Las muestras de aserrín de Pinus patula fueron sometidas a un análisis fisicoquímico para determinación de humedad, celulosa, hemicelulosa y lignina. Para efectuar el proceso de hidrólisis del material lignocelulósico se realizó un diseño experimental tipo factorial 22 variando la concentración de hidróxido de sodio (p/v) y el tiempo de hidrólisis (min). Los resultados fueron analizados empleando el programa estadístico Statgraphics Centurion XVI.

Se obtuvieron las muestras de aserrín, utilizando una sierra eléctrica (manual Skill 3 ¼ HP), luego se pasaron por un molino eléctrico (Retsch – Germany SK100) y se tamizaron utilizando tamices malla 30 y 40. Las muestras se guardaron en un lugar seco para proceder con los análisis respectivos.

En el análisis fisicoquímico, inicialmente se determinó el porcentaje de humedad existente en las muestras de aserrín de Pinus patula.

El porcentaje de humedad del aserrín de Pinus patula fue determinado por diferencia de peso. Se colocó una muestra de 1.000 g en la estufa (Fisher scientific isotemp oven) a 105 ºC previamente molida y pasada por un tamiz de malla 30 hasta peso constante.

En un segundo paso, con la utilización de los métodos neutro detergente y ácido detergente propuesto por Van Soest (Moncada, Cardona, Higuita, Vélez, y López-Suarez, 2016) se determinó el contenido de hemicelulosa, para las respectivas muestras. Cada ensayo se efectuó por triplicado. Se utilizó un equipo de reflujo con balones de fondo plano de 500 mL y se preparó un litro de solución neutro detergente que contenía sulfato lauril sódico GR (Grado Reactivo). Ácido etilendiamino tetracético (EDTA) GR, borato de sodio decahidratado GR, fosfato disódico anhidro GR y éter etílico GR . Se pesaron 1.000 g de muestra molida y pasada por tamiz malla 30 y se depositaron en el balón, luego se agregaron 100 mL de solución neutro detergente, 1,6 mL de naftaleno y 0,500 g de sulfito de sodio. Se calentó y se mantuvo el reflujo por 60 min después de la ebullición. Luego se colocó la solución con la muestra suspendida en un embudo de porosidad gruesa y se filtró al vacío, se lavó con agua caliente y luego acetona. Los embudos con la muestra se secaron a 105 ºC durante toda la noche y después de enfriarlos en desecador se pesaron para calcular el porcentaje de hemicelulosa (w1). Luego se preparó 1,0 L de solución ácido detergente que contenía ácido sulfúrico GR 1,0 N y 20,00 g de bromuro de cetil trimetil amonio GR. Para iniciar el procedimiento se pesaron 1.000 g de aserrín y se depositaron en un balón de 500 mL, se adicionó 100 mL de solución ácida detergente y 1,6 mL de naftaleno, después se reflujó por 60 min, luego se filtró a través de un embudo de porosidad gruesa previamente pesado y se lavó con agua caliente (90 – 100 ºC) y luego con acetona. La muestra se secó a 105 ºC en estufa, se enfrió en un desecador y se pesó (w2). La diferencia entre el contenido de fibra por el método de detergente neutro (w1), y detergente ácido (w2) es el porcentaje de hemicelulosa presente en la muestra. Las determinaciones de los dos componentes mayoritarios del aserrín se realizaron por separado, utilizando las metodologías implementadas en la industria papelera que a continuación se mencionan (ASTM, 1985).

Se pesaron 1.000 g de aserrín seco tamizado por malla 40, se colocaron en un balón de 250 mL y se adicionó a esta muestra 20 mL de alcohol etílico al 95 % GA (Grado Analítico) y 5,0 mL de ácido nítrico concentrado GR . Se reflujó en un baño María por tiempo inferior a 1 hora, luego se decantó la solución sobre un embudo de porosidad gruesa previamente tarado, el procedimiento antes descrito se repitió una vez más y por último se llevó a cabo una tercera digestión con 100 mL de agua destilada durante 1 h. Cumplido este tiempo se filtró en un embudo de porosidad gruesa, previamente tarado y se lavó el residuo varias veces con agua destilada caliente, luego se lavó con una solución saturada de acetato de sodio y nuevamente con agua caliente. Se secó a 105 ºC hasta peso constante y se registró el peso obtenido. Luego se calculó el porcentaje de celulosa en base seca.

Se colocaron 1.000 g de aserrín seco, molido pasado por un tamiz malla 40, en un vaso de 50 mL y se adicionaron 15 mL de ácido sulfúrico GR frío al 72 %, macerando la muestra con una varilla de vidrio y mantenido el recipiente en un baño a 20 ºC por dos horas, agitando regularmente. Al cabo de este tiempo se pasó el contenido del vaso a un balón de 1000 mL de fondo redondo con 575 mL de agua destilada hasta obtener una concentración de ácido sulfúrico al 3,0 %. Esta solución se mantuvo a reflujo por cuatro horas y se dejó en reposo para que se sedimente durante aproximadamente 12 h, luego se decantó el líquido sobrenadante sobre el embudo de porosidad gruesa (Kimax Brand 40-60 μm) previamente tarado, transfiriendo luego la lignina al embudo usando agua caliente hasta quitar completamente el ácido, posteriormente se secó a 105 ºC, se enfrió en desecador y se pesó, para calcular finalmente el porcentaje de lignina en base seca.

Para realizar la hidrólisis básica se pearon 35.000 g de aserrín de la especie en estudio y se depositaron en un reactor de acero inoxidable grado 304 que tiene un volumen de 500 mL, se le adicionó 250 mL de hidróxido de sodio GR (Grado Reactivo); (se trabajó con tres concentraciones 9, 10 y 12 % p/v). El reactor fue conectado a una termocupla y se procedió al calentamiento hasta alcanzar una temperatura de 176 ºC ± 2 la cual se mantuvo durante 60 y 90 min. De este procedimiento se obtienen los licores negros, a los cuales se les determinó la cantidad de soda residual mediante un análisis volumétrico. El residuo sólido se lavó cuidadosamente con agua hasta neutralidad y se secó en estufa, los datos se reportan en la Tabla 1.

Tabla 1.
Datos para Hidrólisis Básica de aserrín de Pinus patula

Fuente: Los Autores

Se tomaron 10 mL de licor negro mediante una pipeta volumétrica y se depositaron en un erlenmeyer de 250 mL, se adicionó 50 mL de agua destilada y 10 mL de una solución de cloruro de bario al 10 %, luego se tituló la mezcla con ácido clorhídrico GR 0,25 N hasta un pH de 8,3 potenciométricamente y se reportó el volumen consumido de ácido para realizar los respectivos cálculos y establecer las concentraciones adecuadas de hidróxido de sodio durante la hidrólisis básica.

Para la determinación de la efectividad de la hidrólisis básica, en cuanto al grado de deslignificación obtenido, se hizo la determinación del “Número Permanganato”, para lo cual se tomaron 1.000 g de muestra tratada y se colocaron en un beaker de 600 mL, el cual contenía 200 mL de agua destilada y un agitador magnético. Mediante una plancha con agitación la muestra se mezcla y se verifica que no haya grumos. En un erlenmeyer de 250 mL se depositan 25 mL de permanganato de potasio GR 0,100 N y 25 mL de ácido sulfúrico 0,280 N, esta mezcla se adiciona al contenido del beaker y se coloca en marcha un cronómetro, inmediatamente se midieron 25 mL de sulfato ferroso amoniacal GR, 0,100 N depositándose en el mismo erlenmeyer que antes contenía las soluciones de ácido y permanganato, así mismo se midieron 100 mL de agua destilada en una probeta graduada. La reacción se suspendió a los tres (3) min agregando el contenido del erlenmeyer en el vaso, la agitación se suspendió a los 15 s. Luego se filtró en un embudo Buchner y el filtrado se tituló con una solución de permanganato de potasio 0,100 N hasta obtener una coloración violeta pálido. Se anotó el volumen gastado durante la titulación y con los datos obtenidos se calculó el porcentaje de lignina residual en las muestras ya hidrolizadas.

Todas las determinaciones se hicieron por triplicado, teniendo un total de 36 muestras. Inmediatamente después de realizar la hidrólisis básica de todas las muestras se determinó la soda residual, o análisis de alcalinidad residual a los licores negros, con el fin de saber cuánto sodio reaccionó en el proceso. Las muestras fueron lavadas cuidadosamente con agua destilada hasta la neutralidad, luego se secaron en un horno para análisis posteriores. En la Figura 1 se muestra el reactor de acero inoxidable en el cual se llevó a cabo la hidrólisis básica, también una muestra de licor negro y aserrín después de la hidrólisis.

Figura 1.
Reactor para la realización de la hidrólisis básica, licor negro y aserrín después de la hidrólisis.
Fuente: Los autores

Los datos reportados en la Tabla 1 muestran los resultados obtenidos después de la hidrólisis básica de las muestras de Pinus patula tamizadas por malla 30 y por malla 40. En los datos reportados en la Tabla 1, se puede apreciar que de las muestras tamizadas por malla 30, la que presenta mayor porcentaje de hidrólisis es la tratada con hidróxido de sodio al 10 %, pero en general se presenta un comportamiento poco secuencial. Se pudo observar que con malla 30, 10 % de hidróxido de sodio y 90 min se obtienen porcentajes de muestra hidrolizada más bajo que con un tiempo de 60 min. De igual forma se observa para malla 30,9 % de hidróxido de sodio y 90 min, un porcentaje más alto a tiempos de 60 min. Lo contrario ocurre para malla 30,12 % de hidróxido de sodio, donde se obtienen porcentajes más altos a tiempos de 90 min. Para malla 40, concentraciones de hidróxido de 9, 10 y 12 % se observan mayores rendimientos a tiempos altos de 90 min. Teniendo en cuenta estos resultados, se muestra que tamaños de partícula pequeños facilitan la hidrólisis a concentraciones intermedias y menores tiempos de reacción. (Singh, Shukla, Tiwari, y Srivastava, 2014). Se pudo observar una alta correlación (0,993) entre la concentración de hidróxido y el porcentaje de muestra hidrolizada a malla 30 y tiempo de 90 min. También se observó alta correlación (0,976) entre la concentración de hidróxido y el porcentaje de muestra hidrolizada a malla 40 y tiempo de 60 min. De esta tabla también se puede concluir que el porcentaje de hidrólisis para las muestras tamizadas por malla 40, aumenta a medida que aumenta la concentración de hidróxido de sodio y el tiempo de reacción. El porcentaje de muestra hidrolizada en el pretratamiento básico representa una fracción de la muestra que fue extraída, el cual consiste de carbohidratos solubles (pentosas, xilosas, etc.), resinas, lignina, hemicelulosa hidrolizada durante el pretratamiento y productos de degradación de la celulosa. Se estima que la celulosa no se hidrolizó en esta etapa, puesto que para lograrlo se necesitan condiciones más severas como son: temperatura por encima de los 180 ºC y tiempo de reacción no menor de dos horas (Mojica et al., 1984; Díaz, 1986). Un adecuado pretratamiento involucra el rompimiento de los enlaces de hidrógeno de la celulosa cristalina, la ruptura de la matriz hemicelulosa-lignina, y finalmente, un incremento de la porosidad y área superficial de la celulosa para la subsecuente hidrólisis enzimática (Mood et al., 2013). Se pudo observar en los resultados de la Tabla 4, un incremento en el porcentaje promedio de celulosa del 8,67 al 10,23 % después de realizar el pretratamiento, al compararse con el contenido de celulosa reportado en la Tabla 1, lo cual indica que el pretratamiento usando la solución alcalina incrementa la disponibilidad de celulosa para una posterior hidrólisis. Para incrementar la digestibilidad de la celulosa se deben remover grandes cantidades de hemicelulosa debido a que la hemicelulosa cubre fibrillas de la celulosa limitando su disponibilidad para realizar una hidrólisis enzimática (Singh et al., 2014).

La cantidad requerida para efectuar una buena deslignificación depende de la especie de la madera y de otros factores tales como la dimensión de la madera, pero está en el orden del 12 % (p/v) de solución de hidróxido de sodio, que es con la que en nuestro caso se logra un mayor grado de hidrólisis (McDonald, 1970; Saddler, Hogan, Chan, y Louis-Seize, 1982). De acuerdo con nuestros resultados respecto a los valores obtenidos de soda residual, se puede decir que en todos los casos siempre hay presencia de ella, pero no es adecuado trabajar con valores muy bajos, lo más apropiado es tener aproximadamente un 2 % de soda residual en un proceso como el realizado para la deslignificación del aserrín de la especie en estudio. Estudios del pretratamiento para especies como el Pino rojo han arrojado porcentajes de madera no tratada del 1,8 al 3,7 % (Zhu, Pan, Wang, y Gleisner, 2009). Además, es un parámetro a tener en cuenta en un proceso productivo, ya que sirve como control de consumo de reactivos e indica si existe una cantidad susceptible de recuperar (Alkasrawi, Galbe, y Zacchi, 2002; Dowe y McMillan 2000).

En la Tabla 3 se muestran los resultados obtenidos del análisis de varianza (ANOVA), realizado con ayuda del software Statgraphics Centurion XVI. El análisis de varianza se llevó a cabo para determinar la significancia estadística de cada efecto comparando su cuadrado medio contra un estimado del error experimental; de esta manera se obtienen los valores de los parámetros significativos en el proceso de hidrólisis básica del aserrín de Pinus patula.

Tabla 3.
Análisis de varianza para la hidrólisis del aserrín de Pinus patula

Fuente: Los autores

Los resultados estadísticos de ANOVA presentados en la Tabla 3 muestran que en el proceso de hidrólisis básica del aserrín de Pinus patula la concentración de hidróxido de sodio y el tiempo no muestran un efecto significativo en su rendimiento, debido a que ningún factor presenta un valor-P menor que 0,05, indicando que son significativamente diferentes de cero con un nivel de confianza del 95,0 %. El diagrama de Pareto, mostrado en la Figura 2, muestra que ni la concentración de hidróxido de sodio ni el tiempo de reacción influyen significativamente sobre el porcentaje de hidrólisis. Se puede observar en el diagrama de Pareto una influencia positiva de la concentración de hidróxido de sodio, lo que indica que a medida que aumenta la concentración mayor es el rendimiento del proceso de hidrólisis y una influencia negativa del tiempo de reacción, indicando que el rendimiento aumenta al disminuir el tiempo de reacción.

Figura 2.
Diagrama de Pareto para el proceso de hidrólisis del aserrín de Pinus patula.
Fuente: Los autores

La Tabla 4 presenta la combinación de los valores de los factores, con la cual se maximiza el porcentaje de rendimiento de hidrólisis del aserrín de Pinus patula para alcanzar un rendimiento máximo del 18,07 %.

Tabla 4.
Parámetros para una respuesta para maximizar el porcentaje de rendimiento de hidrólisis del aserrín de Pinus patula

Fuente: Los autores

El número permanganato es una medida que permite corroborar el grado de deslignificación logrado durante el proceso, debido a que determina el porcentaje de lignina residual. La lignina residual debe expresarse como el volumen en mililitros de permanganato de potasio para oxidar una cantidad equivalente de ella:

(1)

En donde:

25 = Volumen de KMnO₄ y FAS adicionados a la mezcla de reacción

0,1 = Normalidad de las soluciones

V = Volumen de KMnO₄ gastado en la titulación.

N KMnO₄ = Normalidad del KMnO₄.

N FAS = Normalidad del Sulfato ferroso amoniacal.

En la Tabla 5 se muestran los resultados de la determinación del número permanganato de las muestras de aserrín hidrolizadas con hidróxido de sodio. Se puede observar que el volumen gastado de permanganato de potasio en la titulación, corresponde al mismo número permanganato, esto se debe a que durante la realización de las pruebas se trabajó con soluciones de concentraciones iguales y por lo tanto el segundo factor de la ecuación 1 es igual a cero. En general, se puede observar que los resultados del # KMnO₄ se encuentran entre 10 y 20 mL, lo que correspondería aproximadamente a un porcentaje de lignina residual entre el 2,5 % y 4,8 %, de acuerdo con la tabla de correlación entre diferentes números de grado de deslignificación y el porcentaje de lignina Klason presente (ASTM, 1985). Debido a los porcentajes bajos de lignina residual se puede concluir que el pretratamiento utilizado, en este caso, la hidrólisis básica, es adecuado para los fines que se busca conseguir, como son la deslignificación del aserrín para obtener un sustrato casi libre de lignina y una mayor superficie de contacto, para una posterior hidrólisis enzimática (Mood et al., 2013., Singh et al., 2014).

Tabla 5.
Datos y resultados del # KMnO₄ para Pinus patula

Fuente: Los autores

El contenido de celulosa presente en las muestras ya hidrolizadas, y que fue determinado tomando 1.000 g de aserrín digestado, permitió conocer el incremento en el porcentaje de celulosa en las muestras hidrolizadas. Los resultados de estos análisis se observan en la Tabla 6. Se pudo observar para las muestras de aserrín de Pinus patula que casi todos los tratamientos son apropiados para que haya una mayor disponibilidad del contenido de celulosa (Stenberg, Bollók, Réczey, Galbe, y Zacchi, 2000), obteniéndose los mejores resultados cuando las muestras se trataron con soluciones de hidróxido de sodio al 10 y 12 %, un tamaño de malla 30 y un tiempo de 60 min.

Tabla 6.
Celulosa presente después del pretratamiento para Pinus patula

Fuente: Los autores

Con los resultados reportados anteriormente se pude establecer que las muestras de la especie Pinus patula más indicadas para ser sometidas a un ataque enzimático son las que se trataron con hidróxido de sodio con concentraciones del 10 y 12 % pero tamizadas por malla 30, debido a los mayores porcentajes de celulosa (Alegría y Muñoz, 2004).