Introducción

Los organismos bentónicos cumplen un rol fundamental en el equilibrio natural del ecosistema y constituyen eslabones estratégicos en las tramas tróficas marinas. Los nematodos marinos de vida libre son el principal componente de la meiofauna bentónica (Netto et al., 2005; Gambi et al., 2010). Su poca movilidad y su modo de vida intersticial hacen que cualquier cambio en las condiciones ambientales genere un cambio en la estructura y composición de la comunidad (Heip et al., 1985). Sus ciclos de vida van desde los 2,5 días a 18 meses, lo que permite que la respuesta a un disturbio y también su recuperación luego de finalizado el mismo, pueda verse reflejada rápidamente (Vincx & Heip, 1991). Por sus características, los nematodos han sido utilizados a nivel mundial para evaluar diferentes tipos de disturbios en la naturaleza: vertido de efluentes domésticos (Burgess et al., 2005; Liu et al., 2011), presencia de metales pesados o enriquecimiento orgánico (Moreno et al., 2009), derrame de hidrocarburos (Ansari & Ingole, 2002), contaminación en puertos (Moreno et al., 2008; Losi et al., 2013) y presencia de TBT (Quang et al., 2018). El uso de nematodos para estudios ecotoxicológicos ha crecido en las últimas dos décadas (Hägerbäumer et al., 2015). Muchos de estos estudios se realizaron en condiciones experimentales de laboratorio (Schratzberger et al., 2002; Mahmoudi et al., 2005; Armenteros et al., 2010; Boufahja et al., 2011; Kandratavicius et al., 2018) para luego extrapolar los resultados a la naturaleza ante potenciales impactos antrópicos. El problema inicial al que se enfrentan este tipo de experimentos es al “efecto del microcosmos”, el cual es producido por las condiciones experimentales ensayadas en el laboratorio. Algunos autores mencionan el riesgo que los experimentos de larga duración pueden tener sobre la biota, enmascarando los efectos del tipo de disturbio bajo estudio (Boufahja et al., 2011). Sin embargo, se ha visto que para los nematodos este efecto es variable, dependiendo de la historia previa de contaminación a la cual los organismos estuvieron sometidos en la naturaleza (Mahmoudi et al., 2005).

Así, en el marco de un proyecto cuyo objetivo general fue analizar la respuesta de las comunidades bentónicas en sedimentos expuestos experimentalmente a un evento de contaminación con petróleo, se planteó como un objetivo particular comparar la abundancia y distribución vertical de la comunidad de nematodos marinos de vida libre en condiciones in situ, respecto de aquella que estuvo sometida a ciertas condiciones experimentales en el laboratorio en ausencia del contaminante (ex situ). A su vez, se analizó si hubo diferencias significativas en el efecto del microcosmos en los sedimentos con y sin historia previa de contaminación.

Materiales y métodos

Área de Estudio

El golfo San Jorge (GSJ) se encuentra ubicado en la Patagonia Argentina. Es el de mayor tamaño de la costa argentina con unos 39.000 km² de superficie. Su límite exterior va desde Cabo dos Bahías (44°55’S; 65°32’O) hasta Cabo Tres Picos (47°06’S; 65°52’O) (Fig. 1). Su alta diversidad biológica lo convierte en una zona de gran importancia tanto para la explotación de especies de interés comercial como para la conservación.

Figura 1.
Sitios de muestreo localizados en el golfo San Jorge

Figura 2.
Sitios de muestreo: a) Restinga Alí; b) Playa Alsina; c) Playa Gravina

Se seleccionaron 3 sitios en el GSJ: Playa Alsina (PA), Restinga Alí (RA) y Punta Gravina (PG) (Figs. 1 y 2). Los sitios se eligieron en función del conocimiento previo de acuerdo al grado de contaminación (RA > PA > PG). Particularmente, en el GSJ se ubican dos centros urbanos de gran importancia: Comodoro Rivadavia y Caleta Olivia. Además de la contaminación antrópica que generan estas ciudades, ambas tienen la particularidad de albergar Terminales Petroleras: Caleta Córdova (justo al norte de Comodoro Rivadavia) y Caleta Olivia. En éstas el petróleo es almacenado para luego ser bombeado a los buques tanques por medio de monoboyas. En este sentido, se eligió Restinga Alí como el sitio más contaminado debido al aporte de la contaminación antrópica proveniente de Comodoro Rivadavia y a su cercanía a Caleta Córdova. Playa Alsina fue elegida como el sitio con contaminación intermedia debido a que se encuentra ubicada en el límite norte de la provincia de Santa Cruz a una distancia intermedia entre Comodoro Rivadavia y Caleta Olivia. Esta playa, si bien es muy concurrida durante la temporada estival por los habitantes de la zona, no tiene ningún centro urbano en su cercanía. Finalmente, Punta Gravina se eligió como el sitio no contaminado debido a que se encuentra ubicada dentro del Parque Interjurisdiccional Marino Costero Patagonia Austral, alejado de los centros urbanos mencionados anteriormente. En cuanto a sus características sedimentarias, los sitios seleccionados corresponden a intermareales protegidos constituidos principalmente por arena (Fig. 2a, b y c).

Muestreo y condiciones experimentales

En febrero de 2018 se colectaron en cada sitio 4 muestras de sedimento del intermareal inferior, utilizando cilindros de PVC de 16 cm (diámetro) x 20 cm (longitud). A cada uno se le colocó una malla por debajo para permitir el flujo de agua de mar a través de los sedimentos durante la incubación en el laboratorio. Para ello, cada cilindro se colocó en un acuario individual (10 litros) con aire y agua de mar del sitio (colectada al momento del muestreo) que contenía en el fondo 3 cm de sedimento inerte (tratamiento ex situ). Las incubaciones fueron realizadas durante 45 días a temperatura (11-13 °C), luz (fotoperiodo 12/12) y aireación controladas. Durante ese periodo, se realizaron cada 2 días las siguientes mediciones con sonda multiparámetro: pH, salinidad, oxígeno disuelto y temperatura. Al finalizar, se colectaron 4 muestras de sedimento (de igual dimensión) en cada sitio (in situ) con el fin de comparar la abundancia de organismos con aquella registrada en condiciones ex situ.

Análisis de las muestras

Las columnas sedimentarias de ambos tratamientos (in situ y ex situ) fueron fraccionadas en tres secciones: 0-2 (capa 1), 2-4 (capa 2) y 4-10 cm (capa 3). De cada capa se obtuvieron muestras para la determinación de la granulometría, el porcentaje de materia orgánica y la abundancia de nematodos marinos de vida libre.

Las muestras para granulometría y materia orgánica se colectaron del anillo externo de cada capa. Para ello se obtuvieron dos muestras compuestas, que fueron preservadas en freezer (-20°C) hasta el momento de su procesamiento.

El análisis granulométrico se realizó utilizando un analizador de tamaño de partículas Mastersizer 2000 (Sperazza et al., 2004). Las medidas se tomaron en el rango entre 0,01 y 10.000 µm., bajo las siguientes condiciones: índice de refracción de partículas 1,5, índice de absorción de partículas 0,9, índice de refracción de agua 1, 33 y el modelo Propósito General. Cada muestra fue sonicada por 2 minutos para separar las partículas y se utilizó una velocidad de bombeo de 1500 rpm.

Para la determinación del porcentaje de materia orgánica en los sedimentos, las muestras se secaron en estufa a 100°C por 24 hs (peso seco). Luego se homogeneizó el sedimento y se colectó una submuestra de aproximadamente 2 gramos, la cual se calcinó en mufla por 4 horas a 450°C (peso calcinado). En base a la diferencia entre el peso seco y el peso calcinado se calculó el porcentaje de materia orgánica (%MO).

Las muestras biológicas se colectaron en el centro de cada capa (para evitar el efecto de borde) con un corer de 2,8 cm de diámetro interno. Inmediatamente fueron fijadas en formol al 5% preparado con agua de mar filtrada y teñido con colorante Rosa de Bengala. La extracción de los nematodos del sedimento se realizó utilizando el método de decantación con Ludox^TM. Las muestras se pasan por dos tamices, uno de 500 µm (que retiene la macrofauna) sobre otro de 62 µm (que retiene la meiofauna). Lo retenido en este último tamiz se coloca en un vaso de precipitado al cual se le agrega Ludox^TM y se agita hasta obtener toda la muestra en suspensión. Luego de 40 minutos, el sedimento decanta y la meiofauna (y por lo tanto los nematodos) queda retenida en el sobrenadante. Este sobrenadante se tamiza y el tamiz se lava en cápsulas de Petri con fijador (Ditlevsen, 1911). La operación con Ludox^TM se repite 5 veces con cada réplica. Posteriormente, las cápsulas se colocan en un desecador para que los organismos queden embebidos en glicerina pura. La cuantificación de los nematodos se realizó bajo lupa estereoscópica. En el caso de las réplicas que tenían hasta 300 individuos se realizó el conteo total. Para las réplicas con más organismos, se tomaron alícuotas en las cuales se contó el número total de individuos. Posteriormente, se promediaron estos valores y se extrapoló el resultado al volumen total de la réplica.

Análisis estadísticos

Se evaluaron las diferencias registradas en las fracciones de sedimento, el contenido de materia orgánica y la abundancia de nematodos entre las condiciones in situ y ex situ por sitio y capa. Estas diferencias fueron testeadas mediante un análisis de la varianza no paramétrico (Kruskal-Wallis) (InfoStat) de cada sitio por separado. Este análisis se realizó con los datos sin transformar, considerando 2 factores: tratamiento (2 niveles) y capa (3 niveles). A continuación, se aplicaron los contrastes SNK para todas las combinaciones posibles.

Resultados

Todas las variables ambientales registradas en el agua de mar de los experimentos ex situ se mantuvieron estables a lo largo del mismo y sus valores fueron similares a aquellos registrados en la naturaleza (in situ) (Tabla 1).

El análisis granulométrico mostró para los 3 sitios un predominio de la fracción arena (muy fina, fina y media) representada en todos los casos por más del 80% del total (Tabla 2).

En RA las diferencias registradas entre tratamientos (in situ y ex situ) por capa fueron no significativas en todos los casos (p>0,05) (Tabla 2). A su vez, RA fue el sitio con mayor proporción de sedimento fino (limo y arcilla). En PA todas las fracciones de sedimento excepto la “arena fina”, presentaron diferencias significativas entre tratamientos por capa. La fracción fina (arcilla + limo) presentó diferencias, donde el tratamiento in situ tuvo para las 3 capas de sedimento un porcentaje mayor que en las condiciones ex situ, las cuales fueron significativas sólo para las capas 2 y 3 (p<0,05) (Tabla 2). Por su parte, PG no mostró diferencias significativas en las fracciones “limo grueso” y “arena fina” entre tratamientos por capa mientras que sí hubo diferencias significativas entre tratamientos (p<0,05) en las fracciones “arena muy fina” (capas 1 y 2), “arena media” (capas 1 y 3) y “arena gruesa” (capa 1). Al igual que en PA, la fracción fina tuvo un porcentaje mayor en el tratamiento in situ que en el ex situ pero las diferencias sólo fueron significativas en la capa 2 (p<0,05) (Tabla 2).

El porcentaje de materia orgánica registrado en los sedimentos in situ fue significativamente mayor que en los sedimentos ex situ en todos los sitios (p<0,05) (Fig. 3, Tabla 2). Contrariamente, las diferencias registradas por capa para un mismo sitio y tratamiento fueron no significativas en todos los casos (p>0,05). Al comparar dentro de cada sitio las diferencias registradas para la misma capa entre tratamientos, se observó que para RA estas diferencias fueron significativas (p<0,05) en las capas 2 y 3, para PA solo en la capa 2 y para PG, en la capa 1 (Fig. 3).

En base a los análisis estadísticos realizados con los datos de abundancia registrados en los sedimentos in situ y ex situ pudieron observarse diferentes patrones. En los 3 sitios hubo diferencias significativas entre tratamientos (p<0,05). Particularmente, en los sitios RA y PA la abundancia de nematodos se incrementó en las tres capas en el tratamiento ex situ respecto del in situ, mientras que en PG sucedió en forma inversa. Comparando los porcentajes de estas variaciones, se observó que RA y PA presentaron, teniendo en cuenta las 3 capas, más de un 300% y 600% de incremento, respectivamente. Por su parte, si bien en PG se registró una disminución de la abundancia en condiciones ex situ, ésta fue menor al 40% (Tabla 3). Dentro de cada sitio, cada tratamiento presentó la mayor abundancia promedio de nematodos en la capa 3 (Tabla 3, Fig. 3). En RA y PA, las muestras in situ tuvieron una abundancia menor que las ex situ. Sin embargo, esta diferencia fue sólo significativa en las capas 1 y 3 (p<0,05). Por el contrario, en PG las muestras in situ tuvieron mayor abundancia que las ex situ pero esta diferencia solo fue significativa en la capa 1 (p<0,05) (Tabla 3, Fig. 3).

Tabla 3.

Valores de abundancia de nematodos (indx 10cm-2) por sitio (RA: Restinga Alí, PA: Playa Alsina; PG: Punta Gravina), capa y tratamiento (in situ: IN y ex situ: EX), ∆ (%): Porcentaje de variación de la abundancia entre los tratamientos

Figura 3.
Abundancia de nematodos (columnas) y porcentaje de materia orgánica (líneas) para cada sitio por capa. Las diferencias significativas para un mismo sitio y capa están señaladas con asterisco (abundancia de nematodos) o triángulos (porcentaje de materia orgánica), RA: Restinga Alí; PA: Playa Alsina; PG: Punta Gravina; IN: in situ; EX: ex situ

Discusión

Los resultados de este trabajo mostraron un efecto de las condiciones experimentales ensayadas en el laboratorio sobre la abundancia de nematodos marinos de vida libre indicando un posible efecto del microcosmos. Si bien a lo largo de los 45 días de incubación en el laboratorio, las condiciones de luz y temperatura en la naturaleza variaron, el fotoperiodo y la temperatura promedio fueron 13/11 y 17°C, respectivamente. Por lo tanto, las condiciones ambientales entre ambos tratamientos (in situ y ex situ) fueron similares, lo que permitió una mejor comparación entre los datos biológicos registrados por sitio y capa de sedimento.

Respecto de las variables físicas, el análisis granulométrico confirmó que los tres sitios presentan características similares en cuanto al tamaño medio de partícula. La fracción fina, por su parte, fue mayor en RA y similar en PA y PG. Se ha visto que para los nematodos una pequeña variación en la composición sedimentaria puede acarrear diferencias en la estructura comunitaria (Semprucci et al., 2010). Incluso entre sedimentos que tengan igual tamaño medio de partícula, si al considerar todas las fracciones sedimentarias posibles existen diferencias, éstas pueden afectar a los nematodos (Semprucci et al., 2010). En este estudio, RA fue el único sitio que no presentó diferencias significativas en el análisis granulométrico de los sedimentos in situ y ex situ, y sin embargo sí tuvo diferencias significativas en la abundancia de nematodos registrada en la capa 3. Particularmente, las diferencias mencionadas en el trabajo de Semprucci et al. (2010) se han registrado a nivel de la estructura comunitaria y no de la abundancia. Esto explicaría por qué en nuestro trabajo se registraron diferencias en abundancia a pesar de que la composición granulométrica fue similar entre ambos tratamientos.

Los valores de materia orgánica registrados en este estudio fueron bajos en todos los sitios, tratamientos y capas (<1,19%). Tanto en las condiciones in situ como en las ex situ, los valores de oxígeno disuelto registrados en el agua de mar indicaron que la calidad de la misma era muy buena (Rosenberg et al., 1991). Por lo tanto, es válido inferir que la oxigenación de los sedimentos fue adecuada (lo cual se comprobó al hacer los cortes de las columnas sedimentarias y no encontrar zonas anóxicas). Ante esta condición, la degradación de la materia orgánica se ve favorecida por las bacterias aeróbicas que habitan en los sedimentos (Jessen et al., 2017). Particularmente, el porcentaje de materia orgánica registrado in situ fue mayor al ex situ en todos los casos. En el laboratorio las muestras fueron incubadas en sistemas de circulación cerrada por lo que no hubo ingreso de materia orgánica, pero sí consumo. Dado que los nematodos marinos son los alimentadores de depósito más abundantes dentro del meiobentos, juegan un rol clave en la transformación de la materia orgánica en sedimentos marinos (Armenteros et al., 2010 y citas allí). Esto podría explicar la mayor abundancia de nematodos que fue registrada en algunos sitios en condiciones ex situ y la disminución del porcentaje de materia orgánica en los mismos.

En ambos tratamientos la abundancia de nematodos para los tres sitios fue menor en las capas superiores (hasta los 4 cm de profundidad) y mayor en profundidad (de 4 a 10 cm). Si bien hay que tener en cuenta que las capas 1 y 2 abarcan cada una 2 cm de altura mientras que la capa 3 es de 6 cm, la abundancia de nematodos en esta última era esperable que fuera equivalente a la registrada en de las dos primeras, ya que estos organismos suelen presentar una mayor abundancia en los primeros 5 cm de profundidad de la columna sedimentaria decreciendo abruptamente en profundidad. El hecho de que el patrón de distribución vertical encontrado en ambos tratamientos fue similar en todos los sitios, puede resultar contradictorio si se tienen en cuenta las condiciones ambientales diferentes a las que estaban sometidas las muestras en cada caso. Las muestras del tratamiento in situ fueron colectadas al momento de descubrirse el intermareal inferior, mientras que las del tratamiento ex situ estuvieron permanentemente cubiertas de agua en el laboratorio. Estas similitudes podrían deberse a que en ambos casos las columnas de sedimento fueron fraccionadas luego de un tiempo de ser colectadas (en el caso de las in situ) o retiradas del experimento (en las ex situ), lo que pudo originar una migración vertical de los organismos hacia las zonas más profundas. Esta migración podría deberse a que los nematodos siguieron activamente la tabla de agua mientras descendía. Además, lo que puede haber sucedido es una migración pasiva de los organismos debido al efecto de arrastre que pueda haber tenido el agua al descender. Se han observado movimientos verticales de nematodos en la naturaleza de 5cm en menos de 30 minutos (Maria et al., 2012). Un estudio posterior de las especies de nematodos podrá ayudar a interpretar si los individuos presentes en las capas inferiores forman parte de la comunidad superficial o es una comunidad diferente que vive adaptada a esa profundidad.

La comparación de las playas estudiadas mostró que RA y PA presentaron un aumento en la abundancia de nematodos en las condiciones experimentales ensayadas en el laboratorio mientras que PG tuvo el comportamiento inverso. Podemos inferir que la fauna de sitios contaminados, ya adaptada a condiciones de estrés, es más tolerante al estrés inicial del paso a condiciones experimentales e incluso llega a verse favorecida por las condiciones más estables del laboratorio respecto de las de la naturaleza. Por el contrario, la fauna de sitios sin signos de contaminación, como PG, podría sufrir el estrés en mayor medida y, por lo tanto, verse perjudicada en condiciones experimentales de laboratorio.

Conclusión

En este trabajo se registró un efecto de las condiciones experimentales ensayadas en el laboratorio (“efecto del microcosmos”). Las diferencias encontradas radican en que, por un lado, las condiciones de aire y temperatura son más variables en la naturaleza que en el laboratorio. Por otro lado, al tratarse de muestras colectadas en el intermareal inferior de las playas, en la naturaleza éstas se encontrarían sujetas a los efectos de las mareas, mientras que en el laboratorio fueron incubadas en sistemas de circulación cerrada cubiertas continuamente por agua. La fauna proveniente de sitios muy contaminados (RA) o moderadamente contaminados (PA), se vio favorecida en las condiciones experimentales ensayadas en el laboratorio. Por el contrario, la fauna proveniente del sitio sin signos de contaminación (PG), presentó una disminución en la abundancia de nematodos bajo dichas condiciones. Si bien el efecto del microcosmos fue evidente en los tres sitios, su magnitud no fue tal que impida evidenciar luego el efecto a evaluar en el caso de un experimento de ecotoxicología. Se prevé realizar la identificación de organismos bioindicadores de enriquecimiento orgánico, lo cual permitirá contar con una herramienta en futuros ensayos ecotoxicológicos con petróleo o algún otro contaminante orgánico, o bien en la caracterización de ambientes perturbados.

Agradecimientos

Las autoras agradecen a Marcos Franco y Ornella Romanut por su colaboración en la preparación y realización de las campañas. También a Javier Tolosano, director del Instituto de Desarrollo Costero Dr. Héctor Zaixso de la UNPSJB y a su equipo, y a Matías Soriano de Bahía Bustamante, por brindarnos las instalaciones para el procesamiento de las muestras.

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