la exorrizosfera o suelo rizósferico que representamos con la letra "S", la raíz que imvolucra tanto la endorizosfera y rizoplano, representada con la letra "R" y una mezcla de suelo rizosférico con raíces "S+R". A partir de cada sección (tres secciones) se pasaron 30 g de la muestra, para luego homogenizarlas en 100 ml de agua peptonada. Las suspenciones fueron colocadas en un homogenizador seward® a 200 RPM por 1 min, luego de 5 min para luego ser inoculados 0.7 ml en platos Petri.

3.Aislamiento, pruebas de antagonismo in vitro e identificación de bacterias rizosféricas del cultivo de arroz (Oryza sativa).

3.1. Aislamiento de bacterias rizosféricas.

Se aplicaron diluciones seriadas a partir de los 30 g tomados de cada una de las secciones de la rizósfera (homogenizadas en agua peptonada). Se agregaron 0.7 ml de cada dilución en platos Petri con agar tripticasa soya (TSA) Alpha Biosciences® y se esparcieron por agotamiento, incubándose a 28°C durante 24 h. Luego de la incubación, se realizó el recuento de las colonias bacterianas, seleccionándose entre 2 a 3 colonias por réplica en cada dilución.

3.2. Pruebas de antagonismo in vitro de las bacterias rizosféricas ante el fitopatógeno Burkholderia glumae.

Las pruebas de antagonismo se realizaron mediante la técnica de enfrentamientos duales entre los microorganismos autóctonos aislados de la rizósfera y la bacteria fitopatogénica B. glumae, con la finalidad de observar y cuantificar la posible inhibición del crecimiento de B. glumae, por efecto de la presencia de los microorganismos autóctonos aislados.

3.3. Identificación de bacterias con actividad antagónica

La identificación de las bacterias con capacidad antagónica frente a B. glumae, fue considerada a partir de la diferenciación, empleando la Tinción de Gram. Se utilizó el sistema de identificación bioquímica API Biomereux®. Se consideró como antagonistas significativas, aquellas cepas con halo de inhibición ≥ a 4mm de diámetro.

Resultados y Discusión

La prueba de Shapiro-Wilk para los diámetros de los halos de inhibición de las cepas bacterianas identificadas indica que los datos tienen igual frecuencia de distribución bajo la campana de Gauss (Figura 1), por lo que se utilizó pruebas paramétricas para el análisis de los resultados.

Figura 1.
Histograma. Normalidad de los datos de enfrentamiento Bacterias rizosféricas vs B. glumae.

Del total de bacterias aisladas de la rizósfera del arroz (317), 31 presentaron halo de inhibición y a su vez 16 mostraron un halo de inhibición ≥ a 4mm y 10 fueron identificadas taxonómicamente al mostrar halos de inhibición más significativos frente B. glumae.

Las diez cepas identificadas reunían las características de antagonistas al presentar un diámetro de halo de inhibición mayor o igual a 4 mm, las cuales fueron identificadas taxonómicamente dentro del género Bacillus, de alta presencia en la rizósfera de diversos cultivos debido a su capacidad de formación de esporas que le da ventaja de supervivencia en la rizósfera vegetal. A pesar de que el suelo muestreado presentó un pH ácido, no es un limitante para la presencia de este microorganismo. Como indican estudios previos, llevados a cabo con valores de pH bajos en suelo demostrando la presencia activa de especies de Bacillus (Benitez et al., 2007).

Por su parte, Tejera, Rojas, y Heydrich (2011), reportaron que el género Bacillus comprende una amplia variedad de especies que se encuentran en muchas ocasiones asociadas a las plantas, ejerciendo un efecto positivo sobre el crecimiento a través de una serie de mecanismos que involucran la promoción del crecimiento vegetal y el control biológico de patógenos. Los miembros de este género se han aislado de numerosos cultivos de interés económico como la caña de azúcar, el algodón, el trigo, el maíz, la papa y el arroz. El mayor poder inhibitorio frente a B. glumae, lo presentaron seis cepas identificadas como Bacillus spp (porcentaje de identidad de 80 %), dos cepas identificadas como Bacillus cereus, una cepa identificada como Bacillus subtillis y una cepa identificada como Lactobacillus plantarum (Tabla 1).

Tabla 1.

Cepas bacterianas con el mayor porcentaje de inhibición frente a B.glumae.

Badía et al. (2011), indica que las bacterias del género Bacillus son consideradas las más eficaces para controlar enfermedades foliares y de las raíces. Dada la diversidad genética en el género Bacillus, tanto en el suelo como en la rizósfera, se considera a estos microorganismos como colonizadores eficaces. Los miembros de este género tienen un gran potencial para su uso en la agricultura. Muchas cepas tienen la capacidad de producir metabolitos antimicrobianos para el control de patógenos.

En la Figura 2 se observa el tamaño de los halos de inhibición en cada una de las réplicas (3) de las cepas identificadas. La media en el tamaño de los halos de inhibición corresponde a 10.9 mm de diámetro.

Figura 2
Tamaño de los halos de inhibición de las cepas identificadas (por réplica). La línea verde paralela al eje x separa las réplicas cuyo halo de inhibición es ≥ a 4 mm de diámetro; la línea color negro paralela al eje x indica la media de los halos de inhibición.

El análisis de varanza (Tabla 2) permite observar diferencias en el promedio del diámetro del halo de inhibición de cada cepa identificada. Los factores o variables involucradas en el modelo utilizado para las pruebas de enfrentamiento in vitro explican o aportan en un 36% a la formación del halo de inhibición (Tabla 2). El ANOVA indica que hubo diferencia en el tamaño promedio del halo de inhibición de las cepas identificadas. Es decir que por lo menos una cepa tiene mayor poder de inhibición ante el patógeno, prevaleciendo la cepa BS10^-4 1.1 (Bacillus spp.) con una media en el tamaño del halo de inhibición de 15.33 mm de diámetro.

Tabla 2.

Análisis de varianza para el halo de inhibición formado por las bacterias identificadas

En el gráfico de cajas de barra (Figura 3) muestra una línea que representa la media de los halos de inhibición (10.9 mm de diámetro), los valores por arriba de esta corresponden a las réplicas con mayor capacidad antagónica. La tendencia de los datos indica que las cepas identificadas con la letra A corresponden a cepas con mejor actividad biológica, seguida por la AB, B y por último la C. El mayor tamaño en el halo de inhibición corresponde a una réplica de la cepa BSR10^-4 1.1 (Bacillus spp.), cepa que presenta mayor poder de inhibición del patógeno al contar con el mayor halo de inhibición promedio (15.33 mm).

Figura 3
Gráfico de Cajas. Diámetros del halo de inhibición de las cepas bacterianas identificadas. Valores con una letra común no son significativamente diferentes

Al analizar la diversidad de bacterias en aguas de irrigación de los campos sembrados con arroz en diferentes etapas del cultivo obtuvieron que el género Bacillus representaba el 39% de los 315 aislados, lo que denota la predominancia de éste en la población bacteriana total. Los miembros de este género tienen un gran potencial para su uso en la agricultura. Muchas cepas tienen la capacidad de producir metabolitos antimicrobianos para el control de patógenos, fijan nitrógeno, presentan una alta velocidad de crecimiento, forman endosporas resistentes a la desecación, el calor y las radiaciones ultravioletas y sobreviven en diversas condiciones. El estudio de esta capacidad de Bacillus se inició por el descubrimiento de la actividad insecticida de las proteínas Cry producidas por B. thuringiensis; en la actualidad diversas especies del género Bacillus (B. subtilis, B. pumilus, B. amyloliquefaciens y B. licheniformis) son ampliamente estudiadas para mitigar la incidencia de enfermedades de importancia agrícola (Villarreal et al. 2017).

Los géneros bacterianos identificados mediante API son similares a los reportados por Badía et al. (2011), en su trabajo sobre Aislamiento y caracterización de cepas de Bacillus asociadas al cultivo del arroz (Oryza sativa L) señalando que los resultados obtenidos mediante la secuenciación del ADNr de las cepas aisladas para la determinación del nivel de especie se identificaron como Bacillus subtilis, B. cereus y Bacillus spp.

Las bacterias identificadas como antagonistas de B. glumae, han sido reportadas como controladores biologicos de diversos fitopatógenos, indican que la especie Bacillus subtilis se caracteriza por poseer propiedades que ayudan al crecimiento y desarrollo óptimo de las plantas, además de que actúan como control biológico de algunas enfermedades, entre ella, al control de B. glumae. Entre el grupo de bacterias utilizadas como agentes de control biológico, quizás una de las especies más estudiadas sea Bacillus subtilis. Existen bioproductos comercializables que contienen esta especie como componente biológico activo y se utilizan en campo para el control de enfermedades causadas fundamentalmente por hongos del suelo que atacan la raíz de las plantas (Pérez y Chamorro, 2012).

Cabra et al, (2014) indica que la quitinasa purificada de Bacillus cereus inhibe el crecimiento de los hongos fitopatógenos Fusarium oxysporum y Pythium ultimum, según lo demostraron Chang, Chen, y Wang en su investigación. Por su parte Alvarado (2009), determinó que la capacidad antagonica de cinco cepas de Lactobacillus plantarum, aisladas de un pastizal de finca lechera, ante Salmonella typhi y Listeria monocytogenes de las cuales, cuatro fueron por la producción de ácidos orgánicos. Mencionan a su vez el antagonismo de Lactobacillus plantarum en bioconservación de los alimentos y en la terapia probiótica. Esta especie ha sido objeto de interés durante las últimas décadas por producir una amplia gama de compuestos activos contra bacterias patógenas y hongos que pueden ser utilizados como bioconservantes muy efectivos en la industria alimentaria y adicionalmente estas cepas pudieran ejercer antibiosis contra bacterias indeseables en el tracto intestinal del consumidor de estos alimentos. Sin embargo, a pesar de que Lactobacillus Plantarum como Bacillus cereus ha sido aislado de suelos, sus posibles aplicaciones como agente de control biológico de microorganismos fitopatógenos no se han estudiado con intensidad.

-Cinética De Crecimiento Bacteriano

Para abordar el aspecto cuantitativo de la interacción antagónica bacteria rizosféricas-B.glumae, se tomaron al azar 2 de las 10 cepas identificadas y se realizó una prueba de cinética de crecimiento. Las cepas rizosféricas sometidas a esta prueba corresponden al género Bacillus spp. (Cepa RS+R10-32.1) y Lactobacillus plantarun (Cepa RR10-61.1) (Tabla 3). En las Tablas 4 y 5 se muestran las lecturas de absorbancia mientras que en las Figuras 4 y 5 se aprecian las curvas de crecimiento de las bacterias rizosféricas y de la B. glumae.

Tabla 3

Cepas seleccionadas para la cinética de crecimiento bacteriano

La cinética de crecimiento permite conocer la velocidad de multiplicación de las células bacterianas aisladas de la rizósfera del arroz en contraste a la cepa de B. glumae. Observamos que las células de ambas cepas rizosféricas se multiplicaron mas rapido que las de el patógeno B. glumae, durante el período evaluado.

Tabla 4

Datos de la absorbancia Cepa R6 vs B.glumae

Figura 4.
Cinética de crecimiento B.glumae vs L. plantarum

Fue notable la diferencia en la velocidad de multiplicación celular de la cepa de Lactobacillus. plantarum en función de la B.glumae a aprtir de las 2 h (120 min), a las 4 h (240 min) de ensayo continuaba la tendencia a aumentar su crecimiento.

Tabla 5.

Datos de la absorbancia Cepa R14 vs B.glumae

Figura 5.
Cinética de crecimiento B. glumae vs Bacillus spp.

Por su parte, para la cepa de Bacillus spp se observó un mayor crecimiento en función de B. glumae a partirde de 0.5 h (30 min) hasta 2.5 h (150 min), en donde B.glumae aumentó su crecimiento acercándose a una velocidad de mutiplicación celular similar a la cepa rizosférica, sin embargo, a partir de las 3 h B.glumae entra en fase estacionaria y pocos minutos más tarde inicia su fase de declinación o muerte, mientras que B. subtilis continua en fase exponencial.

Esto pudiera sugerir, que la inhibición producida por las cepas evaluadas estaría relacionada con la competencia por los nutrientes entre el patógeno y la cepa, ya que, al mostrar una taza metabólica más alta, este asimila más rápidamente los nutrientes, logrando un tiempo de duplicación más rápido que el patógeno, generándose los correspondientes metabolitos secundarios que pudieran explicar el efecto inhibitorio en el crecimiento del patógeno (halo de inhibición).

Conclusiones

• Las cepas bacterianas con actividad antagónica obtenidas pertenecen todas al género Bacillus (Bacillus spp, B. subtillis,B. cereus) y a la especie L. plantarum).

• En la cinética de crecimiento pudo observarse que la cepa antagónica presenta una densidad óptica (absorbancia) mayor que la cepa patógena de B. glumae.

• No se presentaron diferencias entre las secciones de la rizósfera estudiadas en relación con la capacidad antagonista de las cepas aisladas frente al patógeno B. glumae

Referencias

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