INTRODUCCIÓN

Durante las últimas dos décadas, se ha informado mediante evidencias de la implicación de los radicales libres en una amplia variedad de enfermedades humanas (Jamshidi-Kia et al., 2020). En las células humanas, la principal molécula generadora de radicales libres es la del oxígeno, el cual al entrar a al organismo interviene en una serie de reacciones de oxido-reducción complejas en las que se producen algunas especies derivadas de este que son reactivas, denominadas especies reactivas del oxígeno (ERO). Si la generación de ERO es alta y supera la eficacia de la defensa antioxidante del organismo, surge una condición llamada estrés oxidativo (Reyes et al., 2011) que puede conducir a daños en las células mutación de los genes y carcinogénesis (Alkadi & Ifeany 2018; Jamshidi-Kia et al., 2020) y provocar la incidencia de diversas enfermedades, entre ellas la esclerosis lateral amiotrófica, las enfermedades de Parkinson y Alzheimer (Cenini et al., 2019). Por lo que se hace necesario el consumo de compuestos antioxidantes para retardar o inhibir la oxidación de sustratos susceptibles a las ERO (Reyes et al 2011; Coronado et al., 2015).

Las investigaciones en la química de productos naturales, en la búsqueda de compuestos eficaces y no tóxicos con actividad antioxidante, se han convertido en una tendencia en los últimos años (Rao et al., 2015; Jamshidi-Kia et al., 2020).

Adicionalmente, la estrategia de la Organización Mundial de la Salud (para el período 2014-2023) (WHO, 2013), promueve la utilización de la medicina tradicional y complementaria (T&CM), mediante políticas que permitan a las personas acceder a la T&CM de manera segura y eficaz, tomando como base la investigación científica, para la incorporación de productos naturales en los sistemas de salud que cumplan con los estándares de calidad establecidos.

La especie vegetal Bougainvillea glabra Choisy es endémica de América del Sur y está muy extendida en todo el mundo (Abarca & Petricevich, 2018). En la medicina tradicional, a las brácteas se le han atribuidos varias acciones, entre ellas para el tratamiento de enfermedades respiratorias (asma) (Alonso-Castro et al., 2017), capacidad antibacteriana (Enciso-Diaz et al., 2012), y actividad antioxidante (Naidu et al., 2016; Abarca & Petricevich, 2018).

Los análisis fitoquímicos de diferentes partes de B. glabra Choisy han dado a conocer que contiene 105 diferentes compuestos químicos, los cuales pertenecen a las siguientes familias de productos naturales: alcaloides, taninos, fenoles, flavonoides, betacianinas, terpenoides, glucósidos y aceites esenciales (Heuer et al., 1994; Saleem et al., 2021).

Aunque B. glabra se reporta dentro de las plantas que presentan actividad antioxidante, dicha propiedad biológica no está definida en las brácteas de diferentes colores de la especie. Por tal motivo, se determinó la relación existente entre el contenido de fenoles totales, flavonoides y la capacidad antioxidante de las brácteas de B. glabra de color naranja y morada.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se recolectaron muestras representativas de las brácteas de B. glabra, de colores naranja y morada, en las localidades de Machala (3° 28' 60,64'' S; 79° 89' 87,20'' W), Pasaje (3° 33' 89,07'' S; 79° 81' 45,99'' W) y Piñas (3° 68' 73,03'' S; 79° 61' 09,05'' W) de la provincia de El Oro, Ecuador. Luego, se sometieron al proceso de lavado y secado a temperatura ambiente por 48 horas; posteriormente, se colocaron en una estufa (SNB400, Memmert), por 48 horas a 40 ± 2°C. Finalmente, se molieron hasta obtener un polvo fino de tamaño de partícula ≤ 1 mm.

Preparación de los extractos secos

10 g de las muestras secas y molidas de las brácteas de B. glabra, naranjas y moradas, se mezclaron con 100 mL de etanol (50 %) y se sometieron a sonicación, utilizando un baño ultrasónico (ULTRASONIC BATH 5,7 L, Fischer Scientific). Posteriormente, los extractos se filtraron y se concentraron hasta sequedad en un rotoevaporador (HEIDOLPH LABOROTA 4001 efficient) acoplado a un criostato (LAUDA/ALPHA RA-8) y a una bomba de vacío (VACUUBRAND PC 600, Alemania). Finalmente, se almacenaron los extractos secos a 4°C y protegidos de la luz hasta su posterior análisis.

Cuantificación del contenido de fenoles

La cuantificación de fenoles se realizó por el método de Folin-Ciocalteu. Para la curva de calibración se partió de una disolución de ácido gálico (EAG) (Sigma Aldrich) como estándar, a una concentración de 10 mg/mL, para preparar seis soluciones patrones de concentraciones (0,1-0,9) mg/mL. De cada dilución se tomaron 20 mL, a los cuales se le añadió 1 mL de disolución del reactivo Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, Alemania) (0,2 mol/L) y 180 mL de agua destilada. Se agitó y se esperó 5 minutos. Se adicionaron, por último, 800 mL de carbonato de sodio al 7,5 %, se agitó y se dejó reposar por 2 horas. Se midieron las absorbancias a las disoluciones de ácido gálico en un espectrofotómetro (Evolution 201, Thermo Scientific), a 765 nm. Se utilizó un blanco que se preparó bajo las mismas condiciones. El ensayo se realizó por triplicado. Se preparó una disolución al 1 % del extracto seco (ES) en metanol, de allí se tomaron 20 mL y se procedió de la misma manera antes descrita. Los datos se expresaron como miligramos equivalentes de ácido gálico por gramo de ES (mg de EAG/g ES).

Cuantificación de flavonoides

Se siguió la metodología propuesta por Lin & Tang (2007), con algunas modificaciones. Se utilizó como estándar quercetina de 1 mg/mL (Sigma Aldrich) y desde allí se prepararon diluciones en el rango (25 y 125 mg/mL) para la curva de calibración, por triplicado. Se transfirieron 0,5 mL de cada disolución de quercetina y se mezcló con 1,5 mL de etanol 95 % a un tubo de ensayo de capacidad de 5 mL. Luego, se añadió 0,1 mL de disolución acuosa de cloruro de aluminio (AlCl3) al 10 %, 0,1 mL de acetato de potasio 1 mol/L y 2,8 mL de agua destilada. Se dejó reposar a temperatura ambiente durante 40 min, para luego proceder a la lectura en el espectrofotómetro, estableciendo una longitud de onda de 415 nm, frente al blanco que se preparó bajo las mismas condiciones de los patrones. Para el ensayo se prepararon disoluciones acuosas (1 % m/v) de los ES de las muestras, naranja y morada,

respectivamente. De allí se tomaron 0,5 mL y se procedió de la misma manera antes descrita para la curva de calibración. El contenido total de flavonoides se determinó por triplicado y los datos se expresaron como miligramos equivalentes de quercetina (mg EQ/g de ES).

Determinación de la actividad antioxidante

La actividad antioxidante se evaluó usando el radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH.). Se siguió la metodología de Brand-Williams et al. (1995), con modificaciones. Para ello se preparó una disolución de DPPH. en metanol 0,1 mmol/L protegido de la luz. Se prepararon disoluciones acuosas al 1% (m/v) de ambos ES y se diluyeron a varias concentraciones (0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5) mg/mL. Luego, se transfirió 0,5 mL de cada solución por separado en un tubo de ensayo y se agregaron 1,5 mL de la solución metanólica de DPPH., se agitó y almacenó en la oscuridad por 30 min. Se consideró un grupo control por cada réplica, utilizando la disolución de DPPH., para proceder a la lectura en un espectrofotómetro, estableciendo una longitud de onda 516 nm. El ensayo se realizó por triplicado y el porcentaje secuestro del radical libre DPPH. se determinó mediante la siguiente fórmula:

Con los porcentajes de secuestro de DPPH. obtenidos y las concentraciones de cada solución de muestra ensayada, se obtuvo por regresión lineal una ecuación que permitió obtener la concentración media inhibitoria (IC50).

Análisis estadístico

Todos los resultados fueron analizados usando el programa estadístico STATGRAPHICS CENTURION XVI.II para realizar la prueba ANOVA (p<0,05) para muestras independientes y el coeficiente de correlación de Pearson para relacionar el contenido de fenoles totales, flavonoides y la capacidad antioxidante de las brácteas de B. glabra.

RESULTADOS

Los resultados de la cuantificación de fenoles por el método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteu muestran que se obtuvo una linealidad aceptable, con un R2= 0,996 en la ecuación de la recta. La concentración promedio de fenoles en las brácteas naranjas fue 129,61 ± 0,02 mg EAG/g de ES y en las brácteas moradas 79,91 ± 0,01 mg EAG/g de ES (Tabla 1). Se constataron diferencias estadísticamente significativas (p<0,05), existiendo mayor contenido de fenoles totales en las brácteas naranjas, en comparación con las brácteas moradas.

Para la determinación cuantitativa de flavonoides se obtuvo una curva de calibración con linealidad aceptable (R2=0,99) de la ecuación de la recta. En la Tabla 1 se pueden observar los resultados de flavonoides obtenidos para las brácteas de B. glabra. Para las brácteas naranjas fueron 40,10 ± 2,47 mg EQ/g ES y para las brácteas moradas 9,06 ± 0,70 mg EQ/g ES. Existe una diferencia estadísticamente significativa (p<0,05) en el contenido flavonoides, siendo mayor en las brácteas naranjas, en comparación con las de color morado.

Las disoluciones del extracto seco de las brácteas naranjas lograron inhibir el 50 % del radical libre a una menor concentración (37 mg/mL) que las brácteas moradas (270 mg/mL) (Tabla 1).

Al correlacionar la cantidad de fenoles totales con el contenido de flavonoides en las brácteas de B. glabra, se obtuvo un coeficiente de correlación de r=0,995, (Tabla 2) denotándose que existe una correlación positiva fuerte, el análisis nos indica que la cantidad de fenoles totales y flavonoides están fuertemente correlacionados.

Del análisis de correlación entre fenoles vs actividad antioxidante (CI50) y flavonoides vs actividad antioxidante (CI50) se obtuvieron coeficientes de correlación r= -0,9995 y r= -0,9948, respectivamente, (Tabla 2) denotando una correlación negativa en ambos casos, estos indica que en la medida que aumenta la cantidad de fenoles y flavonoides, disminuye el IC50.

DISCUSIÓN

Hay pocos estudios realizados en la cuantificación de fenoles totales en las brácteas de las variedades morada y naranja de B. glabra y partiendo de un extracto hidroalcohólico. Según lo reportado por Orozco et al. (2018) para las brácteas moradas de la especie Bougainvillea spectabilis, el contenido de fenoles fue 6,78 mg EAG/g ES.

El método de extracción asistida por ultrasonido, utilizado para la obtención de los extractos hidroalcohólicos, resulta de gran efectividad, ya que genera mayor interacción entre el disolvente y la droga. Colateralmente, las ondas cavitacionales producidas por el equipo provocan la ruptura de las células, lo que favorece en el rendimiento de extracción de los metabolitos secundarios (Vinatoru, 2001).

En otro estudio realizado por Villanueva et al. (2017) determinaron la concentración de fenoles en extractos etanólicos al 50 % de flores y brácteas de variedad rosada de B. xbuttiana, obteniendo 320 mg EAG/g ES. Dichos resultados son superiores a lo obtenido en esta investigación, tanto para la variedad naranja y morada.

Con estos valores se puede apreciar, que el contenido de fenoles en las brácteas de la especie B. glabra fue mayor a otras especies del mismo género, pero fue menor a la B. xbuttiana.

El método más empleado comúnmente para cuantificar flavonoides se basa en la determinación espectrofotométrica del complejo (flavonoide-AlCl3) que se forma entre los hidroxilos catecólicos (posición 3 y 5 del anillo A u otras variantes tanto en el anillo A como en el B) o del hidroxilo en 5 con el grupo carbonilo 4. Esto sucede principalmente en flavonoides del tipo flavona y flavonoles, el cual proporciona un desplazamiento batocrómico y un efecto hipercrómico. Este método es usado comúnmente para cuantificar flavonoides del tipo O-glicósidos sin descartar que la técnica ha sido utilizada indiscriminadamente para cuantificar flavonoides del tipo C-glicósidos (Dantas et al., 2012; Ramos et al., 2017).

Al comparar el contenido de flavonoides en este estudio con lo reportado por Markandan et al. (2016), ellos obtuvieron valores menores (2,49 mg EQ/g ES) en las brácteas moradas B. glabra tomadas de un jardín, en Malasia. Esto puede deberse a que utilizaron metanol al 50 % como disolvente, y la extracción no fue asistida por ultrasonido. Además, considerando que los factores extrínsecos (clima, suelo y temperatura) e intrínsecos de la planta (estado fenológico) fueron diferentes.

A pesar de los múltiples usos farmacológicos de la B. glabra, hay poca información sobre la actividad antioxidante de las brácteas de las variedades naranja y morada, procesadas de la forma antes descrita. Islam et al. (2016) y Shalini et al. (2018) evaluaron la capacidad antioxidante mediante el método de DPPH. de las brácteas de B. glabra (morada) en un extracto acuoso y etanólico, obteniendo el CI50 a 135,73 mg/mL y 75 mg/mL, respectivamente, valores menores que los obtenidos en las brácteas moradas analizadas en esta investigación.

Los resultados de correlación negativa, significativamente alta, entre flavonoides y fenoles y actividad antioxidante (Tabla 2) infieren que la capacidad antioxidante puede atribuirse a estos metabolitos secundarios. Por lo que las muestras con mayores contenidos de fenoles totales y flavonoides requieren de menores concentraciones de los extractos de las brácteas de B. glabra, de colores morado y naranja, para inhibir el 50 % del radical libre DPPH.

CONCLUSIÓN

Este es el primer estudio en el cual se compara la relación existente entre el contenido de fenoles totales, flavonoides y la capacidad antioxidante en las brácteas naranjas y moradas de Bougainvillea glabra Choisy. Las muestras de brácteas color naranja tuvieron las mayores concentraciones de compuestos fenólicos y de flavonoides. Adicionalmente, las dos muestras de brácteas (morada y naranja) pueden ser utilizadas como antioxidantes naturales, siendo la de variedad naranja la más activa.

AGRADECIMIENTO

A la Universidad Técnica de Machala de la Provincia de el Oro, Ecuador, a través del departamento de Investigación, por su patrocinio financiero, mediante el proyecto semillero LOBOCOM.

Agradecimientos

A la Universidad Técnica de Machala de la Provincia de el Oro, Ecuador, a través del departamento de Investigación, por su patrocinio financiero, mediante el proyecto semillero LOBOCOM.

LISTA DE REFERENCIAS

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