ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

Ciclodextrina cargada con colesterol en la criopreservación de semen de alpaca (Vicugna pacos) Una alternativa metodológica

Cholesterol-loaded metil-β- cyclodextrin in alpaca semen cryopreservation (Vicugna pacos) The methodological alternative

Ccalta Hancco, Ruth; Ordoñez-Rodríguez, Cesar Domingo; Ccalta Hancco, Ada Luz; Hernán Carlos, Cucho Dolmos

Ccalta Hancco, Ruth

ruthccaltahancco1992@gmail.com

Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco Perú

Ordoñez-Rodríguez, Cesar Domingo

Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco Perú

Ccalta Hancco, Ada Luz

Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco Perú

Hernán Carlos, Cucho Dolmos

Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco Perú

Journal of the Selva Andina Animal Science

Selva Andina Research Society, Bolivia

ISSN: 2311-3766

ISSN-e: 2311-2581

Periodicidad: Bianual

vol. 9, núm. 2, 2022

directoreditoranimalscience@gmail.com

Recepción: 01 Julio 2022

Aprobación: 01 Septiembre 2022

Publicación: 01 Octubre 2022

URL: http://portal.amelica.org/ameli/journal/198/19836701983670003/

DOI: https://doi.org/10.36610/j.jsaas.2022.090200039

Selva Andina Research Society

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Resumen: El objetivo del estudio fue evaluar efecto de tres niveles (0, 1.5 y 3 mg) de colesterol cargado con metil-β-ciclodextrina (MCD) en la criopreservación de semen de alpaca. Se utilizaron seis alpacas machos de la raza Huacaya de 6 a 8 años, tres para la colección de semen por el método de poscópula (PC), y de tres se recuperaron los espermatozoides (EPZ) por desviación de los conductos deferentes (DCD), se hicieron 3 colectas por animal. Se evaluó el volumen, filancia, movilidad total, concentración, EPZ vivos, integridad de la membrana espermática e integridad acrosomal. Se empleó un sistema de análisis computarizado (ISAS.) en las evaluaciones microscópicas. Las muestras fueron diluidas con base Tris hasta una concentración de 15 millones de EPZ por mL a las muestras de PC se añadió papaína, después inhibidor de papaína. Se añadió MCD en ambos métodos, se evaluó los parámetros microscópicos en refrigerado y descongelado, proceso en el que se usó dimetilformamida como crioprotector. Las variables macroscópicas se evaluaron mediante la estadística descriptiva, las variables microscópicas (movilidad, EPZ vivos, funcionalidad de la membrana e integridad acrosomal) con un arreglo factorial en un diseño al azar. Para todas variables microscópicas en estudio se hallaron diferencias significativas (P< 0.05) entre la etapa de refrigerado en relación al descongelado en ambos métodos. Para el método de PC, no se ha observado diferencias significativas (P> 0.05) para la movilidad y vitalidad entre tratamientos. Sin embargo, EPZ tratados con 1.5 mg de MCD presentaron mayor (P< 0.05) funcionalidad de la membrana e integridad de acrosoma. En los espermas provenientes de la DCD, no se hallaron diferencias significativas (P> 0.05) entre tratamientos para la movilidad y la funcionalidad de la membrana, pero hubo diferencia significativa (P< 0.05) para la vitalidad e integridad acrosomal cuando se adicionó 1.5 mg de MCD en relación a 3 mg MCD. En conclusión, los EPZ tratados con 1.5 mg de MCD tienen mejores características microscópicas en al refrigerado y descongelado en ambos métodos.

Palabras clave: Alpaca, congelación, espermatozoides, methy-β-ciclodextrina, membrana plasmática.

Abstract: The objective of the study was to evaluate the effect of three levels (0, 1.5 and 3 mg) of cholesterol loaded with methyl-β-cyclodextrin (MCD) in the cryopreservation of alpaca semen. Six male alpacas of the Huacaya breed from 6 to 8 years old were used, three for the collection of semen by the vaginal aspiration method (PC), and from three the EPZ were recovered by deviation of the vas deferens (DCD), three collections were madeper animal. Volume, filance, total motility, concentration, EPZ live, sperm membrane integrity and acrosomal integrity were evaluated. A Computer-assisted semen analysis (ISAS®) was used in the microscopic evaluations. The samples were diluted with Tris base to a concentration of 15 million EPZ per mL. It was added papain to samples collected by PC, followed by papain inhibitor. MCD was added in both methods, the cooled and thawed microscopic parameters were evaluated, a process in which dimethylformamide was used as a cryoprotectant. Macroscopic variables were evaluated using descriptive statistics, microscopic variables (mobility, live sperm, membrane functionality, and acrosomal integrity) were analyzed with a factorial arrangement in a randomized design. For all microscopic variables, significant differences (P<0.05) were found between the cooled stage in relation to thawing in both methods. For the PC method, no significant differences (P> 0.05) were found for mobility and vitality between treatments. However, EPZ treated with 1.5 mg of MCD presented higher (P<0.05) membrane functionality and acrosome integrity. In sperm from DCD, no significant differences (P> 0.05) were found between treatments for membrane mobility and functionality, but there was a significant difference (P< 0.05) for vitality and acrosomal integrity when 1.5 mg MCD relative to 3 mg MCD. In conclusion, the EPZ treated with 1.5 mg of MCD have better microscopic characteristics in cooled and thawed semen.

Keywords: Alpaca, freezing, sperm, methyl-β- cyclodextrin, plasma membrane.

Introducción

La criopreservación es una biotécnica reproductiva que permite la conservación del valor genético de diferentes especies a largo plazo. En camélidos sudamericanos (CSA) el proceso de la criopreservación afecta negativamente a la viabilidad de los espermatozoides (EPZ). Sin embargo, en los últimos años, varios estudios buscan protocolos viables, uso de crioprotectores y diluyentes que permitan mejorar su supervivencia 1-3 .

Los eventos durante la congelación/descongelamiento de las células espermáticas pueden causar cambios y daños parciales irreversibles, especialmente en la membrana, llevando a disminución de su capacidad fecundante ⁴ . La membrana de los EPZ está compuesta de lípidos y proteínas, siendo predominantes, los fosfolípidos y el colesterol ⁵ , cuando son sometidos a bajas temperaturas afectan a la fluidez de la membrana, permeabilidad y distribución de fosfolípidos ⁶ . La ratio de colesterol/fosfolípidos en los EPZ es un factor indispensable para la fluidez de la membrana. Varios estudios observaron que mayor ratio colesterol/fosfolípidos son altamente resistentes al shock térmico, como en el humano, conejo y perro ⁷ ,8 mientras en toro, jabalí y carnero ⁶ son susceptibles.

La adición de colesterol a la membrana de los EPZ incrementa la tasa de supervivencia a la criopreservación, su incorporación en los estratos de la membrana espermática se realiza fácilmente por medio de las ciclodextrinas (CD) 9, ¹⁰ . Las CD son oligosacáridos cíclicos que pueden ser de carácter externa hidrofílica o cavidad interna hidrofóbica, se encuentra en la forma más común como 6 a 8 unidades glicosídicas, designadas α, β y γ 11 . De estas, la β-ciclodextrinas poseen mayor afinidad con los compuestos lipídicos, particularmente con el colesterol, incluso la adición del grupo metil a la molécula de las CD aumenta su solubilidad en agua y la capacidad de solubilidad de compuestos hidrofóbicos 12 .

Basados en estas observaciones, existen investigaciones que revelan mejor tolerancia a la criopreservación en ovinos ¹³ equinos 14 bovinos ¹⁰ y dromedarios ¹⁵ . Por tanto, el objetivo fue evaluar el efecto de concentraciones de 0, 1.5 y 3 mg de colesterol cargado con metil-β- ciclodextrina (MCD) en la criopreservación de EPZ de alpacas colectado por el método de poscópula (PC) y recuperados por desviación del conducto deferente (DCD).

Materiales y métodos

Código de ética. Los autores declaran que el presente estudio se ha llevado a cabo de acuerdo con el Código de Ética para los experimentos con animales, tal y como se refleja en la normativa: http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm

Zona de estudio y animales. El estudio se realizó en el Centro de Investigación en Camélidos Sudamericanos (CICAS) La Raya, de la Facultad de Ciencias Agrarias (FCA) de la Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco (UNSAAC) a 4130 metros de altitud, de febrero a marzo del 2018. Se usaron un total de 6 alpacas machos con edades entre 6 y 8 años, y un peso corporal promedio de 71.91±4.05 kg, se utilizó una balanza electrónica (Guindaste industrial LCD portátil). Los animales fueron desparasitados bajo la supervisión de un médico veterinario. La alimentación fue en una pradera nativa con predominancia de Festuca sp., Muhlenbergia fastigiata, Scirpus rigidus, Alchemilla pinnata y agua ad libitum.

Colección de semen/recuperación de espermatozoides y evaluación de espermatozoides.

Método de PC. Se colectó el semen de 3 alpacas machos, en 3 ocasiones por animal, y con intervalos de una semana ³ , ¹⁶ . Previamente los animales fueron adiestrados y acostumbrados al manejo para facilitar la obtención de la muestra. El semen colectado fue mantenido a 37º C en baño seco, la filancia se calculó por la ruptura del hilo de la muestra, medida con una regla, el volumen fue evaluado visualmente 17 . Posteriormente se añadió papaína (1:1) (v:v) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), se mezcló homogéneamente e incubo 30 min a 37º C en baño maría. En seguida se adicionó inhibidor de papaína (E64, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) a una concentración de 20 µL/mL de semen diluido con papaína durante 5 min, manteniendo la misma temperatura, se centrifugó a 3000 rpm por 10 min 15 . El sobrenadante de plasma seminal fue eliminado, y finalmente, se adicionó a las muestras de semen, dilutor a base de Tris (fructosa y ácido cítrico ) a 37º C 18 .

Desviación del conducto deferente (DCD). Se utilizaron 3 animales, en 3 oportunidades con intervalos de una semana ¹⁹ . Las alpacas fueron previamente intervenidas quirúrgicamente y desviados los conductos deferentes hacia la cara interna del musculo 20 mediante una fistula, las gotas de EPZ fueron absorbidas y depositadas en 0.3 mL de dilutor base Tris en tubos Eppendorf de 2 mL 21 inmediatamente mantenidos a 37° C un baño seco.

Preparación del colesterol saturado con ciclodextrina (MCD). Se prepararon dos soluciones, A y B. Para la solución A se diluyó 1 g de CD en 2 mL de metanol, y la solución B se diluyó 200 mg de colesterol en 1 mL de cloroformo ¹⁰ . Una vez preparadas, se añadió 0.45 mL de la solución B en la solución A, se mezcló homogéneamente y se vertió sobre una placa Petri de cristal, hasta su secado completo (1.5 días) a 37° C en estufa. Una vez evaporado el solvente, se recogió el precipitado restante, se almacenó en botellas de vidrio ámbar a temperatura ambiente hasta su uso. Posteriormente, el MCD se mezcló con dilutor base Tris, a una concentración de 50 mg/mL 10 .

Adición de colesterol en los EPZ y criopreservación. Las muestras de ambos métodos PC y DCD, fueron diluidas hasta alcanzar una concentración final de 15 millones de EPZ/mL, se separaron en 3 alícuotas para ser adicionadas con 0, 1.5 y 3 mg de MCD en oscuridad, a una temperatura de 37° C durante 15 min 15 . Inmediatamente las muestras fueron centrifugadas (1750 rpm x 10 min), el sobrenadante se eliminó, el pellet fue diluido en un crioprotector, que contenía, dilutor a base Tris 10 mL, yema de huevo 5 mL y dimetilformamida 3.125 µL ²² . Los EPZ fueron cargados en pajillas de 0.5 mL y selladas, para la etapa de refrigeración, la temperatura se descendió gradualmente de 37 a 4° C en un periodo de 2.5 h. Luego, fueron mantenidas en vapor de nitrógeno líquido sobre 3 cm por 15 min. Para el congelamiento las pajillas fueron sumergidas y mantenidas en nitrógeno líquido a -196º C hasta la posterior evaluación y la descongelación fue después de 7 días en agua a 37º C por 60 s 22 .

Se evaluaron, la movilidad, concentración, EPZ vivos, integridad funcional de la membrana e integridad acrosomal en muestras de semen fresco, refrigerado y descongelado con 0, 1.5 y 3 mg de MCD usando el Integrated Semen Analysis System (ISAS. v1.1) dotado de un microscopio UOP-UB200i (Proiser R+D, Paterna, Valencia, España). La movilidad se evaluó sobre la platina temperada a 37° C del microscopio con el objetivo de 10X de contraste de fase negativo. Se evaluaron 10 microvideos, cada señal de video fue adquirida con un video cámara Proiser782C, a una velocidad de captura de 25 imágenes por segundo, tanto para la movilidad y concentración espermática se empleó una muestra de 5µL.

El porcentaje de EPZ vivos se evaluó con el kit Vital Test., la funcionalidad de la membrana espermática (HOST) se realizó con una solución hipoosmótica de 50 mOsm/L ¹⁹ , el análisis de la integridad acrosomal se hizo empleando el Coomasie blue ²³ .

Análisis estadístico. La estadística descriptiva fue empleada para las variables macroscópicas (volumen, filancia) y microscópicas (movilidad total, concentración, EPZ vivos, funcionalidad de la membrana espermática e integridad del acrosoma) de los EPZ colectados PC y recuperados de los conductos deferentes.

Se determinaron los supuestos de normalidad y homocedasticidad mediante las pruebas de Shapiro-Wilks y Levene de las variables microscópicas en el proceso de refrigeración y descongelado, se realizó la transformación de datos del porcentaje de movilidad total y de EPZ vivos, con el procedimiento Transreg del SAS. Estas variables fueron analizadas con un arreglo factorial en un diseño al azar, la comparación de medias se hizo con la prueba LSD (α=0.05). Todos los procedimientos estadísticos se realizaron con el programa SAS v 8.2 (NC State University, Estados Unidos).

Resultados

Figura 1
Movilidad de espermatozoides cargados con ciclodextrina (MCD) con 1.5 mg clasificados según su trayectoria, (color rojo, verde y azul) y estáticos (amarillo)

Tabla 1

Media y desviación estándar DE de las características macroscópicas y microscópicas en muestras de semen fresco

Variables | PC | DCD
Media ± D.E. | Media ± D.E.
Volumen (mL) | 3.73±1.60 |
Filancia (mm) | 23.8±0.70 |
Color predominante (%) | 44 % (rojizo) | 44 % (blanco lechoso)
Movilidad total (%) | 13.6±7.30 | 30.34±15.65
Concentración (10⁶/mL) | 215.32±110.09 | 296.32±145.41
Espermatozoides vivos (%) | 47.82±4.96 | 50.72±1.78
Funcionalidad membrana espermática (%) | 46.89±8.39 | 54.89±4.92
Integridad acrosomal (%) | 76.92±2.41 | 68.15±4.81

PC= poscópula; DCD = desviación de conducto deferente. 3 animales, 3 repeticiones.

Discusión

Figura 2
Integridad acrosomal con tinción Coomasie blue. (A) EPZ con pérdida de acrosoma y (B) EPZ acrosoma intacto

Las características macroscópicas de los EPZ de alpacas obtenidas por dos métodos de colección PC y DCD se exponen en la Tabla 1.

El volumen seminal hallado fue similar a los reportados por Quispe et al. 19 , y Ordoñez et al. 24 , tal variabilidad posiblemente sea por la disponibilidad y valor nutritivo del forraje en la época de lluvias en relación a la época de secas. El color predominante fue rojo claro con 44 % para el método de PC, valores que están dentro del rango descrito por Huanca 25 . La filancia es la capacidad de formar hilo y es una característica distinta a la viscosidad Giuliano et al. 17 en este trabajo se observó 23.8±0.70 mm. La filancia está influenciada principalmente por la especie, raza, animal, calidad de forraje Giuliano et al. ¹⁷ y Ciprian Achircana ²⁶ incluso el método de colección. Los EPZ recuperados por DCD. En CSA la concentración de EPZ está influenciada directamente por el método de colección. Los EPZ recuperados por DCD están desprovistos de plasma seminal, por tanto, muestran mayor concentración de EPZ en relación a los métodos de PC, electroeyaculación y vagina artificial debido a las características reológicas (viscosidad) del semen entero se sostiene que los EPZ tienden a la aglomeración Ordoñez et al. ²⁴ , Huanca et al. ²⁵ . Ello se ve reflejado en la movilidad total del semen fresco que en el método de colección por PC fue 13.6±7.30 %, menor al de DCD de 30.34±15.65 %.

Figura 3
Vitalidad de espermatozoides analizados con Vital test ® EPZ vivos de color verde y muertos de color rojo (magnificacion 400X)

Tanto para la vitalidad, funcionalidad de la membrana e integridad acrosomal los valores encontrados están dentro de los rangos descritos por Huanca ²⁵ , Quispe et al. 19 y Meza et al. ²⁰ , todos estos estudios se realizaron en el mismo centro experimental, y con los mismos animales usados para la DCD.

Comparación de la adición de la metil-β-ciclodextrina cargadas de colesterol (MCD) sobre las características microscópicas de los EPZ refrigerados y descongelados. Las características microscópicas de los EPZ refrigerados y descongelados de alpacas, precargados con MCD en función de la movilidad, EZP vivos, funcionalidad espermática e integridad acrosomal se muestran en la Tabla 2.

La ratio de fosfolípidos/colesterol en los EPZ es variable entre especies, haciéndolos a algunos altamente resistentes al shock térmico como en el humano, conejo y perro Oscheroff et al. ⁷ . Se cree que los EPZ de alpaca son especialmente sensibles al choque por frío debido a su menor tasa molar de colesterol/fosfolípidos en comparación con las otras especies. Por esta razón, es importante reducir el efecto perjudicial del choque por frío, por ejemplo, aumentando el contenido de colesterol en la membrana celular.

Tabla 2

Media y desviación estándar (D.E.) del efecto de la adición de la metil-β-ciclodextrina cargadas de colesterol (MCD) sobre las características microscópicas de los espermatozoides refrigerados y congelados en alpacas

Característica |  | Media±D.E. (%)
Método | Refrigerado | Descongelado
Movilidad total (%) |  | 12.28ᵃ ±6.26 | 7.45ᵇ±2.69
Espermatozoides vivos (%) | PC | 34.03ᵃ ±6.54 | 13.82ᵇ±3.06
Funcionalidad membrana espermática (%) |  | 28.65ᵃ ±5.58 | 13.46ᵇ±1.67
Integridad acrosomal (%) |  | 52.65ᵃ ±8.42 | 44.97ᵇ±5.47
Movilidad total (%) |  | 20.02ᵃ ±7.78 | 7.63ᵇ±2.61
Espermatozoides vivos (%) | DCD | 30.07ᵃ ±9.63 | 13.65ᵇ±2.54
Funcionalidad membrana espermática (%) |  | 30.82ᵃ ±5.41 | 12.41ᵇ±2.42
Integridad acrosomal (%) |  | 33.62ᵃ ±6.01 | 30.76ᵇ±7.83

a-b Letras diferentes dentro de una misma columna representan diferencias significativas (P<0.05) para cada una de las características evaluadas.

PC= poscópula, DCD = desviación de conducto deferente

a-b-c Letras diferentes indican diferencias significativas (P <0.05)

Figura 4
Efecto de la adición de colesterol cargado con metil-β-ciclodextrina (MCD) con 0, 1.5 y 3 mg en espermatozoides de alpaca criopreservados. (A) Método PC refrigerado; (B) método DCD refrigerado; (C) método PC descongelado y (D) método DCD descongelado

De manera general en este estudio los EPZ tratados con MCD al refrigerarlos tuvieron mayor movilidad, EPZ vivos, funcionalidad espermática e integridad acrosomal que las muestras de EPZ descongelados. Estos resultados conforman que la adición de MCD mejora las características microscópicas de los EPZ, independientemente de la especie y método de colección utilizado tal como señala Ciprian 26 que utilizó 2 y 4 mg de MCD en alpacas, Crichton et al. 15 adicionaron 1.5 mg de MCD en dromedarios y Castillo et al. 13 usaron 2 y 4 mg de MCD en ovinos.

En nuestro estudio para el método de PC y DCD en la etapa de refrigerado las muestras tratadas con 1.5 mg MCD mostraron mayor movilidad, EZP vivos, funcionalidad de la membrana plasmática e integridad acrosomal en relación al tratamiento con 3 mg de MCD y control. Por tanto, sin considerar la especie animal, método de colección y concentración de MCD se observó un efecto en las características microscópicas datos que concuerdan con Crichton et al. 15 , que adicionaron 1.5 mg de MCD en dos tiempos de incubación 0 y 3 h y Castillo et al. 13 que añadieron 2 mg de MCD Figura 4 (A) y (B).

Los valores de la etapa pos-descongelado para el método de PC y DCD se muestra en la Figura 4 (C) y (D). Para la movilidad espermática no hubo diferencias estadísticas significativas (P>0.05) entre tratamientos para ambos métodos. Esta diferencia se especula que pueda deberse al método de colección, ya que los EPZ recuperados por DCD están desprovistos de plasma seminal. La presencia de plasma seminal puede influenciar a la calidad de EPZ, considerándose esencial para la conservación y viabilidad de los EPZ porque está constituida por antioxidantes (vitamina C y E, urato, albumina, taurina, proteínas) que está relacionado con la viabilidad del EPZ Novak et al. ²⁷ . Además, Ciprian 26 con (2 mg de MCD) usando el método de colección de electroeyaculación y Crichton et al. ¹⁵ con (1.5 mg de MCD) utilizando vagina artificial encontraron mayor movilidad de los EPZ, estudios que sustentarían esta afirmación. Sin embargo, para la vitalidad espermática pos-descongelación, no se encontró diferencia significativa (P >0.05) entre tratamientos para el método de PC, pero para el método de DCD hubo diferencias estadísticas significativas. La vitalidad determina el porcentaje de EPZ vivos o muertos, independientemente de su viabilidad Giuliano et al. 17 . Las diferencias posiblemente sean por el plasma seminal, y por ende hay mayor viscosidad del semen que interfiere en una mejor acción del dilutor sobre los EPZ Ciprian ²⁶ a pesar que en este trabajo se añadió como degelificador papaína. En los EPZ recuperados por DCD se observó que tuvieron mejor afinidad con 1.5 mg de MCD probablemente porque estaban desprovistos de plasma seminal. Por otro lado, Ciprian 26 encontró mayor porcentaje de EPZ vivos con 2 mg de MCD en alpacas, y Viñán et al. ²⁸ , observaron mayor porcentaje de EPZ vivos para 1.5 mg de MCD comparados con el grupo control en carneros, promedios que son superiores a los hallados en este trabajo, pero que siguen el mismo patrón de mejorar la vitalidad a los EPZ.

La funcionalidad de la membrana espermática fue mayor (P<0.05) para las muestras tratadas con 1.5 mg de MCD en relación al tratamiento con 3 mg y control para el método de PC, sin embargo, no hubo diferencias entre tratamientos, la razón de las diferencias no está bien claras.

La integridad acrosomal pos-descongelación fue superior (P>0.05) para los EPZ tratados con 1.5 mg de MCD en relación al tratamiento de 3 mg y control para ambos métodos de colección PC y DCD. Por tanto, se asume que estas diferencias estarían asociadas a la concentración de la adición de MCD. Crichton et al. 15 en dromedarios, también expusieron que los EPZ con la presencia de 1.5 mg de MCD mostraron mayores porcentajes de EPZ con acrosoma intacto, similar a la reportado por Ciprian Achircana 26 , quién obtuvo mayores promedios con 2 mg de MCD.

El efecto de adicción de MCD con diferentes concentraciones tuvo la misma tendencia de mejorar la movilidad, la viabilidad y funcionalidad de la membrana en los EPZ, la fluidez y estabilidad ante los cambios osmótico y de temperatura al criopreservado tal como lo describe Mocé et al. 29 .

En conclusión, los EPZ al refrigerado colectados por el método de PC y DCD tuvieron mayor movilidad, vitalidad, funcionalidad de la membrana e integridad acrosomal. En la etapa de refrigerado y descongelado en ambos métodos de colección los EPZ tratados con 1.5 mg de MCD tuvieron efecto positivo sobre la movilidad, el porcentaje de EPZ vivos, la funcionalidad de la membrana espermática e integridad acrosomal.

Literatura citada

1. Santiani A, Huanca W, Sapana R, Huanca T, Sepúlveda N, Sánchez R. Effects on the quality of frozen-thawed alpaca (Lama pacos) semen using two different cryoprotectants and extenders. Asian J Androl 2005;7(3):303-9. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1745-7262.2005.00021.x

2. Bravo PW, Alarcon V, Baca L, Cuba Y, Ordoñez C, Salinas J, et al. Semen preservation and artificial insemination in domesticated South American camelids. Anim Reprod Sci 2013;136(3):157-63. DOI: https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2012.10.005

3. Enríquez E, Bravo W, Ordoñez C. Efecto de la tripsina y tres dilutores en semen de alpaca. Rev Allpaka 1997;6(1):19-22.

4. Hammerstedt RH, Graham JK, Nolan JP. Cryopreservation of mammalian sperm: what we ask them to survive. J Androl 1990;11(1):73-88. DOI: https://doi.org/10.1002/J.1939-4640.1990.TB01583.X

5. Amann RP, Pickett BW. Principles of cryopreser-vation and a review of cryopreservation of stallion spermatozoa. J Equine Vet Sci 1987;7(3):145-73. DOI: https://doi.org/10.1016/S0737-0806(87)80025-4

6. Parks JE, Lynch DV. Lipid composition and thermotropic phase behavior of boar, bull, stallion, and rooster sperm membranes. Cryobiology 1992; 29(2):255-66. DOI: https://doi.org/10.1016/0011-2240(92)90024-v

7. Osheroff JE, Visconti PE, Valenzuela JP, Travis AJ, Alvarez J, Kopf GS. Regulation of human sperm capacitation by a cholesterol efflux-stimula ted signal transduction pathway leading to protein kinase A-mediated up-regulation of protein tyrosi ne phosphorylation. Mol Hum Reprod 1999;5(11): 1017-26.DOI: https://doi.org/10.1093/molehr/5.11.1017

8. Watson PF. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen. Anim Reprod Sci 2000;60-61:481-92. DOI: https://doi.org/10.1016/S0378-4320(00)00099-3

9. Li G, Saenz J, Godke RA, Devireddy RV. Effect of glycerol and cholesterol-loadedcyclodextrin on freezing-induced water loss in bovine spermato zoa. Reproduction 2006;131(5):875-86. DOI: https://doi.org/10.1530/rep.1.00995

10. Purdy PH, Graham JK. Effect of cholesterol-loaded cyclodextrin on the cryosurvival of bull sperm. Cryobiology 2004;48(1):35-45. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2003.12.001

11. Saenger W. Cyclodextrin inclusion compounds in research and industry. Angew Chemie Int Ed English 1980;19(5):344-62. DOI: https://doi.org/10.1002/ANIE.198003441

12. Yancey PG, Rodrigueza WV, Kilsdonk EP, Stoudt GW, Johnson WJ, Phillips MC, et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins. Demonstration Of kinetic pools and mechanism of efflux. J Biol Chem 1996;271(27):16026-34. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.271.27.16026

13. Castillo Cevallos LA, Páucar Espinoza E, Alvarado Malca E. Adición de metil-ß-ciclodex trina cargada de colesterol en la criopreservación de semen de carnero. Rev Investig Vet Perú 2019; 30(4):1637-44. DOI: https://doi.org/10.15381/rivep.v30i4.17160

14. Moore AI, Squires EL, Graham JK. Adding choles terol to the stallion sperm plasma membrane improves cryosurvival. Cryobiology 2005;51(3): 241-9. DOI: https://doi.org/10.1016/j.cryobiol.2005.07.004

15. Crichton EG, Pukazhenthi BS, Billah M, Skidmore JA. Cholesterol addition aids the cryopreservation of dromedary camel (Camelus dromedarius) spermatozoa. Theriogenology 2015;83(2): 168-74. DOI: https://doi.org/10.1016/j.theriogenology.2014.09.005

16. Alarcón BV, García VW, Bravo PW. Inseminación artificial de alpacas con semen colectado por aspiración vaginal y vagina artificial. Rev Investig Vet Perú 2012;23(1):58-64. DOI: https://doi.org/10.15381/rivep.v23i1.882

17. Giuliano SM. Semen collection and evaluation of South American Camelids. Spermova 2012;2(1): 6-9.

18. de Deco-Souza T, de Paula TAR, Costa DS, Costa EP, Barros JBG, de Araujo R, et al. Comparação entre duas concentrações de glicerol para a criopreservação de sêmen de suçuarana (Puma concolor). Pesq Vet Bras 2013;33(4)512-516. DOI: https://doi.org/10.1590/S0100-736X2013000400015

19. Quispe HA, Ciprian R, Ordoñez C, Ampuero E, Cucho H. Hypoosmotic swelling test in alpaca (Vicugna pacos) spermatozoa recovered the vas deferens. Spermova 2015;5(1):10-14. DOI: http://doi.org/10.18548/aspe/0002.2

20. Meza A, Caldeira C, Valverde A, Ordóñez C, Ampuero E, Cucho H, et al. Sperm kinematic characterization of alpaca (Vicugna pacos L.) during the reproductive season. Reprod Domest Anim 2018;53(6):1415-1423. DOI: https://doi.org/10.1111/rda.13284

21. Cucho H, López Y, Caldeira C, Valverde A, Ordóñez C, Soler C. Comparison of three different staining methods for the morphometric charac terization of Alpaca (Vicugna pacos) sperm, using ISAS(r) CASA-Morph system. Nov Biol Reper 2019;6(3):284-91. DOI: https://doi.org/10.29252/nbr.6.3.284

22. Flores Huarco NH, Susana María Giuliano SM (dir), Cucho Dolmos HC (dir). Criopreservacion de espermatozoides de alpaca (Vicugna pacos) utilizando N, N-dimetilformamida al 4 y 7 % [tesis maestria]. [Buenos Aires]: Universidad de Buenos Aires; 2011. [citado 26 de octubre de 2020]. Recuperado a partir de: http://ri.agro.uba.ar/files/download/tesis/maestria/2018floreshuarconilsherber.pdf

23. Carretero MI, Fumuso FG, Miragaya M, Giuliano SM. Evaluation of acrosomal status on llama sperm. Spermova 2015;5(2):258-63. DOI: https://doi.org/10.18548/aspe/0002.46

24. Ordoñez C, Ampuero E, Alarcón V, Franco E, Hanzen C, Cucho H. Three extenders evaluation in cryopreservation of alpaca (Vicugna pacos) semen in pellets. Spermova 2015;5(1):119-23. DOI: http://doi.org/10.18548/aspe/0002.27

25. Huanca Marca NF. Indice de grafmentacion de ADN espermatico en semen de alpacas (Vicugna pacos) utilizando el integrated semen analysis system - ISAS [tesis licenciatura]. [Cuzco]: Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco; 2016 [citado 6 de septiembre de 2021]. Recuperado a partir de: https://repositorio.un-saac.edu.pe/handle/20.500.12918/1800

26. Ciprian Achircana R. Criopreservacion del semen de alpaca utilizando metil-ß-ciclodextrina cargada con colesterol [tesis maestría]. [Lima]: Univer sidad Nacional Agraria La Molina; 2018 [citado 16 de septiembre de 2021]. Recuperado a partir de: https://repositorio.lamolina.edu.pe/handle/20.500.12996/3603

27. Novak S, Smith TA, Paradis F, Burwash L, Dyck MK, Foxcroft GR, et al. Biomarkers of in vivo fertility in sperm and seminal plasma of fertile stallions. Theriogenology 2010;74(6):956-67. DOI: https://doi.org/10.1016/J.theriogenology.2010.04.025

28. Viñán Díaz HP, Paucar Espinoza JE, Alvarado Malca E. Adición de metil-ß-ciclodextrina cargada de colesterol sobre la criopreservación de semen de toros Holstein Friesian. Rev Investig Vet Perú 2019;30(4):1611-8. DOI: https://doi.org/10.1016/10.15381/rivep.v30i4.17159

29. Mocé E, Blanch E, Tomás C, Graham JK. Use of cholesterol in sperm cryopreservation: present moment and perspectives to future. Reprod Domest Anim 2010;45(2):57-66. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1439-0531.2010.01635.x

Notas

Fuente de financiamiento: Agradecemos a los autores por el apoyo economico.

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Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés personal o económico, ni sus intereses han influenciado en los resultados del estudio.

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Agradecimientos: Estamos agradecidos al laboratorio de biotecnología reproductiva de la Raya por las facilidades prestadas

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Consideraciones éticas: Los autores declaran que el presente estudio se ha llevado a cabo de acuerdo con el Código de Ética para los experimentos con animales, tal y como se refleja en la normativa: http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm

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Aporte de los autores en el artículo: Ccalta Hancco Ruth, preparación y ejecución. Ordoñez-Rodríguez Cesar Domingo, desarrollo de la metodología. Ccalta Hancco Ada Luz, concepción y diseño, edición del artículo. Cucho Dolmos Hernán Carlos, supervisión del estudio.

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Limitaciones en la investigación: No hubo limitaciones en la investigación.

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ID del artículo: 120/JSAAS/2022

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Nota del Editor: Journal of the Selva Andina Animal Science (JSAAS). Todas las afirmaciones expresadas en este artículo son únicamente de los autores y no representan necesariamente las de sus organizaciones afiliadas, o las del editor, editores y los revisores. Cualquier producto que pueda ser evaluado en este artículo, o la afirmación que pueda hacer su fabricante, no está garantizado o respaldado por el editor.

Notas de autor

* Dirección de contacto: Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco. Facultad de Ciencias Agrarias. Escuela Profesional de Zootecnia. Departamento Académico de Ganadería. Granja K’ayra S/, San Jerónimo. Av. de la Cultura 773, Cusco 08000. Tel: +51.84.604100-51.84604160. Fax 51.84.238156. AP921-Cusco, Perú.

Ruth Ccalta Hancco E-mail address: ruthccaltahancco1992@gmail.com

Enlace alternativo

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