Descripción de un caso de mieloencefalitis equina por protozoos (EPM) en Argentina

Case report of equine protozoal myeloencephalitis (EPM) in Argentina

La mieloencefalitis equina por protozoos (sigla en inglés EPM = equine protozoal myeloencephalitis) es una enfermedad causada principalmente por Sarcocystis neurona que genera pérdidas económicas significativas en la producción equina (Dubey et al., 2001). Los protozoarios apicomplexa del género Sarcocystis se caracterizan por presentar ciclos indirectos del tipo predador-presa, con formación de quistes musculares en los hospedadores intermediarios y multiplicación sexual y producción de esporocistos infectantes en el intestino de los hospedadores definitivos (Dubey et al., 2001). La distribución de EPM causada por S. neurona está restringida al continente americano, siguiendo la distribución de los huéspedes definitivos, las comadrejas Didelphis albiventris y Didelphis virginiana (Dubey et al., 2000; Fenger et al., 1995). Neospora caninum y Neospora hughesi son otros protozoarios formadores de quistes tisulares, reportados ocasionalmente como agentes causantes de EPM (Dubey et al., 2001; Hamir et al., 1998).

La EPM se caracteriza por signos neurológicos relacionados con lesiones multifocales del sistema nervioso central, siendo la atrofia muscular y dificultades en la marcha los signos más relevantes. Los métodos serológicos (principalmente inmunoblot y ELISA) son los recomendados para el diagnóstico in vivo, mientras que la histopatología, la inmunohistoquímica (IHQ) y la reacción en cadena de la polimerasa seguida de análisis de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) son algunos de los métodos recomendados para el diagnóstico post mortem (Dubey et al., 2001; Tanhauser et al., 1999; Yeargan & Howe 2011). En Argentina, se detectaron anticuerpos contra S. neurona en el 26 % de 640 equinos muestreados, observándose una seroprevalencia mayor en equinos con signos neurológicos que en animales asintomáticos (39,2 % versus 22,1 %); sin embargo, no se han descripto y confirmado casos clínicos mediante estudios post mortem (Moré et al., 2014). En estudios realizados sobre muestras de equinos asintomáticos, no se han detectado anticuerpos contra especies de Neospora o se detectaron en niveles bajos (Dubey et al., 1999; Rojas et al., 2016).

La comadreja overa (D. albiventris) tiene una amplia distribución en la mayoría de las zonas rurales y áreas suburbanas de nuestro país. Sin embargo, los intentos de aislar S. neurona de materia fecal o intestino de comadrejas de Argentina dieron como resultado la identificación de otras especies de Sarcocystis (Dubey et al., 2000; Dubey et al., 1999).

El objetivo de esta comunicación es describir un caso de EPM causado por S. neurona en un equino argentino confirmado mediante métodos histopatológicos, inmunohistoquímicos y moleculares.

Una yegua de 12 años, cruza, nacida y criada en un haras del partido de Cañuelas, provincia de Buenos Aires, Argentina, presentó marcha asincrónica progresiva, por lo que los médicos veterinarios del establecimiento instauraron un tratamiento sintomático con fenilbutazona (0,1 mg/Kg) y 3 g/día de vitamina B1, durante 15 días, sin resultados positivos. Posteriormente, la yegua mostró arpeo bilateral, dismetría e inestabilidad en la marcha, por lo que se decidió administrar la droga anticonvulsiva fenitoína (15 g/día) durante 75 días. También se efectuó la tenectomía del músculo extensor digital lateral de los miembros pelvianos, como tratamiento paliativo ante la sospecha de una intoxicación por ingestión de achicoria amarilla o diente de león (Hypochoeris radicata) (Torre, 2005), lo que produjo una mejoría leve en la marcha. A pesar del tratamiento, el cuadro clínico fue progresivo con depresión, respuesta deficiente a los estímulos, parálisis facial (ptosis auricular, palpebral, nasal y labial) y atrofia del músculo masetero. Además, presentó atrofia grave de los músculos del dorso, lomo y miembros pelvianos, temblores generalizados, arrastre severo de los cascos y tetraparesia. Se formuló un diagnóstico clínico de mieloencefalitis multifocal. Debido a la severidad e irreversibilidad del cuadro clínico y a la falta de respuesta a los tratamientos, se decidió la eutanasia (sedación: acepromacina 0,05 mg/kpv y xilacina 1,1 mg/kpv; anestesia: ketamina 3,5 mg/kpv y por último 100 ml de clorhidrato de procaína al 60 % endovenoso rápido), cinco meses después del inicio de los signos clínicos.

En la necropsia no se observaron lesiones en el sistema nervioso central ni en otros órganos. Se recolectaron muestras representativas de cerebro y médula espinal y se fijaron en formol tamponado al 10 % para estudios histopatológicos y se congelaron a -20 ºC para estudios moleculares. Las muestras para histopatología se procesaron mediante técnicas de rutina y las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las lesiones, en el tálamo y el metencéfalo, consistieron en múltiples y pequeños focos hemorrágicos y pequeños focos de inflamación crónica conformados principalmente por histiocitos y ocasionales células multinucleadas y células espumosas (gitter cells). En la médula espinal se observaron necrosis neuronal, satelitosis, infiltrados mononucleares perivasculares, tumefacción endotelial y áreas dispersas de degeneración axonal. La reacción de inmunohistoquímica se llevó a cabo con una técnica comercial basada en la unión de estreptavidina y biotina (LSAB, Dako Cytomation, Carpinteria, USA) utilizando un suero policlonal anti-S. neurona producido en conejo como anticuerpo primario, proporcionado gentilmente por el Dr. J. P. Dubey (Animal Parasitic Disease Laboratory, U.S. Department of Agriculture, Beltsville, USA). Mediante este estudio se reveló la presencia de merontes intracelulares de S. neurona y merozoitos libres en muestras de cerebro y médula espinal (Figura 1).

Figura 1: Fotomicrografías que muestran el resultado positivo de la inmunohistoquímica (LSAB, Dako Cytomation) para S. neurona en muestras de médula espinal (A) y cerebro (B). Se marcan específicamente (color pardo) merozoitos y merontes de S. neurona (flechas).

El ADN se extrajo a partir de 50 mg de cada tejido congelado utilizando un kit comercial (Wizard® Genomic DNA Purification Kit, Promega), procediendo de acuerdo con las instrucciones del fabricante e incubando la digestión con proteinasa K a 55 ºC durante toda la noche. Se amplificó el ADN mediante dos técnicas de PCR y se procedió al corte del amplificado con enzimas de restricción acorde protocolos descriptos previamente (Tanhauser et al., 1999). Se observó un patrón de restricción específico de S. neurona en muestras de cerebro mediante PCR-RFLP utilizando los primers JNB33-JNB54 digeridos con HinfI y DraI (37 ºC, 1 h), y los primers JNB25-JD396 digeridos con HinfI y HindIII (37 ºC, 1 h 30 min) (Fig. 2). El ADN del control positivo fue proporcionado gentilmente por el Dr. D. Howe (Department of Veterinary Science, Gluck Equine Research Center, University of Kentucky, USA).

Sobre la base de todos los resultados antes expuestos, se formuló un diagnóstico de mieloencefalitis producida por Sarcocystis neurona.

Figura 2

Patrón de restricción del fragmento amplificado mediante los primers JNB25-JD396 mediante la enzima HinfI. Electroforesis en gel de agarosa al 1,5 %, tinción con SYBRsafe y observación en transiluminador de luz azul (Invitrogen, USA). Referencias: 1= SNC del equino; 2= control negativo; 3= ADN S. neurona (control positivo); 4= Marcador de peso molecular, Cienmarker (Biodymamics, Argentina).

La presente comunicación describe un caso clínico con una progresión de los signos y con lesiones similares a las informadas previamente en otros casos de EPM (Dubey et al., 2001). Además, se confirmó la presencia de S. neurona en el tejido nervioso afectado mediante métodos inmunohistoquímicos y moleculares. Los tratamientos aplicados por los veterinarios actuantes en este caso fueron los usuales en el manejo general de los trastornos neurológicos, pero no mostraron ningún efecto sobre la infección por S. neurona. Mackay (2006) informó que el tratamiento específico con sulfadiazina-pirimetamina o ponazuril podría producir una mejoría en el 60 % de los casos. Por lo tanto, la aplicación de estos medicamentos podría tenerse en cuenta para tratar las etapas tempranas de trastornos neurológicos en casos similares. Estos medicamentos también podrían ayudar en la orientación del diagnóstico de EPM basado en la respuesta al tratamiento (Dubey et al., 2001).

La falta de lesiones macroscópicas en el presente caso podría deberse a una etapa crónica de EPM, lo que estaría de acuerdo con el curso clínico y confirmado por el estudio histopatológico. La mayoría de los casos de EPM reportados se corresponden con enfermedad aguda, mostrando hemorragia severa y lesiones principalmente en la médula espinal y en las meninges (Boy et al., 1990; Dubey et al., 2001). En el presente estudio, las lesiones microscópicas consistieron en pequeños y múltiples focos de hemorragias e inflamación crónica en el tálamo, el metencéfalo y la médula espinal. Además, la presencia de S. neurona en estos tejidos se identificó mediante inmunohistoquímica y PCR-RFLP, lo que se indica para confirmar la etiología de EPM (Boy et al., 1990; Dubey et al., 2001; Hamir et al., 1993). Lamentablemente, no se conservaron muestras de suero de este animal para realizar estudios serológicos que complementaran el diagnóstico.

Diferentes cepas o aislamientos de S. neurona evidencian diferentes antígenos de superficie que podrían ser causas de diferencias en el desarrollo de los casos clínicos, como así también influir en el diagnóstico serológico y molecular (Howe et al., 2008). Teniendo esto en cuenta, se llevará a cabo una caracterización molecular adicional de S. neurona en las muestras de este caso, así como de otras que contengan ADN de S. neurona, para identificar las variantes genotípicas circulantes y ampliar la comprensión de aspectos epidemiológicos de la EPM en Argentina.

La detección previa de anticuerpos contra S. neurona en caballos, la abundancia de comadrejas (Didelphis albiventris) en el medio y la confirmación específica en este caso, sugieren que la enfermedad puede estar muy extendida en Argentina. Esta es la primera descripción de un caso de EPM en Argentina, confirmado mediante estudios histopatológicos, inmunohistoquímicos y moleculares. La confirmación del diagnóstico de esta enfermedad en nuestro medio sirve de alerta a los veterinarios para que incluyan a la EPM entre los diagnósticos diferenciales ante trastornos neurológicos en equinos.

Los autores agradecen al Dr. J.P. Dubey y al Dr. D. Howe por proporcionar el anticuerpo primario anti S. neurona y el ADN control de S. neurona, respectivamente.

Los autores declaran que no existe conflicto de intereses, incluyendo entre estos últimos las relaciones financieras, personales o de otro tipo con otras personas u organizaciones que pudieran influir de manera inapropiada en el trabajo.