INTRODUCCIÓN

Los compuestos organofosforados forman parte de los plaguicidas de mayor uso a nivel mundial, dado su bajo costo y gran efectividad, siendo detectados en muestras de aguas subterráneas, aguas superficiales, agua potable, suelos y vegetales (Martínez et al., 2000; Lambropoulou et al., 2002). Entre ellos destaca el clorpirifos [O,O-dietil O-(3,5,6-tricloropiridin-2-il) fosforotioato] (CP), cuya toxicidad puede incrementar en presencia de sus metabolitos, tales como el clorpirifos oxon (CPO) (Figura 1), uno de sus metabolitos producto de su oxidación.

Figura 1.
(a) Clorpirifos. (b) Clorpirifos Oxon

El CP es un insecticida de amplio uso en el hogar y en agricultura donde, se aplica de forma directa a cosechas. Este compuesto se degrada por acción de la luz solar, bacterias u otros procesos químicos (ATSDR, 1997). Se ha reportado que su persistencia en el suelo va de unos pocos días hasta 4 años y en vegetales entre 3 a 60 días, aproximadamente, dependiendo de las características fisicoquímicas del suelo; siendo relevante el contenido de materia orgánica presente (Márquez et al., 2010).

Se ha descrito que CP se distribuye un 49,6 % en el suelo, 46,3 % en los sedimentos y 2,3 % en agua, sin embargo, estos rangos varían de acuerdo con la tasa de aplicación, el tipo de ecosistema y factores medioambientales (Mackay, 2001). El CP como contaminante es capaz de movilizarse a través del perfil de suelo y llegar a aguas subterráneas, o bien ser transportado a aguas superficiales. A nivel de toxicidad, el CP es altamente tóxico tanto para peces como para organismos invertebrados (Giesy et al., 1999) y para la vida humana clasifica como un plaguicida de clase II (EPA, 2016; Lazić et al., 2012).

Para el análisis de contaminantes en matrices medioambientales, la extracción del analito de interés desde la matriz constituye uno de los pasos críticos en el proceso. En este sentido, se hace necesario evaluar nuevas metodologías de extracción bajo el concepto de la química analítica verde, el cual involucra el desarrollo de metodologías analíticas con una preocupación medioambiental, eliminando o disminuyendo las fuentes de contaminantes con la intención de que los productos y procesos no pongan en peligro cualquier forma de vida. La química analítica verde fomenta el uso de análisis directo, así como la miniaturización, automatización y ahorro tanto de energía como de insumos, reduciendo así los desechos generados y garantizando la seguridad del operador (Armenta y col., 2019).

La clásica extracción líquido-líquido requiere de prolongados periodos de tiempo, grandes volúmenes de disolventes y múltiples etapas, donde problemas como la emulsión de la muestra dificultan la extracción del analito desde la matriz (Marsin et al., 2011); para mejorar este proceso y disminuir la cantidad de solventes empleados la micro-extracción líquido-líquido dispersiva (DLLME, por sus siglas en inglés) puede ser una excelente alternativa. Esta metodología fue desarrollada para pre-concentrar analitos orgánicos desde matrices acuosas y ha sido aplicada a matrices alimenticias, fluidos biológicos y muestras sólidas (Rezaee et al., 2006 and 2010). La DLLME integra en una etapa la extracción y concentración de los analitos, empleando dos fases líquidas inmiscibles: una acuosa (donde se encuentra la muestra) y otra orgánica, (disolvente orgánico) (Martins et al., 2012), a la cual se transfiere el analito de interés para su posterior cuantificación. Dentro de las técnicas más utilizadas para la cuantificación de CP está la cromatografía de gases con detector de microcaptura electrónica (GC-μECD, por sus siglas en inglés).

Según lo descrito resulta de gran importancia contar con metodologías de extracción amigables con el medio ambiente y con adecuadas cifras de mérito que permitan realizar la determinación de contaminantes como CP en muestras de aguas y poder evaluar su movilidad en el medioambiente, siendo este el objetivo perseguido en esta investigación.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se preparó una curva de calibración entre 25 y 400 µg/L para CP con la adición de estándar interno PCB 103 (SI) en concentración 150 μg/L, usando como solvente n-hexano. Los análisis se realizaron en un cromatógrafo de gases con detector de micro captura electrónica, 7890A, Agilent Technologies, usando las condiciones cromatográficas optimizadas para este análisis.

Para llevar a cabo la DLLME se utilizó una mezcla extractante compuesta por 20 mL de metanol (agente dispersante) y 1 mL de CS2 (agente extractante). Para los análisis se consideró un blanco y una solución acuosa que contenía CP en concentración de 250 μg/L. Para el proceso de extracción se utilizaron tubos de vidrio con tapa, en los cuales se adicionó 5 mL de la solución de CP. Luego se adicionó 1 mL de la solución extractante. Luego estas mezclas se llevaron a agitación, donde se realizó la optimización del tiempo de agitación, considerando 5 tiempos entre 5 y 30 minutos (análisis en cuadriplicado). Posterior a esto las mezclas fueron centrifugadas a 2000 rpm, durante 3 minutos. La gota formada fue extraída con una pipeta Pasteur y depositada en un vial color ámbar, para luego ser llevada a sequedad con una corriente de N2 a 40 °C en baño seco. Finalmente, se realizó la reconstitución de las muestras con 0,5 mL de n-hexano con adición de SI, para ser analizadas por GC-µECD. Los análisis se realizaron por triplicado.

Se determinó el límite de detección (LD) y de cuantificación (LC) por medio de la inyección de diez blancos. Para el LD se usó la fórmula YLD = YB + 3 σB, donde σB es la desviación estándar de las áreas obtenidas para el blanco y YB es el promedio de área de los blancos. Para el cálculo de LC se hace el mismo procedimiento, pero se multiplica por diez la desviación estándar (YLC = YB + 10 σB). Posteriormente estos valores (YLD y YLC) se interpolaron en la curva de calibración, obteniéndose la concentración correspondiente para LD y LC. La precisión en este estudio fue evaluada por medio de la repetibilidad y la exactitud se evaluó por cálculos de porcentajes de recuperación del analito.

RESULTADOS

Los resultados obtenidos del análisis por GC-μECD, dieron cuenta de un tiempo de retención promedio para CP de 8,80 minutos, mientras que para el SI fue 9,196 minutos. Las condiciones cromatográficas utilizadas se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1.
Condiciones cromatográficas usadas para el análisis de CP por medio de GC-μECD

Temperatura inyección	250 °C
Detector	300 °C
Gas	N2
Make Up N2	20 mL/min
Flujo	1 mL/min
Volumen de inyección	10 µL
Modo de inyección	Splitless
Columna	HP-5: 325°C: 30m x 320µm x 0,25µm

Para el análisis se utilizó un programa de temperatura (Tabla 2) el cual considera tres rampas, desde 100 hasta 280 °C, con un tiempo total de 15 minutos.

Tabla 2.
Programa de temperatura usado para el análisis de CP por medio de GC-μECD

Puntos	Razón [°C/min]	Temp. [°C]	Tiempo [min]	Tiempo total [min]
Inicial	---	100	1	1
Rampa 1	85	150	0	1,5
Rampa 2	25	200	0	3,6
Rampa 3	7	280	0	15

Con respecto a la curva de calibración de CP con adición de SI (Figura 2), los resultados mostraron una buena correlación en base a la linealidad de la curva (Y=0,7712 X-0,0792, r=0,997)

Figura 2.
Curva de calibración para CP (Y= Área CP /Área SI; X=[ ] CP/[ ] SI)

Los LD y LC obtenido fueron de 3,2 y 6,8 µg/L, respectivamente, con una precisión expresada como la desviación estándar relativa (RSD) de 16,2%.

Se analizaron los extractos de los blancos obtenidos de la DLLME, donde se determinó que no hay señales de la matriz que dificulten la cuantificación de los analitos en los tiempos de retención determinados por medio de GC-µECD (Figura 3).

Figura 3.
Cromatograma optimizado de la muestra blanco

Los resultados de las pruebas de DLLME considerando distintos tiempos de agitación, para la extracción de CP en muestra acuosa (250 µg/L) se muestran en la Figura 4, donde se puede observar que el mayor porcentaje de recuperación de CP se obtiene para los tiempos de agitación 10 y 15 minutos con 108 y 88%, respectivamente.

Figura 4.
Relación entre porcentaje de recuperación de CP y el tiempo de agitación usada en DLLME

Los resultados dan cuenta de una precisión expresada como desviación estándar relativa menor a 6 % para los tiempos menores a 20 minutos. Con respecto a la obtención de la gota, los volúmenes usados permitieron obtener una gota de tamaño adecuado para su separación desde la solución de extracción y su posterior cuantificación.

DISCUSIÓN

Al comparar los LD y LC obtenidos con los reportados en literatura, se evidencia que la metodología de DLLME con GC- µECD tiene una alta sensibilidad, con LD y LC menores a los reportados en literatura para esta metodología de extracción (Tabla 3), esto se debe a que el detector de microcaptura electrónica posee una mayor sensibilidad, sumado a que la metodología de DLLME obtuvo porcentajes de recuperación adecuados para el análisis de este tipo de contaminante en una matriz acuosa Al comparar los LC y LD obtenidos por DLLME y SPE del analito desde matriz acuosa, esta última metodología permite cuantificar al analito a una concentración 2 veces menor que para DLLME. La discrepancia entre los resultados se puede deber a las diferencias en los procedimientos de las metodologías empleadas, ya que la SPE arrastra una menor cantidad de posibles interferentes, permitiendo así tener menor ruido por efecto matriz y por lo tanto discriminar a una menor concentración la señal del analito (Lazic et al., 2012; Marsin et al., 2011). La DLLME presentó una precisión expresada como de la deviación estándar relativa menor a 14,2 %, y una exactitud expresada como la recuperación, para un tiempo de agitación de 15 minutos de 88 %.

Existe una preocupación por el desarrollo de nuevas metodologías de extracción, que no sólo permitan la adecuada determinación de contaminantes de interés desde matrices medioambientales, sino que además se ajuste a lo que se conoce como química analítica verde y sustentable, que implica poco impacto ambiental, bajos efectos nocivos en los operarios y asequible (Marcinkowska et al., 2019).

Tabla 3.
Comparación de LD y LC obtenido para la determinación de CP usando SPE y DLLME

[ ]	SPE Lazic et al., (2012)	DLLME Este trabajo	DLLME Marsin et al., (2011)
LD	4	18,3	95
LC	10	22,4	318

La DLLME es una metodología con un bajo consumo de solventes, con pocas etapas de proceso, lo que disminuye los tiempos de análisis, a diferencia de la SPE donde se utilizan mayores volúmenes de solvente, y que considera más de una etapa, como es el acondicionamiento de las columnadas de extracción, carga de la muestra, lavado, y posterior elución del analito. Ante este escenario la metodología de DLLME optimizada en este trabajo es una alternativa que se ajusta al concepto de química analítica verde, con cifras de mérito adecuadas para el análisis de muestras medioambientales.

CONCLUSIÓN

La metodología DLLME usando como solución extractante metanol: CS2 en una proporción 20:1, tiempo de agitación de 15 minutos, permitió extraer al analito desde la matriz acuosa. Se determinó para la DLLME un LD y LC de 18,3 y 22,4 μg/L, respectivamente, una precisión expresada como desviación estándar relativa menor al 14,2 %, y un porcentaje de recuperación 88 %. De esta manera se puede concluir que DLLME asociado a GC-μECD es una alternativa con cifras de mérito adecuadas para la cuantificación de CP desde matriz acuosa, con la ventaja de ser una metodología con menor impacto ambiental que la SPE.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por Fondecyt, proyecto No. 11110223.

LISTA DE REFERENCIAS

Armenta, S., Garrigues, S., Esteve-Turrillas, F. &, de la Guardia, M. (2019). Green extraction techniques in green analytical chemistry. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 116, 248-253.

ATSDR. 1997. Resumen de salud pública: clorpirifos. [en línea]. . [consulta: 1 de octubre, 2021].

Environmental Protection Agency (EPA). 2016. “Revised chlorpyrifos preliminary registration review drinking Waters assessment”. https://www.regulations.gov/document/EPA-HQ-OPP-2015-0653-0454

Giesy, J., Solomon, K., Coats, J., Dixon, K., Giddings, J. & Kenaga, E. (1999). Chlorpyrifos: Ecological Risk Assessment in North American Aquatic Environments. In: Ware G.W. (eds). Reviews of Environmental Contamination and Toxicology, vol 160. Springer, New York, NY. https://doi.org/10.1007/978-1-4612-1498-4_1

Mackay, D. (2001). Multimedia Environmental Models: The Fugacity Approach, Second Edition (2nd ed.). CRC Press. https://doi.org/10.1201/9781420032543

Marcinkowska, R., Namiesnik, J. & Tobiszewski, M. (2019). Green and equitable analytical chemistry. Green and Sustainable Chemistry, 19, 9-23.

Márquez, S., Mosquera, R. & Herrera, M., (2010). Estudio de la absorción y distribución del clorpirifos en plantas de pasto Kikuyo (Pennisetum clandestinum Hochst ex chiov.) cultivadas hidropónicamente. Revista Colombiana de Ciencias Pecuarias, 23(2), 158-165.

Marsin, M., Umairah, S., Akmam, M. & Aini, W. (2011). Determination of organophosphorus pesticides by dispersive liquid-liquid microextraction coupled with gas chromatography-electron capture detection. The Malaysian Journal of Analytical Sciences, 15(2), 232-239.

Martínez, J., Pablos, M.C., Garrido, A. & Arrebola, F.J. (2000). Pesticide trace analysis using solid-phase extraction and gas chromatography with electron-capture and tandem mass spectrometric detection in water samples. Journal of chromatography A, 867(1), 235-245.

Martins, M., Primel, E., Souza, S., Prestes, O., Bohrer, M. & Zanella, R. (2012). Microextración Líquido-Líquido Dispersiva (DLLME): fundamentos y aplicaciones. Scientia Chomatographica, 4(1), 35-51.

Lambropoulou, D., Sakkas, V. & Albanis, T. (2002). Validation of an SPME method, using PDMS, PA, PDMS–DVB, and CW–DVB SPME fiber coatings, for analysis of organophosphorus insecticides in natural waters. Analytical and bioanalytical chemistry, 374(5), 932-941.

Lazic, S., Sunjka, D., Grahovac, N., Vukovic, S. & Jaksic, S. (2012). Determination of Chlorpyrifos in water used for agricultural production. Agriculture & Forestry, 57(11), 17-25.

Rezaee, M., Assadi, Y., Hosseini, M.R.M., Aghaee, E., Ahmadi, F. & Berijani, S. (2006). Determination of organic compounds in water using dispersive liquid–liquid microextraction. Journal of Chromatography A, 1116(1), 1-9.

Rezaee, M., Yamini, Y. & Faraji, M. (2010). Evolution of dispersive liquid–liquid microextraction method. Journal of Chromatography A, 1217(16), 2342-2357.

Notas